CN102597240A - 真菌丝氨酸蛋白酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其包含具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列。丝氨酸蛋白酶可获自锐顶镰孢菌，更优选获自保藏菌株CBS 124084。本发明还公开了编码所述蛋白酶的核酸序列，例如包含核苷酸序列SEQ ID NO：12、保藏于保藏号DSM 22208的大肠杆菌RF7803中的质粒pALK2530和包含全长基因SEQ ID NO：13、保藏于保藏号DSM 22209的大肠杆菌RF7879中的质粒pALK2531；以及真菌宿主，例如木霉属。所述蛋白酶可用作应用于洗涤剂组合物和用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食品或饲料，或者用于包括改变、降解或去除蛋白质物质的任何应用的酶制备物。

Description

真菌丝氨酸蛋白酶及其用途

发明领域

本发明涉及可用于各种应用，特别是洗衣洗涤剂和餐具洗涤剂的真菌丝氨酸蛋白酶。本发明涉及编码所述酶的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶的宿主细胞、包含所述酶的酶组合物以及用于制备这类组合物的方法。本发明还涉及所述酶或包含所述酶的组合物的各种用途。

背景

微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，并应用于各个工业部门，例如洗涤剂、食品、皮革、制药、诊断学、废物管理和银回收。微生物的胞外蛋白酶占全球工业用酶总销售的主要部分，超过三分之一(Cherry和Fidantsef，2003)。大约90％的商用蛋白酶是洗涤剂酶(Gupta等，2002)。主要是中性和碱性的大多数商用蛋白酶由属于芽孢杆菌属(Bacillus)的生物产生。

枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶或由芽孢杆菌属菌种产生的枯草杆菌蛋白酶构成工业用蛋白酶的最大亚类。这些酶作为洗涤剂的蛋白降低组分或添加剂在商业上具有重要性。目前在使用中的商用洗涤剂制品包含来源于芽孢杆菌属菌种的天然存在的碱性丝氨酸蛋白酶或者是来自芽孢杆菌属菌种的重组蛋白酶制备物(Maurer，2004)。通过位点定向诱变和/或随机诱变，已开发出催化效率得到改进和/或对温度、氧化剂和变化的洗涤条件具有更好稳定性的天然酶的变体。商用蛋白酶的实例为例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase

Novozymes，DK)、枯草杆菌蛋白酶309(Savinase

Novozymes，DK)、枯草杆菌蛋白酶147(Esperase

Novozymes，DK)、Purafect

(Genencor Inc.，USA)、Kannase

(Novozymes，DK)、PurafectOx，Properase(Genencor Inc.，USA)及BLAP S和X系列(Henkel，DE)。

也已从包括酵母和丝状真菌在内的真核生物中分离出若干碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)和编码这些酶的基因。美国专利号3,652,399和EP 519229(Takeda Chemical Industries，Ltd.，JP)公开了来自镰孢属(Fusarium)(无性态，有性型)或赤霉属(Gibberella)(有性态，无性型)、特别是来自镰孢属菌种S-19-5(ATCC 20192，IFO 8884)、亚麻尖镰孢(F.oxysporum f.sp.Lini)(IFO 5880)或小麦赤霉(G.saubinetti)(ATCC20193，IFO6608)的碱性蛋白酶用于洗涤剂和其它清洁剂组合物的配制中。美国专利号5,288,627(NovoNordisk A/S，DK)公开了包含分离的丝氨酸蛋白酶的内切蛋白酶制备物，所述丝氨酸蛋白酶显示与来源于尖镰孢(F.oxysporum)DSM 2672的蛋白酶的免疫化学同一性。WO88/03946和WO 89/04361(Novo Industri A/S，DK)公开了包含蛋白酶和脂肪酶的加酶洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物，其中真菌蛋白酶来源于镰孢属，特别是尖镰孢或腐皮镰孢(F.solani)。WO89/06270中公开了包含只对一个或两个特定氨基酸附近的肽键具有特异性的蛋白酶的洗涤剂添加剂。WO1994025583(NovoNordisk A/S，DK)公开了可来源于镰孢属菌种(特别是尖镰孢(DSM 2672)菌株)的有活性的胰蛋白酶样蛋白酶，和编码所述酶的DNA序列。来源于镰孢属菌种BLB(FERMBP-10493)的新的蛋白酶的氨基酸序列公开于WO 2006101140(SODXCo.Ltd，Nakamura)。同样，有研究报道了来自真菌菌种(例如念球属(Tritirachium)和耳霉属(Conidiobolus))的碱性蛋白酶(有关综述见Anwar和Saleemuddin，1998)。

亦从若干专利申请知晓真菌丝氨酸蛋白酶在不同应用中的用途。例如，WO 1992018599(NovoNordisk A/S)中公开了纤维素酶和蛋白酶(特别是来自镰孢属菌种DSM 2672的胰蛋白酶样蛋白酶)的组合作为洗涤剂添加剂或洗涤剂组合物。这类洗涤剂组合物还可包含可逆的蛋白酶抑制剂用于稳定WO 1992003529和WO 1992005239(NovoNordisk A/S)中公开的酶。用酶杂合体去除或漂白纤维素织物的染污或污渍的方法公开于WO 1997028243(NovoNordisk A/S)，所述酶杂合体包含催化活性氨基酸序列，如与包含纤维素结合结构域的氨基酸序列连接的蛋白酶。WO 1997002753(NovoNordisk A/S)公开了使用脂肪酶和优选为获自镰孢属的丝氨酸蛋白酶的蛋白酶温和清洗受污染的加工设备的方法。

由于节能需要，洗涤温度逐步下降。另外，当今消费者需求和无法耐受高温的合成纤维使用的增加改变了洗涤习惯，趋于采用低洗涤温度。EP 0290567和EP 0290569(Novo Nordisk A/S，DK)公开了来自放线菌(达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei))和真菌(马昆德拟青霉(Paecilomyces marquandii))微生物的低温碱性蛋白酶。

社会经济挑战和政府法规迫使洗涤剂行业考虑许多环境因素，不仅仅包括使用更温和的化学品，这可以较少的量使用，因此留下更少的环境废物痕迹，而且还包括节能的需要。洗涤剂酶，特别是蛋白酶，是洗涤剂组合物中的重要成分。通过降低洗涤温度而节能的要求和无法耐受高温的合成纤维使用的增加以及目前的生活方式已改变消费者的习惯趋于低洗涤温度，并且产生了对在低温下有效的新的酶的需求。

尽管已发表了许多专利公告、综述和文章的事实，其中在例如EP 0290567和EP 0290569(Novo Nordisk A/S，DK)中公开了来源于各种微生物的丝氨酸蛋白酶，例如来自放线菌(达松维尔拟诺卡氏菌)和真菌(马昆德拟青霉)微生物的低温碱性蛋白酶，但是仍强烈需要这样的备选丝氨酸蛋白酶，其特别在低、中温范围内适合并有效改变、降解和去除蛋白质物质，而且在性质极为不同的洗涤剂存在下是稳定的。

洗涤剂行业在使其新产品适应消费者的习惯和要求、适应新的纺织品和新的洗涤机的性质方面取得极大的进步。显然，在开发新的洗涤剂(特别是洗衣组合物和餐具洗涤组合物)时，必需满足各种不同的快速变化的需求。为了满足洗涤剂行业和政府法规的所有各不相同的要求，用于洗涤剂组合物的新的丝氨酸蛋白酶成分应不仅仅能够在宽的pH和温度范围内完成其任务，并且在各种条件(包括与各种不同洗涤剂组合的机械和化学干预)下保持稳定，而且还需要的是丝氨酸蛋白酶可大量生产，其可因易于从发酵液和菌丝体中分离而进行有成本效益的下游加工。

发明概述

本发明的目的是提供真菌来源的丝氨酸蛋白酶，其具有广泛的底物特异性、在宽的pH范围内具有活性，并具有宽广的最适温度，即在低温和中等温度两者下均起作用。用于洗衣洗涤剂和餐具洗涤剂的丝氨酸蛋白酶还必须在洗涤剂存在下稳定，或者与洗涤剂相容。具体地讲，本发明的目的是提供丝氨酸蛋白酶，其能够在比目前市售的酶制品低的温度下去除蛋白质物质，包括洗涤衣物和餐具的污渍，从而节约能源。真菌丝氨酸蛋白酶可在高产真菌宿主中产生，并且容易进行其下游加工，例如发酵液和菌丝体的分离。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并包含SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ IDNO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列。

本发明的酶可获自锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)，更优选可获自保藏菌株CBS 124084。

所述酶的分子量介于25和35kDa之间。在pH 9下，酶的最适温度范围为30℃-70℃。所述酶在50℃、至少pH 6-pH 12pH的范围下具有最适pH。采用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物来测定最适温度和最适pH。本发明的丝氨酸蛋白酶能够在洗涤剂存在下在10℃和60℃之间降解或去除蛋白质污渍。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与下述质粒pALK2530中所包含的多核苷酸序列杂交，所述质粒pALK2530包含核苷酸序列SEQ ID No：12，保藏于保藏号DSM 22208的大肠杆菌(E.coli)RF7803中。

所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ IDNO：18限定的成熟Fa_RF7182的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列的多肽。优选所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO：17的分离核酸分子编码。

本发明的全长真菌丝氨酸蛋白酶由pALK2531中所包含的多核苷酸序列编码，所述pALK2531保藏于保藏号DSM 22209的大肠杆菌RF7879中。

真菌丝氨酸蛋白酶由重组表达载体产生，所述载体包含与能够指导丝氨酸蛋白酶编码基因在合适的宿主中表达的调节序列有效连接的编码本发明真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子。合适的宿主包括异源宿主，优选以下的微生物宿主：木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢菌属(Neurospora)、根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)和被孢霉属(Mortiriella)。

优选所述酶在木霉属或曲霉属中产生，最优选在里氏木霉(T.reesei)中产生。

本发明还涉及选自以下的编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子：

(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO：18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；

(b)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与SEQ ID NO：18的氨基酸序列有至少81％同一性的多肽的核酸分子；

(c)包含SEQ ID NO：13所述核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(e)其编码序列由于遗传密码简并性而与(c)-(d)中任一项的核酸分子的编码序列不同的核酸分子；和

(f)在严格条件下与DSM 22208中所包含的核酸分子杂交，并编码具有丝氨酸蛋白酶活性和与SEQ ID NO：18所述氨基酸序列显示至少81％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

本发明还涉及重组表达载体，所述载体包含与能够在合适的宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因表达的调节序列有效连接的本发明的核苷酸序列。合适的宿主包括异源宿主，优选以下的微生物宿主：木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属。优选所述酶在木霉属或曲霉属中产生，最优选在里氏木霉中产生。

本发明还涉及包含上述重组表达载体的宿主细胞。优选宿主细胞为微生物宿主，例如丝状真菌。优选的宿主为以下宿主：木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属。更优选宿主是木霉属或曲霉属，最优选为丝状真菌里氏木霉。

本发明涉及产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和回收多肽的步骤。由本发明的核酸序列编码的且可通过上述方法获得的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽亦落入本发明范围内。

本发明涉及用于获得酶制备物的方法，所述方法包括以下步骤：培养本发明的宿主细胞，从所述细胞中回收多肽或者由培养基分离细胞并得到上清液。由上述方法获得的酶制备物亦落入本发明范围内。

本发明涉及酶制备物，其包含本发明的丝氨酸蛋白酶。

本发明的酶制备物还可包含含有或不含介质(mediator)的其它酶以及合适的添加剂，所述其它酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶(cutinase)、果胶酶或氧化酶，所述添加剂选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、防腐蚀剂、助洗剂、抗再沉积剂、光学增亮剂、腐蚀剂、研磨剂、染料、颜料和防腐剂等。

生产宿主的耗尽培养基可按原样使用，或者可除去宿主细胞，和/或可将其浓缩、过滤或分级。也可将其干燥。本发明的酶制备物可呈液体、粉末或颗粒的形式。

属于本发明范围的还有本发明的丝氨酸蛋白酶或酶制备物用于洗涤剂、用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食品或饲料或者用于包括改变、降解或去除蛋白质物质的任何应用的用途。具体地讲，所述酶或酶制备物在液体洗涤剂和粉状洗涤剂中用作洗涤剂添加剂。

附图简述

图1表示锐顶镰孢菌RF7182 Fa prtS8A基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。通过SignalP V3.0程序分析的推定的信号肽用小写字母和下划线表示。前序列(pro sequence)和前序列的推定氨基酸用小写字母表示。成熟核苷酸和肽序列用大写字母表示(N端序列由纯化的野生型Fa_RF7182蛋白确定)。推定内含子序列的位置用小写、斜体字母表示并在核苷酸序列下用虚线标明。终止密码子用序列下的星号表示。得自野生型Fa_RF7182蛋白的N端序列和肽序列用灰色背景突出显示。

图1A表示Fa prt8a基因的核苷酸序列(核苷酸1-900)、编码Fa_RF7182蛋白的氨基酸Met1-Val278的序列区。

图1B表示Fa prt8A基因的核苷酸序列(核苷酸901-1261)、编码Fa_RF7182蛋白的氨基酸Leu279-Ala415的序列区。

图2图示用于在里氏木霉中表达Fa prt8A基因的表达盒。

图3表示用12％SDS PAGE凝胶分析的部分纯化的重组Fa_RF7182蛋白。泳道1.部分纯化的Fa_RF7182的样品，泳道2.分子量标记(Bench Mark Protein Ladder，Invitrogen)。

图4A表示用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物，在pH 9下测定重组蛋白Fa_RF7182的温度曲线图。数据点是三次独立测量的平均值。

图4B表示pH对重组Fa_RF7182蛋白活性的作用。所用缓冲液为pH 6-pH 12的40mM Britton-Robinson缓冲液，反应温度为50℃。反应时间为15分钟，酪蛋白用作底物。数据点是三次独立测量的平均值。

图5表示在30℃、pH 9、60分钟重组Fa_RF7182蛋白对血/牛奶/墨水污渍(Art 116，EMPA)的性能。市售制品Savinase Ultra

16L(Novozymes A/S，DK)和Purafect

4000L(Genencor Inc.，USA)用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图6表示在50℃、pH 9、60分钟Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍(Art.116，EMPA)的性能。市售制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图7表示在40℃和pH 10下在粉状洗涤剂(Art.601，EMPA)存在时重组Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍(Art.117，EMPA)的性能。市售制品Purafect

4000L用作比较。x轴表示酶用量(活性/ml)，y轴表示ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图8表示在40℃、约pH 7.9、60分钟和液体洗涤剂ArielSensitive(不含酶)下重组蛋白Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍(Art117，EMPA)的性能。市售制品Purafect

4000L用作比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图9表示在30℃和不同浓度的彩色织物液体基质洗涤剂(liquidbase detergent)下重组蛋白Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍(Art 117，EMPA)的性能。市售制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 16L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图9A表示洗涤剂浓度为5g/l和pH 7.5时的性能。

图9B表示洗涤剂浓度为5g/l时的性能(以蛋白质的量计算酶用量)。

图9C表示洗涤剂浓度为3.3g/l和pH 7.4时的性能。

图9D表示洗涤剂浓度为1g/l和pH 7.3时的性能。

图10表示在30℃和不同浓度的Ariel sensitive(不含酶)下重组蛋白Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍(Art 117，EMPA)的性能。市售制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 16L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图10A表示洗涤剂浓度为5g/l和pH 8时的性能。

图10B表示洗涤剂浓度为5g/l时的性能(以蛋白质的量计算酶用量)。

图10C表示洗涤剂浓度为3.3g/l和pH 7.9时的性能。

图10D表示洗涤剂浓度为1g/l和pH 7.6时的性能。

图11表示在Launder Ometer试验中在30℃和彩色织物液体基质洗涤剂下重组蛋白Fa_RF7182对不同污渍的性能。市售制品Savinase 

Ultra 16L和Purafect

4000L用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图11A表示对血/牛奶/墨水/PE-棉(Art.117，EMPA)的性能。

图11B表示对血/牛奶/墨水/棉(Art.116，EMPA)的性能。

图11C表示对草(Art.164，EMPA)的性能。

图11D表示对可可(Art.112，EMPA)的性能。

图12表示在实物洗涤试验中Fa_RF7182酶制备物对8种不同蛋白酶敏感性污渍(表5)的总去污效率(delta％SR)。市售制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L用于比较。

图12A表示当根据活性投放蛋白酶制备物时的总去污效率。

图12B表示当根据蛋白质的量投放蛋白酶制备物时的总去污效率。

图13表示在实物试验中在30℃下彩色织物液体洗涤剂基质下的去污效果。

图13A表示对巧克力奶/颜料/棉(C-03-030/CFT)的去污效果。

图13B表示对血/牛奶/墨水/棉(C-05-059b/CFT)的去污效果。

图13C表示对血/牛奶/墨水/PE-棉(C-05-014/CFT)的去污效果。

图13D表示对花生油/牛奶/棉(C-05-014/CFT)的去污效果。

图13E表示对蛋黄/颜料/棉(CS-38-010/CFT)的去污效果。

图14表示在10℃-60℃的温度、pH 9、60分钟重组Fa_RF7182蛋白对血/牛奶/墨水污渍(Art 117，EMPA)的性能。市售制品SavinaseUltra

16L(Novozymes A/S，DK)、Purafect

4000L(Genencor Inc，USA)和Properase

4000E(Genencor Inc.，USA)用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图14A表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在10℃下的性能。

图14B表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在20℃下的性能。

图14C表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在30℃下的性能。

图14D表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在40℃下的性能。

图14E表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在50℃下的性能。

图14F表示重组蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在60℃下的性能。

图15表示在10℃和20℃以及3.3g/l的液体基质浓度下重组Fa_RF7182蛋白对血/牛奶/墨水污渍(Art 117，EMPA)的性能。市售制品Savinase

Ultra 16L、Purafect4000L和Properase

4000E用于比较。ΔL^*(deltaL^*)＝酶处理织物的光亮度值L^*-仅缓冲液处理织物(酶空白对照)的光亮度值L^*。

图15A表示在10℃下的性能。

图15B表示在20℃下的性能。

序列表

SEQ ID NO：1得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的氨基端肽#3811的序列。

SEQ ID NO：2得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1609，880的序列。

SEQ ID NO：3得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1793,957的序列。

SEQ ID NO：4得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段743,494的序列。

SEQ ID NO：5得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段2103,832的序列(起始2045,06)。

SEQ ID NO：6得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段2103,832的序列(起始1406,57)。

SEQ ID NO：7得自锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段3662,692的序列。

SEQ ID NO：8来源于肽SEQ ID NO：3的寡核苷酸引物PRO123的序列。

SEQ ID NO：9来源于肽SEQ ID NO：6的寡核苷酸引物PRO122的序列。

SEQ ID NO：10丝氨酸蛋白酶共有寡核苷酸引物PRO60的序列。

SEQ ID NO：11丝氨酸蛋白酶共有寡核苷酸引物PRO61的序列。

SEQ ID NO：12使用引物PRO123(SEQ ID NO：8)和PRO61(SEQID NO：11)及锐顶镰孢菌RF7182基因组DNA作为模板获得的PCR片段的序列。

SEQ ID NO：13全长锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶基因(Fa prtS8A)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14包括氨基酸Met1-Ala415在内的全长锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶(Fa_RF7182)的推断氨基酸序列。

SEQ ID NO：15编码锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的酶原形式的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的酶原形式的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：14限定的全长Fa_RF7182的氨基酸Ala21-Ala415。

SEQ ID NO：17编码锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：14限定的全长Fa_RF7182的氨基酸Ala127-Ala415。

保藏

锐顶镰孢菌RF7182于2009年1月28日保藏于CentraalbureauVoor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8，3508 AD，Utrecht，theNetherlands，指定保藏号CBS 124084。

包含质粒pALK2530的大肠杆菌菌株RF7803于2009年1月21日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)，Inhoffenstrasse 7b，D-38124 Braunschweig，Germany，指定保藏号DSM 22208。

包含质粒pALK2531的大肠杆菌菌株RF7879于2009年1月21日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)，Inhoffenstrasse 7b，D-38124 Braunschweig，Germany，指定保藏号DSM 22209。

发明详述

本发明提供真菌来源的丝氨酸蛋白酶，所述蛋白酶显示广泛的底物特异性，在高的pH范围内是稳定的，并具有宽广的最适温度，即在低温和中等温度两者下的性能优良。对于洗涤剂应用，该酶是理想的，耐氧化剂和螯合剂，并且在洗涤剂溶液中低酶水平有效。具体地讲，丝氨酸蛋白酶在低至10℃的温度下都有活性，优选的范围为10℃-70℃。因此，本发明提供用于洗涤剂和其它应用的备选丝氨酸蛋白酶。真菌丝氨酸蛋白酶可在高产真菌宿主中产生，并且易于进行其下游加工，例如发酵液和菌丝体的分离。

本发明的“丝氨酸蛋白酶”或“丝氨酸内肽酶”或“丝氨酸内蛋白酶”是指由国际生物化学与分子生物学联合会命名法(Nomenclatureof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)归类为EC 3.4.21的酶。丝氨酸蛋白酶存在于单细胞生物和复杂生物两者中。根据其结构相似性，将丝氨酸蛋白酶分成至少6大类(clan)(SA、SB、SC、SE、SF和SG；S表示丝氨酸蛋白酶)，其被细分为具有类似氨基酸序列和三维结构的家族(参见例如丝氨酸蛋白酶主页http://www.biochem.wustl.edu/～protease/，Department of Biochemistryand Molecular Biophysics，Washington University of Medicine，St.Louis，MO，USA)。这些蛋白质水解酶或降解酶的特征在于其活性部位中存在亲核丝氨酸基团，SA大类和SB大类的蛋白酶还因具有必不可少的与丝氨酸一起形成催化三联体的天冬氨酸和组氨酸残基而著称。

主要的大类包括“胰凝乳蛋白酶样”，包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶(SA大类)和“枯草杆菌蛋白酶样”(SB大类)丝氨酸蛋白酶。所述酶根据切割部位周围的氨基酸残基的侧链而靶向多肽链的不同区域。本发明的丝氨酸蛋白酶属于SB大类。

所表征的“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”或“亚麻酶(subtilases)”一般是细菌来源的。由各种芽孢杆菌(像解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquifaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Rao等，1998))代表的这类蛋白酶，对芳族残基或疏水残基(例如酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸)有特异性。

本发明使用的术语“丝氨酸蛋白酶活性”是指对于含有蛋白质的底物(例如酪蛋白、血红蛋白、角蛋白和BSA)的水解活性。用于分析蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的，可参照例如Gupta等(2002)。

可采用组别特异性抑制剂对蛋白酶进行分类。“丝氨酸蛋白酶抑制剂”的不同组别包括合成的化学抑制剂和天然蛋白质抑制剂。天然抑制剂的一个组别为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin，由serine proteaseinhibitor缩写而成)，例如抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶。人工合成的抑制剂包括3，4-二氯异香豆素(3，4-DCI)、二异丙基氟磷酸(DFP)、苯甲磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)。一些丝氨酸蛋白酶由于活性部位附近存在的半胱氨酸残基而被硫醇试剂(例如对氯汞苯甲酸(PCMB))抑制。因此，可在基于特异性底物切割的测定中，或者在合适条件下使用含有或不含丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂的任何含有蛋白质的底物的测定中，测定丝氨酸蛋白酶活性。

丝氨酸蛋白酶一般在中性或碱性pH下有活性，最适pH介于pH7和11之间，并具有广泛的底物特异性。“碱性丝氨酸蛋白酶”是指在pH 9-pH 11下，甚至在pH 10-12.5下有活性且稳定(Shimogaki等，1991)并且等电点约pH 9的酶。这些代表了市售丝氨酸蛋白酶的最大亚组。碱性丝氨酸蛋白酶的分子量的范围介于15kDa和35kDa之间。天然丝氨酸蛋白酶的最适温度约为60℃(Rao等，1998)。

可筛选能够产生蛋白酶活性的微生物菌株，并且可测定对不同底物的活性。可将选定的菌株在合适的培养基中培养。在产生足量的引人关注的丝氨酸蛋白酶后，可分离或纯化酶，并且可更充分地表征其性质。备选地，可分离出在各种生物中编码丝氨酸蛋白酶的基因，并可将这些基因编码的氨基酸序列与本文实施例中分离和表征的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行比较。

所产生的蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶可用酶化学的常规方法纯化，例如盐制备(salt preparation)、超滤、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤和疏水作用层析。可通过蛋白质测定、酶活性测定和通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测纯化。可测定经纯化的酶在不同的温度和pH值下的酶活性和稳定性以及分子量和等电点。

在实施例1b中说明了本发明优选的丝氨酸蛋白酶的纯化。将过滤的培养物上清液加入Q Sepharose FF柱中。将流出流分加入苯基Sepharose HP柱中，将蛋白质用线性递减的盐梯度洗脱。合并显示蛋白酶活性的流分、浓缩并加到Superdex 7510/300GL柱中。在纯化之后是如实施例1b中所述的对试卤灵标记的酪蛋白的活性测定。无疑，代替或除本文所述方法以外，可采用其它已知的纯化方法，来分离本发明的酶。重组丝氨酸蛋白酶按照实施例5中所述进行纯化，并用于pH和温度曲线图的表征。

可通过质谱法或者按照Laemmli(1970)在SDS-PAGE上测定纯化的丝氨酸蛋白酶的分子量。还可由酶的氨基酸序列预测分子量。成熟丝氨酸蛋白酶的分子量通常介于20-35kDa之间，通常为约25-30kDa(Rao等，1998)。

将丝氨酸蛋白酶合成为前酶原形式的无活性“酶原前体”或“酶原”，所述前酶原通过除去信号序列(分泌信号肽或前导肽(prepeptide))和前序列(前肽(propeptide))而被激活，得到酶的活性成熟形式(Chen和Inouye，2008)。这种活化方法包括蛋白酶的作用，可起因于丝氨酸蛋白酶有限的自消化或自催化加工。例如，可在生产的翻译后期间或在耗尽培养基中或者在培养基或酶制备物的贮存期间切割前序列。还可通过将蛋白水解酶加到宿主生物在其中培养的培养基中来实现酶原的活化，或者在培养过程之后将蛋白水解酶加入培养物上清液中，所述蛋白质水解酶能够将无活性的酶原转化成有活性的成熟酶。还可以通过例如在将编码多肽的基因转化至生产宿主中之前将其截短，来实现酶的缩短。

术语“成熟”是指除去信号序列或前肽后包含酶活性或催化活性所必需的氨基酸的酶形式。在丝状真菌中，它是分泌到培养基中的天然形式。

可按实施例1c、5或14中所述通过使用酪蛋白作为底物在不同温度下在合适的缓冲液中，或者通过使用文献(Gupta等，2002)中描述的其它底物和缓冲液系统，测定丝氨酸蛋白酶的最适温度。可根据对蛋白质底物的活性，在不同pH值下在合适的缓冲液中进行最适pH的测定。

蛋白酶活性一般以可溶性底物的降解为基础。在洗涤剂应用中，蛋白酶必须对至少部分地不溶的物质产生作用。因此洗涤剂蛋白酶的一个重要参数是其吸附和水解这些不溶性片段的能力。

选择洗涤剂蛋白酶的另一个重要参数是其等电点或pI值。当洗涤剂蛋白酶在其中起作用的洗涤剂溶液的pH值与该酶的pI值大致相同时，洗涤剂蛋白酶发挥最佳作用。洗涤剂应用中的pH一般是碱性的，液体洗涤剂为pH 7-9，当使用粉状洗涤剂时，为pH 9-10.5。通过对由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化pH梯度凝胶进行等电聚焦，或者通过由氨基酸序列估算pI，例如通过应用ExPASy服务器上的pI/MW工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等，2003)，来测定pI。

可按照实施例2中描述的Edman降解化学法(Edman和Begg，1967)，或者通过文献中描述的其它方法，对纯化的蛋白酶的N端以及内部肽进行测序。

本发明的丝氨酸蛋白酶可来源于任何生物，包括细菌、古生菌、真菌、酵母和甚至高等真核生物，例如植物。所述酶优选来源于真菌，包括丝状真菌和酵母，例如来源于选自镰孢属的属。由于容易进行下游加工以产生不含微生物的酶或酶组合物，因此真菌碱性蛋白酶相对于细菌蛋白酶是有利的。在酶纯化前，通过过滤技术可容易地除去菌丝体。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其在具有极为不同性质的洗涤剂存在下，在大范围温度即从低温到中等温度范围(例如10℃-60℃)内具有良好性能。

在本发明中，在本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的这个情况下，在洗涤剂存在下的良好性能，是指所述酶在比目前出售的许多市售枯草杆菌蛋白酶低的温度范围内起作用。换句话说，良好性能是指所述酶能够在低温到中等温度范围内，但尤其在比目前市售产品(例如市售酶产品Purafect

4000L(Genencor Inc.，USA))低的温度范围内降解或去除蛋白质污渍或物质。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在低温范围内起作用。例如，可通过改变pH、选择具有合适性质的洗涤剂(包括酶保护剂)和通过控制洗涤条件，将本发明的丝氨酸蛋白酶的活性保持在低至10℃的温度下。因此，依赖于洗涤条件及洗涤剂中的辅助配合剂和添加剂的本发明的丝氨酸蛋白酶特别可用于50℃以下温度。所述酶还在45℃以下温度、40℃以下温度、35℃以下温度或者30℃以下温度下起作用。

在洗涤剂存在下，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在如上规定的10℃和60℃之间起作用。在实施例6-13中描述了比较实验，并且从图7-15显而易见的是，在不同条件下并暴露于不同的处理时，以ΔL^*或Δ％SR总和测定的真菌丝氨酸蛋白酶Fa_RF7182对不同纺织材料上的众多不同污渍的性能，比市售产品SavinaseUltra 16L(NovozymesA/S，DK)、Purafect

4000L(Genencor Inc，USA)和Properase

4000E(Genencor Inc.，USA)的性能好得多。具体来讲，与Savinase

Ultra 16L、Properase(R)4000E和Purafect

4000L的去污效果相比，所述真菌丝氨酸蛋白酶Fa_RF7182在低温范围(例如10℃-40℃)下的去污效果显著较高。

从所述实验结果来看，可得出这样的结论，即本发明的真菌丝氨酸蛋白酶能够满足洗涤剂消费者及洗涤剂行业和洗涤机器供应产业极其不同的需求，并且极好地适合未来法规和消费者习惯的要求。

按照本发明的优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶是具有丝氨酸蛋白酶活性并包含具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与氨基酸序列SEQ ID NO：18有至少81％同一性或与氨基酸序列SEQ ID NO：14有至少80％同一性的氨基酸序列的Fa_RF7182的成熟酶的多肽。优选的酶显示至少81％、优选至少83％、更优选至少85％、甚至更优选至少87％同一性。还更优选氨基酸序列与SEQ ID NO：18的氨基酸序列显示至少89％或至少91％、92％、93％、95％或97％、更优选至少98％、最优选99％同一性。在相应的序列区内(例如丝氨酸蛋白酶的全长或成熟区内)对两种酶的同一性进行比较。

本发明的丝氨酸蛋白酶标明为Fa_RF7182，一种来源于锐顶镰孢菌的分离的丝氨酸蛋白酶，并且是SB大类丝氨酸内蛋白酶第8家族的成员。

本文的术语“同一性”是指两个氨基酸序列在具有大致相同的氨基酸数量的相应序列区内相互比较的同一性。例如，可以对两个氨基酸序列的全长序列或成熟序列的同一性进行比较。待比较的两个分子的氨基酸序列可在一个或多个位置上不同，然而这不会改变分子的生物功能或结构。由于不同的宿主生物或氨基酸序列的突变，可天然发生这种变异，或者变异可通过特异性诱变获得。可因氨基酸序列中一个或多个位置的缺失、取代、插入、添加或组合而产生变异。通过采用ClustalW比对(例如www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw)来测定序列的同一性。所采用的矩阵如下：BLOSUM，空位开放：10，空位延伸：0.5。

优选真菌丝氨酸蛋白酶可获自镰孢属，更优选可获自锐顶镰孢菌。按照最优选的实施方案，本发明的丝氨酸蛋白酶可获自保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures的保藏号CBS 124084的菌株。

本发明的一个优选实施方案是具有丝氨酸蛋白酶活性和SEQ IDNO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列的真菌丝氨酸蛋白酶。成熟酶没有信号序列或前导肽和前序列或前肽。本发明的成熟丝氨酸蛋白酶包括SEQ ID NO：13表征的的全长蛋白酶的氨基酸Ala127-Ala415。因此，属于本发明范围的还有具有SEQ ID NO：13的全长Fa_RF7182酶(包括信号序列(前导肽)和前肽)和成熟酶以及没有信号序列(前导肽)因此具有SEQ ID NO：15的酶原形式。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其成熟形式的分子质量或分子量介于20kDa和35kDa之间，优选介于25kDa和33kDa之间，更优选介于28kDa和30kDa之间。最优选的MW是通过应用ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，2003)得到的成熟多肽呈29kDa的Fa_RF7182的预测分子量。

本发明的酶在大的温度范围内有效降解蛋白质物质。当按照实施例5所述，当用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物在pH 9下测定时，酶的最适温度为30℃-70℃(约最大活性的10％)、优选30℃-60℃(约最大活性的30％)、更优选介于40℃和50℃之间(至少最大活性的60％)、最优选在50℃下(最大活性，Fa_RF7182)。

按照本发明的一个优选实施方案，按照实施例5中所述，用15分钟反应时间，在50℃下，真菌丝氨酸蛋白酶在至少pH 6-pH 12的pH范围内具有最适pH，在pH 7下具有最大活性的至少10％。优选酶在pH 6-pH 11的pH范围内具有最适pH(最大活性的至少40％)。具体来讲，当使用酪蛋白作为底物时，按照实施例5中所述，用15分钟反应时间，在50℃下，最适pH介于pH 6和pH 10之间(约最大活性的55％)，更优选介于pH 6和pH 9之间(最大活性的至少80％)，最优选pH 7。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶具有“在洗涤剂存在下的良好性能”，即在洗涤剂存在下，在低温范围内，特别是在比目前市售产品(例如市售酶产品Purafect

4000L(Genencor Inc.，USA))低的温度范围内，能够降解或去除彩色织物(coloured material)上的蛋白质污渍。在洗涤剂存在下，本发明的酶在10℃和60℃之间、优选在20℃和50℃之间、更优选在50℃以下起作用。Fa_RF7182酶同样在45℃以下温度、40℃以下温度、35℃以下温度或者30℃以下温度起作用。

本发明的丝氨酸蛋白酶的pI是从推断氨基酸序列中预测出来的，介于pI 8.8和pI 9.5，优选介于pI 8.9和pI 9.3之间。本发明的Fa_RF7182酶的预测pI为pI 9.1。

在分离编码本发明的丝氨酸蛋白酶的cDNA或基因组基因时，用N端的氨基酸序列或经纯化的酶的胰蛋白酶消化肽段合成的寡核苷酸或通过使用上述寡核苷酸获得的PCR产物可用作探针。还可根据已知的同源丝氨酸蛋白酶的核苷酸或氨基酸序列设计探针。也可根据含有所述酶的特异性底物的板上的活性，或者通过使用对丝氨酸蛋白酶有特异性的抗体，来筛选丝氨酸蛋白酶克隆。

按照本发明的优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶由在严格条件下与在质粒pALK2530中所包含的多核苷酸或探针序列杂交的分离的多核苷酸序列编码，pALK2530质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO：12，在以保藏号DSM 22208保藏于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)的大肠杆菌RF7803中。

在本发明中，按照实施例3d中所述，用采用严格性杂交通过PCR制备的探针分离Fa prt8A基因。标准分子生物学方法可用于分离宿主生物的cDNA或基因组DNA，例如分子生物学手册(例如Sambrook和Russell，2001)中描述的方法。

与DNA探针(例如由超过100-200个核苷酸组成的SEQ ID NO：12)的杂交，常常在“高严格性”条件下进行，即在低于完全杂交体的解链温度(Tm)计算值20-25℃的温度下杂交，Tm按照Bolton和McCarthy(1962)计算。预杂交和杂交一般至少在65℃下在6xSSC(或6xSSPE)、5xDenhardt试剂、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml变性、断成碎片的鲑鱼精DNA中进行。加入50％甲酰胺降低预杂交和杂交温度至42℃。在低盐浓度中进行洗涤，例如在2xSSC-0.5％SDS(w/v)中于室温(RT)进行15分针，接着在2xSSC-0.1％SDS(w/v)中于室温下进行，最后在0.1xSSC-0.1％SDS (w/v)中至少在65℃下进行。

按照一个优选的实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离核酸分子编码，所述分离核酸分子编码包含SEQ ID NO：18中表征的氨基酸序列的多肽，或者与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少81％或与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽。优选的酶显示至少81％、优选至少83％、更优选至少85％、甚至更优选至少87％同一性。还更优选氨基酸序列与SEQ ID NO：18的氨基酸序列显示至少89％、91％、93％或至少97％、更优选至少98％、最优选99％同一性。在相应的序列区内对两种酶的同一性进行比较，例如在丝氨酸蛋白酶的成熟区或全长区内。

因此，本发明范围内有这样的多肽序列，其由编码本发明的全长丝氨酸蛋白酶(除成熟形式的酶以外还包括前导肽(信号序列)和前肽)的氨基酸序列的核酸分子编码，且所述氨基酸序列表征于SEQ IDNO：14。

同样，本发明范围内有这样的多肽序列，其由编码本发明的丝氨酸蛋白酶的酶原形式(除成熟形式的酶以外还包括前肽)的核酸分子编码，且所述氨基酸序列表征于SEQ ID NO：16。

本发明的一个优选的实施方案是由分离核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子包含编码具有SEQ ID NO：18的Fa_RF7182丝氨酸蛋白酶的成熟形式的核苷酸序列。

按照一个优选的实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离核酸分子编码，所述核酸分子包含编码Fa_RF7182酶的成熟形式(SEQID NO：18)的核苷酸序列SEQ ID NO：17。

因此，本发明范围内有这样的多肽，其由具有包含所述酶的“编码序列”的核苷酸序列SEQ ID NO：13的核酸分子编码。表述“编码序列”是指起始于翻译起始密码子(ATG)和终止于翻译终止密码子(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。翻译的全长多肽通常以甲硫氨酸开始，并包含内含子区。

同样，本发明范围内有这样的真菌丝氨酸蛋白酶，其由包含编码Fa_RF7182酶原形式的核苷酸序列SEQ ID NO：15的核酸分子编码。

按照本发明的另一个优选的实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶由保藏于保藏号DSM 22209的大肠杆菌RF7879中的pALK2531所包含的多核苷酸序列编码。

本发明的一个实施方案是由包含核酸分子的重组表达载体产生的丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子编码如上表征的与调节序列有效连接的真菌丝氨酸蛋白酶，所述调节序列能够指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因的合适的宿主中表达。所述重组表达载体的构建和所述载体的使用详见实施例4。

适于产生真菌丝氨酸蛋白酶的合适宿主为同源宿主或异源宿主，例如微生物宿主，包括细菌、酵母和真菌。丝状真菌，例如木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属由于容易进行下游加工和酶产品回收，因此是优选的生产宿主。合适的宿主包括例如以下菌种：里氏木霉、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)、泡盛曲霉(A.awamori)或日本曲霉(A.japonicus)类型的菌株、F.venenatum或尖镰孢、H.insolens或H.lanuginosa、粗糙脉孢菌(N.crassa)和C.lucknowense，其中一些在例如市售酶的AMFEP 2007目录中被列为酶生产宿主生物(http://www.amfep.org/list.html)。更优选所述酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主(例如里氏木霉，或黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉菌株)中产生。按照本发明最优选的实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

本发明还涉及选自以下的编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子：

(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO：18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；

(b)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与SEQ ID NO：18具有至少81％同一性的多肽的核酸分子；

(c)包含SEQ ID NO：13所述核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(e)其编码序列由于遗传密码简并性而与(c)-(d)中任一项的核酸分子的编码序列不同的核酸分子；和

(f)在严格条件下与DSM 22208中所包含的核酸分子杂交且编码具有丝氨酸蛋白酶活性和与SEQ ID NO：18所述氨基酸序列显示至少81％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

本发明的核酸分子可以是RNA或DNA，其中DNA可由基因组DNA或cDNA构成。

标准分子生物学方法可用于编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分离和酶处理，包括分离基因组和质粒DNA、消化DNA以产生DNA片段、测序、大肠杆菌转化等。基本方法描述于标准分子生物学手册，例如Sambrook和Russell，2001。

编码Fa_RF7182多肽的Fa prtS8A基因的分离见实施例3。简单地说，将通过使用简并寡核苷酸引物PRO123(SEQ ID NO：8)和PRO61(SEQ ID NO：11)的序列获得的753bp PCR片段用来分离pBluescript IIKS+载体中的锐顶镰孢菌RF7182的Fa prt8A基因。全长锐顶镰孢菌Fa prtS8A基因包含在质粒pALK2531中，该质粒保藏在DSMZ培养物保藏中心的保藏号DSM 22209的大肠杆菌中。对从DNA序列推断的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行了分析。

锐顶镰孢菌丝氨酸蛋白酶Fa prtS8A核苷酸序列(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列和推断序列(SEQ ID NO：14)见图1A和图1B。基因的长度为1353bp(包括终止密码子)。发现2个推定的内含子的长度为51bp和54bp。推断的蛋白质序列由415个氨基酸组成，包括预测的20个氨基酸的信号序列(SignalP V3.0；Nielsen等，1997及Nielsen和Krogh，1998)和Ala21-Arg126的前肽。对于成熟多肽，预测的分子量为29kDa，预测的pI为9.1。这些预测利用ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，2003)作出。推断的氨基酸序列含有2个可能的N-糖基化位点(Asn79和Asn258)，但是按照CBS Server NetNGlyc V 1.0，或许只有一个Asn79位的位点(位于前肽中)。应用NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)上的BLASTX程序2.2.9版检索与已发表的蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。通过使用ClustalW比对(矩阵：BLOSUM，空位开放：10，空位延伸：0.5(例如www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw)，得到成熟Fa_RF7182序列与同源序列相应成熟区的同一性值，见表3。

本发明的丝氨酸蛋白酶Fa_RF7182与玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾本科镰孢(Fusarium graminearum))假定蛋白质PH-1，基因座标签FG03315.1(EMBL检索号XP_383491，未发表)，与Hypocrealixii(哈茨木霉(Trichoderma harzianum))CECT 2413丝氨酸内肽酶(EMBL检索号CAL25508，Suarez等，2007)以及与深绿木霉(T.atroviride)碱性蛋白酶前体S08.066，ALP(EMBL检索号M87516，Geremia等，1993)显示最高的同源性，后者在US 60/818,910(Catalyst Bioscience Inc.)中被公开为氨基酸序列SEQ ID NO：313。全长酶内与玉蜀黍赤霉假定蛋白质的同一性为79％。当对没有信号序列和前肽的成熟多肽进行比对时，同一性为80％。与H.lixii CECT 2413丝氨酸内肽酶的同一性为73％(全长酶)和79％(成熟酶)。与深绿木霉ALP的同一性为71％(全长酶)和76％(成熟酶)。

因此，属于本发明范围的有分离多核苷酸序列或分离核酸分子，其编码真菌丝氨酸蛋白酶或包含SEQ ID NO：18表征的Fa_RF7182酶成熟形式的氨基酸序列的多肽，SEQ ID NO：18即SEQID NO：14的全长丝氨酸蛋白酶的氨基酸Ala127-Ala415。

此外，属于本发明范围的有编码真菌丝氨酸蛋白酶多肽的片段的核酸分子，其中所述片段具有丝氨酸蛋白酶活性并与氨基酸序列SEQID NO：18有至少81％同一性或与氨基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80％同一性。优选的酶显示至少81％、优选至少83％、更优选至少85％、甚至更优选至少87％同一性。还更优选氨基酸序列与SEQ ID NO：18的氨基酸序列显示至少89％或至少91％、92％、93％、95％或97％、更优选至少98％、最优选99％同一性。在相应的序列区内(例如在丝氨酸蛋白酶的成熟区或全长区内)对两种酶的同一性进行比较。

核酸分子优选为包含SEQ ID NO：13所述编码序列的分子，其编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的全长形式。

本发明的分离核酸分子可以是包含在DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的编码序列的分子。DSM 22208携带用于克隆全长Fa prtS8A基因的PCR片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。DSM 22209携带全长Fa prtS8A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。

本发明的核酸分子还可以是上文中表征的核苷酸序列的类似物。“简并性”是指核苷酸序列的类似物，其在一个或多个核苷酸或密码子上不同，但仍编码本发明的重组蛋白酶。

核酸分子还可以是在严格条件下与在质粒pALK2530中所包含的PCR探针杂交的核酸分子，其并且编码具有丝氨酸蛋白酶活性和在相应序列区中与SEQ ID NO：18所述氨基酸序列显示至少81％同一性的氨基酸序列的多肽，所述质粒保藏于保藏号DSM 22208的大肠杆菌中。杂交DNA可来源于属于菌种镰孢属的真菌，或者可来源于其它真菌菌种。

因此，属于本发明范围的有包含SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17中所述核苷酸序列及其类似物的分离核酸分子。

本发明还涉及重组表达载体或重组表达构建体，其可用来在合适的原核或真核宿主中增殖或表达编码选定的丝氨酸蛋白酶的核酸序列基因。重组表达载体包含有利于或指导丝氨酸蛋白酶编码序列在合适的宿主中表达和分泌的DNA或核酸序列，例如与编码所述丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列有效连接的启动子、增强子、终止子(包括转录和翻译终止信号)及信号序列。表达载体还可包含用于选择转化体菌株的标记基因，或者可将另一个载体构建体中的选择标记通过共转化导入宿主中。所述调节序列可与生产生物同源或异源，或者可来源于从中分离出编码丝氨酸蛋白酶的基因的生物。

用于在丝状真菌宿主中表达本发明的丝氨酸蛋白酶的启动子的实例是米曲霉TAKA淀粉酶、碱性蛋白酶ALP和丙糖磷酸异构酶、Rhizopus miehei脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、Chrysosporium lucknowense纤维二糖水解酶1启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I(Cel7A)的启动子等。

酵母中，可以使用例如酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、半乳糖激酶(GAL1)、醇脱氢酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的启动子以提供表达。

指导本发明的丝氨酸蛋白酶在细菌宿主中转录的启动子序列的实例是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶dagA启动子、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(maltogenic amylase gene)(amyM)启动子、枯草芽孢杆菌(B.sublitis)xylA和xylB基因启动子等。

合适的终止子包括上述基因的终止子或任何其它已表征的终止子序列。

合适的转化或选择标记包括弥补宿主缺陷的标记，例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌的dal基因或曲霉amdS和niaD。还可根据赋予以下抗生素抗性的标记进行选择：例如青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、腐草霉素或潮霉素抗性。

本发明的丝氨酸蛋白酶的胞外分泌是优选的。因此，重组载体包含促进在选定的宿主中分泌的序列。本发明丝氨酸蛋白酶的信号序列或前序列或前导肽可包含在重组表达载体中，或者可用另一个能够促进在选择的宿主中分泌的信号序列代替天然信号序列。因此，所选择的信号序列可与表达宿主同源或异源。

合适信号序列的实例是真菌或酵母生物的信号序列，例如本领域众所周知的表达良好的基因的信号序列。

重组载体还可包含有利于载体整合到宿主染色体DNA中以获得稳定表达的序列。

如实施例4中所述，本发明的Fa_RF7182蛋白酶用得自里氏木霉cbh1(cel7A)启动子的其自有信号序列表达。用于转化里氏木霉宿主的表达构建体还包括cbh1终止子和用于从未转化细胞中选择转化体的amdS标记。

本发明还涉及包含上述重组表达载体的宿主细胞。用于产生真菌丝氨酸蛋白酶的合适宿主是同源宿主或异源宿主，例如微生物宿主，包括细菌、酵母和真菌。植物或哺乳动物细胞中的生产系统也是可能的。

丝状真菌，如木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属，由于容易进行下游加工和酶产品回收，因此是优选的生产宿主。合适的表达和生产宿主系统为例如开发用于丝状真菌宿主里氏木霉(EP 244234)的生产系统；或曲霉属生产系统，例如米曲霉或黑曲霉(WO 9708325、US 5,843,745、US5,770,418)、泡盛曲霉、酱油曲霉和日本曲霉型菌株；或者开发用于镰孢属，例如尖镰孢(Malardier等，1989)或F.venenatum以及用于粗糙脉孢菌、米黑根霉(Rhizopus miehei)、高山被孢霉属(Mortiriella alpinis)、绵毛腐质霉(H.lanuginosa)或特异腐质霉(H.insolens)或用于Chrysosporium lucknowensee(US 6,573,086)的生产系统。开发用于酵母的合适的生产系统是开发用于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的系统。开发用于细菌的合适的生产系统是开发用于芽孢杆菌属(例如用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens))、用于大肠杆菌或用于放线菌链霉菌属(actinomycete Streptomyces)的生产系统。优选本发明的丝氨酸蛋白酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主中产生，例如里氏木霉或者黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型菌株。按照本发明最优选的实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

生产宿主细胞可与本发明的丝氨酸蛋白酶同源或异源。宿主可由于通过灭活或除去一种或多种宿主蛋白酶(例如通过缺失编码这类同种(homogenous)或同源(homologous)蛋白酶的基因而除去蛋白酶，因此不含同种蛋白酶。

本发明还涉及用于产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括使携带用于本发明的丝氨酸蛋白酶的重组表达载体的天然宿主细胞或重组宿主细胞在合适条件下培养以及任选分离所述酶的步骤。生产培养基可以是适于宿主生物生长并含有用于有效表达的诱导物的培养基。从文献中来看，合适的培养基是众所周知的。

本发明涉及具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本发明的核酸分子编码，其可通过上述方法获得。优选多肽是通过培养携带用于本发明的丝氨酸蛋白酶的重组表达载体的宿主细胞而获得的重组蛋白酶。

本发明还涉及用于获得包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的酶制备物的方法，所述方法包括培养携带本发明的表达载体的宿主细胞，并从所述细胞中回收多肽或者从培养基中分离细胞并得到具有丝氨酸蛋白酶活性的上清液的步骤。

本发明还涉及包含上文表征的丝氨酸蛋白酶的酶制备物。所述酶制备物或组合物具有丝氨酸蛋白酶活性，并可通过本发明的方法获得。

属于本发明的有下述酶制备物，其包含本发明的真菌丝氨酸蛋白酶，优选通过培养携带本发明的重组表达载体的宿主细胞而获得的重组丝氨酸蛋白酶。

除本发明的丝氨酸蛋白酶以外，所述酶制备物还可包含含有或不含介质的不同类型的酶，例如另一种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和/或氧化酶，例如漆酶或过氧化物酶。预期这些酶通过除去存在于待处理材料上的碳水化合物和油或脂肪而增强本发明的丝氨酸蛋白酶的性能。所述酶可以是由宿主菌株产生的天然酶或重组酶，或者在生产过程后将所述酶加入培养物上清液中。

所述酶制备物还可包含选自以下的合适添加剂：表面活性剂、缓冲剂、防腐蚀剂、稳定剂、漂白剂、介质、助洗剂、腐蚀剂、研磨剂、光学增亮剂、抗再沉积剂、染料、颜料和防腐剂等。

表面活性剂可用于乳化油脂和湿润表面。表面活性剂可以是非离子表面活性剂(包括半极性)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。

可将缓冲剂加入酶制备物中以调节pH，或者影响其它成分的性能或稳定性。

合适的稳定剂包括多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽等。

漂白剂用来氧化和降解有机化合物。合适化学漂白系统的实例是H₂O₂源，例如含有或不含过酸形成漂白活化剂(peracid-forming bleachactivator)(例如四乙酰基乙二胺)的过硼酸盐或过碳酸盐，或者备选的过氧酸，例如酰胺、酰亚胺或砜类型。化学氧化剂可通过使用氧化酶(例如漆酶或过氧化物酶)而被部分或完全代替。许多漆酶在不存在介质时无法有效地起作用。

助洗剂或络合剂包括沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等物质。酶制备物还可包含一种或多种聚合物，例如羧甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。同样，可加入软化剂、腐蚀剂、防止其它成分腐败的防腐剂、研磨剂和改进发泡和粘性性质的物质。

按照本发明的一个优选的实施方案，所述酶制备物呈液体、粉末或颗粒的形式。

像其它蛋白酶、特别是碱性蛋白酶一样，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用于洗涤剂、蛋白质、酿造、肉、摄影、皮革、乳品和制药业(Kalisz，1988，Rao等，1998)。例如，它可用作将纤维状蛋白质废料(例如角、羽毛、指甲和毛发)转化为成有用的生物质、蛋白质浓缩物或氨基酸的化学试剂的备选物(Anwar和Saleemuddin，1998)。像其它酶一样，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的使用可证实在改进皮革品质和减少环境污染及节约能源方面是成功的，像碱性蛋白酶一样，它可用于D，L-氨基酸的混合物的拆分。与广谱抗生素组合治疗烧伤和创伤的枯草杆菌蛋白酶是在制药业中使用丝氨酸蛋白酶的一个实例，因此，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶还可用于这类应用，并且像碱性蛋白酶一样，还可用于除去手术设备上的血液，和清洗隐形眼镜或假牙。像来源于冠状耳霉(Conidiobolus coronatus)的碱性蛋白酶一样，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用来替换动物细胞培养物中的胰蛋白酶。本发明的蛋白酶还可用于清洗膜和破坏生物膜。在烘焙中，例如使用蛋白酶破坏面筋网状结构以产生水分保持极低的无弹性面团。在其它食品应用中，使用蛋白酶水解食品蛋白质，其目的在于例如使蛋白质溶解、提炼(从动物骨中提取更多蛋白质)、产生新的气味、减少苦味、改变乳化性质、产生生物活性肽和降低蛋白质的变应原性、处理酵母或牛奶。底物包括动物蛋白、植物蛋白和微生物蛋白。

洗涤剂行业，特别是洗衣洗涤剂行业，已作为在高的pH范围内有活性的蛋白酶的单一主要消费者出现(Anwar和Saleemuddin，1998)。理想的洗涤剂蛋白酶应具有广泛的底物特异性以有利于除去由食品、草、血和其它机体分泌物所造成的各种污渍。它必须在洗涤剂溶液的pH和离子强度、洗涤温度和pH下具有活性，并经得住机械处理以及耐受添加至洗涤剂中的螯合剂和氧化剂。蛋白酶的pI必须接近洗涤剂溶液的pH。由于现今的能源危机和节能的意识，因此目前需要在较低温度下使用蛋白酶。

本发明还涉及丝氨酸蛋白酶或酶制备物用于洗涤剂、处理织物纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理饲料或食品或用于包括改变、降解或除去蛋白质物质的任何应用的用途。

因此，本发明的一个优选的实施方案使用上文表征的丝氨酸蛋白酶作为用于洗衣洗涤剂和餐具洗涤组合物(包括自动餐具洗涤组合物)的洗涤剂添加剂。

表述“洗涤剂”用来指预期帮助清洁或具有清洁性质的物质或材料。术语“去垢力”表示清洁性质的存在情况或程度。可测试对与固体水不溶性载体(例如织物纤维或玻璃)结合的不同的蛋白质材料或含蛋白质底物材料或污渍或污渍混合物的清洁性质的程度。典型的蛋白质物质包括血、牛奶、墨水、蛋、草和调味汁。对于测试目的，蛋白质污渍的混合物是市售可获得的。洗涤剂酶的功能是降解和除去含有蛋白质的污渍。测试结果取决于污渍的类型、洗涤剂的组成和用于洗涤试验中的织物的性质和状况(Maurer，2004)。

蛋白酶性能或洗涤性能通常测量为“去污效率”或“去污效果”或“清洗性能的程度”，是指受污染材料(例如在人为污染的污样或试验布料中)的可见的和可测量的光亮度的增加或颜色的改变。例如，可利用实施例6-10中描述的L^*a^*b^*色空间坐标系，用分光光度计测定颜色作为反射值，来测定光亮度或色值的改变。表示蛋白酶性能(去污效率)的蛋白质污渍的褪色或去除例如计算为ΔL^*，其是指酶处理织物的光亮度值L^*减去用不含酶的缓冲液或洗涤液(酶空白对照或对照)处理的织物的光亮度值L^*。洗涤剂的存在可改进酶去除污渍的性能。

本发明的丝氨酸蛋白酶在中性和碱性pH条件下，甚至在具有不同组成的洗涤剂的存在下降解各种蛋白质污渍(如实施例6-13所示)。

如实施例6所示，与市售蛋白酶制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L相比，在50℃下，尤其在30℃下，本发明的丝氨酸蛋白酶在pH 9缓冲液和防腐剂中更好地去除血/牛奶/墨水标准污渍(图5和图6)。酶制备物按活性单位投放。按照实施例12中所述，还在10℃-60℃的整个温度范围内测试了对血/牛奶/墨水污渍的去污效果。与市售蛋白酶制品Savinase

Ultra 16L、Properase

4000E和Purafect4000L相比，Fa_RF7182蛋白酶制备物尤其在低的洗涤温度下、在10℃-40℃的范围内显示更高的去污能力(图14)。

如实施例7中所述，还在40℃、pH 10下测试了粉状洗涤剂中Fa_RF7182蛋白酶的性能。还测定了在含有磷酸盐的参比洗涤剂存在时酶在去除聚酯-棉材料上的血/牛奶/墨水标准污渍(Art.117，EMPA)方面的能力。各种酶制备物按活性单位(μmol酪氨酸/分钟)投放。如图7所示，本发明的蛋白酶还适用于极碱性条件下的粉状洗涤剂。在40℃下，Fa_RF7182酶的性能类似于商用蛋白酶Purafect

4000L的性能。

如实施例8所示，Fa_RF7182蛋白酶还在不含酶的液体洗涤剂Ariel Sensitive(Procter & Gamble，UK)存在下除去聚酯-棉材料上的血/牛奶/墨水标准污渍(Art.117，EMPA)。酶按活性单位(μmol酪氨酸/分钟/体积)投放。4-8个单位的市售酶制备物/ml液体的用量等于约0.2-0.5％酶制备物/洗涤剂重量的用量，这是洗涤剂酶的通常使用水平。Fa_RF7182在液体洗涤剂条件下显示优良性能(图8)，而且与市售制品Savinase

Ultra 14L和Purafect

4000L相比，受污染材料光亮度的增加显著较高。

当在30℃下使用不同液体洗涤剂浓度(实施例9，图9A-D和10A-D)测试Fa_RF7182酶的性能时，观察到类似结果。与市售制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 14L相比，当投放等量的活性时，对于两种洗涤剂和在所有洗涤剂浓度下，Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍的效率显著较高。同样，如果用量以所加入的蛋白质的量计算(图9B和图10B)，则用Fa_RF7182的去污效率最高。按实施例13中所述，还在更低的温度下用3.3g/l的液体洗涤剂浓度进行了洗涤。在10℃和20℃下，Fa_RF7182制备物显示优于市售制品Savinase

Ultra 14L、Purafect4000L和Properase4000E的优良性能(图15)。

除对棉或聚酯棉织物上的血/牛奶/墨水污渍以外，当在30℃下液体洗涤剂中测试时，Fa_RF7182丝氨酸蛋白酶有效去除例如草(Art.164，EMPA)和可可(Art.112，EMPA)等其它污渍。在ATLAS LP-2Launder-Ometer中进行处理。结果(图11)显示，Fa_RF7182在低温(如30℃)下有效地去除不同的污渍。

在液体基质洗涤剂存在下，在30℃下，在洗衣机中对在里氏木霉中产生的重组Fa_RF7182酶制备物的性能进行了实物测试(实施例11)，并与市售制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L进行了比较。用于测试副作用的8种不同蛋白酶敏感性示踪剂(tracer)见表5，处理条件见表6。用于测试试验的酶用量既以酶活性又以酶蛋白的量计算。图12和图13提供的对于不同污渍的结果表明，Fa_RF7182蛋白酶比市售酶制品更有效。Fa_RF7182对血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黄最有效(图13)。

正如从图5-11所观察的一样，测试材料的光亮度L^*在本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的存在下显著增加。与竞争产品相比，使用Fa_RF7182酶制备物，用相似的酶活性用量获得更好的光亮度，或者换句话说，与竞争产品相比，用较低的酶活性用量获得相似光亮度。

同样在实物试验中，在30℃下，使用液体洗涤剂和选择的蛋白酶敏感性示踪剂，对Fa_RF7182蛋白酶进行了测试(实施例11)。在这些测试中，当蛋白酶以活性量投放时，根据用8种不同的蛋白酶敏感性污渍(污渍1-8，表5)得到的结果总和，与市售蛋白酶制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 16L相比，用Fa_RF7182的总体去污效果显著较高(图12A)。Fa_RF7182尤其对血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黄有效(图13A-E)。

按照本发明的优选实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可用于实施例6-11所示的液体洗涤剂和粉状洗涤剂。可将本发明的酶或酶制备物配制成用于手工或机器洗衣店，或者可配制用于家居硬表面清洁，或优选用于手工或机器餐具洗涤操作。

实施例1.锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的产生和纯化

(a)锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的培养

从土壤样品分离出最初称为TUB F-2008的真菌菌株作为在碱性(pH 8.5)琼脂糖平板上生长的丝状真菌。按照包含在琼脂平板中的酪蛋白和血红蛋白的水解，该菌株产生蛋白酶活性。因为平板培养在8-10℃下进行，因此该结果表明，TUB F-2008产生在寒冷温度下起作用的蛋白酶。TUB F-2008被鉴定为锐顶镰孢菌Ellis & Everh(由Identification Services，Centralbureau Voor Schimmelcultures，P.O.Box85167，3508AD Utrecht，The Netherlands的Arthur de Cock鉴定)，并被重新命名为RF7182。使锐顶镰孢菌RF7182在马铃薯葡萄糖(PD)琼脂(Difco)上于+4℃生长、维持和形成孢子。对于酶产生，把RF7182斜面的孢子接种到含有以下的培养基中：30g/l玉米粉(细磨)、5g/l玉米浆粉、4g/l大豆粉(脱脂)、2g/l KH₂PO₄、1g/l NaCl和1g/l石蜡油。灭菌前用NaOH调节培养基的pH至8.5，将培养基于121℃高压灭菌30分钟。将50ml体积的微生物在振荡器(200rpm)上于28℃培养7天。当在不同pH值(pH 7-10)下进行活性测量时(按照实施例1c、5或14)，耗尽培养物上清液显示含有碱性蛋白酶活性。因为这种碱性活性，所以选择RF7182菌株为推定的蛋白酶基因供体菌株。

(b)锐顶镰孢菌RF7182培养基的蛋白酶的纯化

通过在+4℃下以50000g离心30分钟，从耗尽培养基中除去细胞和固体(Sorvall RC6 plus)。将50ml上清液用于蛋白酶的纯化。离心后，加入HCl调节上清液的pH至8.0。然后使上清液过滤通过0.44μm过滤器(MILLEX HV Millipore)，并加入在20mM Tris-HCl，pH 8中平衡的5mL Q Sepharose FF柱(GE Healthcare)中。收集流出流分，通过加入HCl将其pH降至7.5。将固体硫酸铵加入流出流分中，得到1M的最终盐浓度。然后将流出流分过滤通过0.44μm过滤器后，加入在20mM Tris-HCl-1M硫酸铵(pH 7.5)中平衡的苯基Sepharose HP(5mL)柱(GE Healthcare)。蛋白质用线性递减的硫酸铵梯度(1-0M)洗脱。收集5ml流分，按照生产商的指导，分析在pH 8.0下对试卤灵标记的酪蛋白(Boehringer Mannheim Biochemica)的蛋白酶活性。合并具有蛋白酶活性的流分，用10k膜(Amicon)超滤。将浓缩滤液加入用20mMTris-HCl-200mM NaCl(pH 7.5)平衡的Superdex 7510/300GL柱(GEHealthcare)中。蛋白质用相同的缓冲液洗脱，并收集0.5ml流分。分析这些流分的蛋白酶活性。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对具有蛋白酶活性的流分进行了分析。结果显示，流分含有分子量约为29kDa的一个主要蛋白质条带。合并所选择的流分。将合并的流分用于肽的制备(实施例2)。这种经纯化的锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶称为Fa_RF7182。

(c)蛋白酶活性测定

使用酪蛋白作为底物，通过酪蛋白Folin-Ciocalteau方法，测定了蛋白酶活性。通过分光光度监测的酸溶性片段随时间而变的释放，测定了由蛋白酶引起的酪蛋白降解率。用于该测定的酪蛋白底物如下制备：将6g酪蛋白Hammerstein Grade MP Biomedicals，LLC(101289)溶于500ml 100mM Tris、20μM CaCl₂、7μM MgCl₂、25μM NaHCO₃中。用HCl调节底物溶液的pH至9.0。用TCA溶液终止酶反应，TCA溶液在蒸馏水中含有：0.11M TCA、0.22M乙酸钠、0.33M乙酸、0.5Na₂CO₃。通过用蒸馏水将25ml 2N Folin-Ciocalteu苯酚试剂(SIGMA，F 9252)稀释成100ml，来制备用于测定的Folin试剂。通过首先将2.5ml底物溶液在指定温度下保温5分钟开始反应，之后加入0.5ml酶溶液，进行反应15分钟或30分钟。在15分钟或30分钟反应后，加入2.5ml反应终止溶液，将内容物混合后，在室温下静置30分钟。将管以4000rpm离心10分钟(Hettich Rotanta 460)。吸取1ml清澈的上清液，与2.5ml 0.5M Na₂CO₃和0.5ml稀释的Folin试剂混合。等待5分钟后(显色)，以酶空白对照为背景于660nm测定混合物的吸光度(颜色)。酶空白对照如下制备：将0.5ml酶溶液与2.5ml终止溶液和2.5ml底物混合，将混合物在指定温度下温育15分钟或30分钟。1单位的酶活性定义为释放出相当于1μg酪氨酸/ml(或g)反应混合物/分钟的酸溶性蛋白质水解产物的酶量。

实施例2.纯化的锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶的N端和内部氨基酸测序

为了测定内部序列，从聚丙烯酰胺凝胶上切下考马斯亮蓝染色条带，并基本上按Shevchenko等(1996)的描述进行“凝胶内(in-gel)”消化。蛋白质用二硫苏糖醇还原，并用碘乙酰胺烷基化后，用胰蛋白酶(Sequencing Grade Modified Trypsin(测序级改性胰蛋白酶)，V5111，Promega)消化。

除对于肽预浓缩使用150μm x 1.0mm捕获柱(3μm，

#222403，SGE Ltd UK)之外，基本上如先前所述(Poutanen等，2001)，使用与Ultimate nano液相色谱仪(LC-Packings，The Netherlands)连接的Q-TOF仪器(Micromass，Manchester，UK)，产生电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱用于从头测序。

对于N端序列分析，通过电印迹将SDS-P AGE/分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott；Perkin Elmer Applied BiosystemsDivision，Foster City，Calif.)上。用考马斯亮蓝染色后，取出目标蛋白质条带，并在Procise 494A蛋白质序列分析仪(Perkin Elmer AppliedBiosystems Division，Foster City，Calif.)上通过Edman降解进行N端序列分析。

从纯化的Fa_RF7182蛋白酶测定的N端和内部肽序列见表1。肽序列显示与已发表的来自EMBL保藏号XP_383491的玉蜀黍赤霉(禾本科镰孢)的假定蛋白酶序列同源。根据序列比较，所有所得到的肽序列都位于成熟Fa_RF7182蛋白的N端附近。

表1.由锐顶镰孢菌RF7182蛋白酶Fa_RF7182测定的N端和内部肽序列。

实施例3.编码Fa_RF7182蛋白的锐顶镰孢菌RF7182基因的克隆(a)DNA的分离和所采用的分子生物学方法

在大肠杆菌转化、测序等中，将标准分子生物学方法用于DNA的分离和酶处理(例如质粒DNA的分离、DNA的消化以产生DNA片段)。所采用的基本方法遵照酶、试剂或试剂盒生产商的描述或者遵照标准分子生物学手册(例如Sambrook和Russell(2001))中的描述。按照Raeder和Broda(1985)的详述，进行锐顶镰孢菌RF7182基因组DNA的分离。

(b)用于探针制备的引物

用于克隆编码Fa_RF7182蛋白的基因的探针通过PCR扩增。根据由纯化的RF7182得到的肽的氨基酸序列(表1)设计简并有义寡核苷酸，并使用从不同的已发表的S8型丝氨酸蛋白酶序列的选定共有区域，设计反义寡核苷酸。从与具有保藏号AAR11460(红色发癣菌(Trichophyton rubrum))、CAD24010(狗小孢霉(Microsporum canis))、AAT65816(Penicillium nordicum)、Q5NDC0(产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))和AAC27316(尖镰孢)的序列进行比对，测定保守序列区域。按照已发表的蛋白酶序列中的肽同源物的位置，选择PCR反应中引物的组合。引物序列见表2(SEQ ID NO：8-11)。

表2.在探针扩增中作为PCR引物合成的寡核苷酸(SEQ IDNO：8-11)。用于设计寡核苷酸序列的肽的Oligo、SEQ ID NO、oligo长度和简并性、寡核苷酸和氨基酸。

^(aR＝A或G，S＝C或G，W＝A或T，M＝A或C，Y＝T或C，N＝A、C、T或G；圆括号内的“s”＝有义链，圆括号内的“as”＝反义链。

^(b肽序列包括在表1中。

c)用于克隆的PCR反应和探针的选择

锐顶镰孢菌RF7182基因组DNA用作探针合成的模板。PCR反应混合物含有1x Phusion^TM GC缓冲液、0.25mM dNTP、5％DMSO、1μM各引物和2单位Phusion^TM DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)和约3μg基因组DNA/100μl反应体积。PCR反应条件如下：在98℃下初始变性1分钟，接着是在98℃下10秒钟、在48-58.5℃下退火30秒钟、在72℃下延伸30秒钟的29次循环，以及在72℃下最终延伸5分钟。引物组合PRO123(SEQ ID NO：8)和PRO61(SEQ ID NO：11)产生具有预期大小(从已发表的真菌蛋白酶序列计算)的特异性DNA产物。按照生产商的说明书(Invitrogen，USA)，将DNA产物从PCR反应混合物中分离并纯化，并克隆至pCR

4-TOPO载体。从该质粒(SEQID NO：12)测序753bp PCR片段。含有这种PCR扩增的DNA片段的pCR

4-TOPO

质粒称为pALK2530。包含质粒pALK2530的大肠杆菌菌株RF7803保藏在DSM保藏中心，保藏号DSM 22208。

PCR片段的推断氨基酸序列包括内部RF7182肽SEQ ID NO：1-7的序列。具有SEQ ID NO：6和7及肽SEQ ID NO：2的C端部分的肽与推断的氨基酸序列部分相匹配。具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5及肽SEQ ID NO：3的C端部分的肽完全匹配(表1)。这就证实了从PCR反应获得的DNA片段是编码Fa_RF7182蛋白的基因的部分，因此用作筛选锐顶镰孢菌RF7182基因组DNA的全长基因的探针。

(d)编码Fa_RF7182蛋白酶的锐顶镰孢菌RF7182基因的克隆

锐顶镰孢菌基因组DNA用若干用于DNA印迹分析的限制性内切酶消化。用包含质粒pALK2530的SEQ ID NO：12的771kb EcoRI片段作为探针进行杂交(实施例3c)。按照供应商的说明书(Roche，Germany)，通过使用洋地黄毒苷对上述探针进行标记。在65℃下进行杂交过夜。杂交后，在室温下将过滤器使用2x SSC-0.1％SDS洗涤2x 5分钟，接着使用0.1x SSC-0.1％SDS于65℃洗涤2x 15分钟。

可检测出锐顶镰孢菌RF7182基因组DNA消化物中的若干杂交片段。基因组SalI消化物含有大小约5kb的杂交片段。按照以已发表的真菌蛋白酶序列为基础的计算，单个杂交片段大小足够大以含有编码RF7182蛋白的全长基因。从杂交片段尺寸范围内的RF7182基因组SalI消化物分离出基因组DNA片段。将从琼脂糖凝胶分离出来的基因组片段克隆至用SalI切割的pBluescript II KS+(Stratagene，USA)载体上。将连接混合物转化至大肠杆菌XL10-Gold细胞(Stratagene)，并接种在含有50-100μg/ml青霉素的LB(Luria-Bertani)平板上。利用与作为探针的pALK2530插入片段的菌落杂交，筛选出大肠杆菌菌落的阳性克隆。如对于RF7182基因组DNA消化物所述进行杂交。从平板中收集若干明显的阳性克隆，用测序证实了一个为阳性。从5kb SalI插入片段对编码Fa_RF7182蛋白酶的全长基因(SEQ ID NO：13)测序，含有该插入片段的质粒称为pALK2531。包含质粒pALK2531的大肠杆菌菌株RF7879保藏在DSM保藏中心，保藏号DSM 22209。编码Fa_RF7182蛋白酶的基因称为Fa prtS8A。

(e)编码Fa_RF7182蛋白酶的基因的表征和推断的氨基酸序列

Fa prS8A序列(SEQ ID NO：13)和推断的氨基酸序列(SEQ IDNO：14)见图1A和图1B。基因的长度为1353bp(包括终止密码子)。发现长度为51bp和54bp的2个推定内含子(5′和3′边界序列，根据真菌内含子的边界序列，依照Gurr等，1987)。推断的蛋白质序列(SEQ IDNO：14)由415个氨基酸组成，包含预测的20个氨基酸的信号序列(SignalP V3.0；Nielsen等，1997及Nielsen和Krogh，1998)。推断的氨基酸序列中包含未包含在探针序列中的具有SEQ ID NO：1-3的肽的N端部分。具有SEQ ID NO：3的肽与推断的氨基酸序列完全匹配。对于成熟多肽，预测的分子量为28568.64Da，预测的pI为9.08。这些预测利用ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，2003)进行。推断的氨基酸序列在氨基酸Asn79位和Asn258位上含有2个可能的N-糖基化位点(图1)，但是按照CBS Server NetNGlyc V1.0，仅Asn79位(位于前肽上)的位点是可能的。

(f)同源性、同一性和比对研究

应用NCBI(National Center for Biotechnology Information(国立生物技术信息中心))的BLASTX程序2.2.9版，以默认设置，检索与已发表的蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。对于玉蜀黍赤霉(禾本科镰孢)(EMBL保藏号XP_383491)和Hypocrea lixii(哈茨木霉)丝氨酸内肽酶(serin endopeptidase)(EMBL保藏号CAL25508)的假定蛋白质有最高同源性。还发现与专利申请US 60/818,910(CatalystBiosciences Inc.)中包括的序列即该申请中的SEQ ID 313有同源性。将RF7182成熟氨基酸序列与上述同源成熟氨基酸序列进行了比对。应用ClustalW比对(www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw；矩阵：BLOSUM，空位开放：10，空位延伸：0.5，EMBL-EBI)得到的同一性值见表3。

表3.由推断的Fa_RF7182蛋白酶氨基酸序列的ClustalW比对得到的同一性值(％)。对不包括信号肽和前肽的成熟氨基酸序列进行了比对。矩阵：BLOSUM，空位开放：10，空位延伸：0.5，EMBL EBI。玉蜀黍赤霉，XP 383491；哈茨木霉，CAL25508；US 60/818,910，该申请中的SEQ ID NO：313。

	Fa_RF7182	玉蜀黍赤霉	哈茨木霉	US 60/818,910
					Fa_RF7182	100	80	79	76
玉蜀黍赤霉		100	78	76
					哈茨木霉			100	94
US 60/818,910				100

实施例4.里氏木霉中重组Fa_RF7182的产生

(a)制备生产(宿主)载体

构建表达质粒pALK2536用于在里氏木霉中产生重组RF7182蛋白酶。具有其自身信号序列的Fa prtS8A基因通过PCR与里氏木霉cbh1(cel7A)启动子准确融合。通过BamHI(在PCR中在终止密码子之后产生的位点)将Fa prtS8A基因片段从其3′端切割下来。这使得在构建体中在cbh1终止子序列前不留下原始的Fa prtS8A终止子。将amdS标记基因加到包括cbh1启动子、Fa prtS8A基因和cbh1终止子的构建中。构建类似于Paloheimo等(2003)的描述，8.7kb线性表达盒见图2。在EcoRI消化后将表达盒从载体骨架中分离出来，并用于转化里氏木霉原生质体。所采用的宿主菌株不产生4种主要里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)的任一种。按照

等人(1987)所述，并按Karhunen等人(1993)描述的改进，来进行转化。通过单个分生孢子在选择平板上纯化出转化体，然后使它们在PD上形成孢子。

(b)摇瓶和实验室规模生物反应器中的蛋白酶生产

于pH 6.0下，将转化体从PD斜面接种到装有50ml用5％KH₂PO₄缓冲的基于复合乳糖的纤维素酶诱导培养基(complex lactose-basedcellulase inducing medium)(Joutsjoki等，1993)的摇瓶中。在30℃、250rpm下使转化体生长7天后，从培养物上清液分析转化体的蛋白酶产生。在SDS-PAGE凝胶中，从耗尽培养物上清液中检出相当于重组Fa_RF7182蛋白酶的约29kDa的主要蛋白质条带。按实施例1c或14中所述，使用酪蛋白作为底物分析蛋白酶活性。从培养物上清液中测出，与宿主相比活性显著提高。通过利用其中包括若干基因组消化物且表达盒用作探针的DNA印迹分析，从选定的转化体中证实了将表达盒整合至真菌基因组中。

选出在摇瓶培养中产生最佳蛋白酶活性的里氏木霉转化体在实验室规模的生物反应器中培养。纤维素酶诱导复合培养基用于培养。将从培养中得到的耗尽培养基用于应用测试(实施例6-11)，并用作重组Fa_RF7182蛋白酶的纯化和进一步表征的起始原料。

实施例5.重组Fa_RF7182蛋白酶的纯化和表征

通过在+4℃下以50000g离心30分钟(Sorvall RC6 plus)，从由发酵得到的耗尽培养基(实施例4)中除去细胞和固体。使用15ml上清液纯化蛋白酶。所有纯化步骤在冷室中进行。离心后，将样品过滤通过0.44μm过滤器(MILLEX HV Millipore)后，加到在20mM Tris pH 8.5中平衡的HiPrep 26/10脱盐柱(得自GE Healthcare)上。将凝胶过滤样品加到在20mM Tris pH 8.5中平衡的20mL Q Sepharose FF柱(得自GE Healthcare)中。收集流出流分，在12％SDS PAGE凝胶上进行分析(图3)。该酶样品用于pH和温度曲线图的表征。

温度曲线图

通过采用实施例1c或14中描述的测定，用15分钟反应时间，在pH 9下得到Fa_RF7182蛋白酶的温度曲线图。结果见图4A。蛋白酶的最适温度约为50℃。

pH曲线图

按实施例1c或14中所述，在50℃下，使用酪蛋白作为底物测定蛋白酶的pH曲线图。用40mM Britton-Robinson缓冲液调节反应物的pH至pH 6-12，反应时间为15分钟。使用含有0.22M乙酸钠和0.33M乙酸的0.11M TCA溶液终止酶反应。结果见图4B。自pH 6到pH 9，重组Fa_RF7182蛋白酶的相对活性超过85％。纯化的重组Fa_RF7182蛋白酶的pH曲线图与按实施例1a中所述纯化的野生型Fa_RF7182蛋白酶的pH曲线图相当。

实施例6.在pH 9缓冲液中在不同温度下重组蛋白Fa_RF7182的性能

在30℃和50℃温度下，测试了在木霉属产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)去除血/牛奶/墨水标准污渍(Art.116，100％棉，EMPA Testmaterialen AG，Swizerland)的能力。市售蛋白酶制品Savinase

Ultra 16L(Novozymes)和Purafect

4000L(Genencor International)和无酶处理(对照)用于比较。首先将污渍织物切成1.5cm x 1.5cm污样，切掉边角使污样片更圆。将污样片放入微量滴定板(Nunc 150200)的各孔中。向直径为2cm的各孔中，在织物上边加入1.5ml在甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9)中的酶稀释液。各种酶的投放量为0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/1.5ml缓冲液。按实施例1(c)或14中所述，用30分钟反应时间测定活性，并在加入稀释的Folin试剂后将10分钟时间用于显色。将有样品的微量滴定板在水平振荡器中在30℃和50℃下以125rpm温育60分钟。之后将污样在流水(约45℃)下仔细冲洗，并在室内空气下在网格上避光干燥过夜。

通过利用L^*a^*b^*色空间坐标系的Minolta CM 2500分光光度计(光源D65/2°)以反射值测定颜色，评估去污效果。在处理后，测量了污样两边的颜色。各个值为从织物两边测定的至少2个平行织物样品的平均值。以ΔL^*计算表明蛋白酶性能(去污效率)的血/牛奶/墨水污渍的褪色，ΔL^*是指酶处理织物的光亮度值L^*减去用不含酶洗涤液(缓冲液)处理织物(酶空白对照、对照)的光亮度值L^*。

结果见图5和图6。与市售蛋白酶制品SavinaseUltra 16L和Purafect

4000L相比，尤其在30℃下在pH 9缓冲液中，Fa_RF7182蛋白酶制备物显示显著较高的去污能力。

实施例7.在40℃和pH 10下在粉状洗涤剂条件下的重组蛋白Fa_RF7182的性能

在含磷酸盐的参比洗涤剂存在下，在40℃下(pH约10)，测试了木霉产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)去除血/牛奶/墨水标准污渍的能力。标准污渍Art.117(血/牛奶/墨水，聚酯+棉，EMPA)用作试验材料。商用蛋白酶Purafect

4000L和无酶处理(对照)用于比较。各种酶按0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/ml洗涤液的量投放。按实施例6中所述对活性进行了测定。

将量为3.3g的无光学增亮剂的含磷酸盐的ECE参比洗涤剂77(Art.601，EMPA)溶于1升自来水(dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合，并调节至40℃。如实施例6中所述将污渍织物切成片。将污样放入微量滴定板(Nunc 150200)的各孔中，将1.5ml含有洗涤剂和酶在水(低于70μl)中的稀释液的洗涤液加到织物上边。将有样品的板在水平振荡器中于40℃以125rpm温育60分钟。之后将污样在流水(约45℃)下仔细冲洗，并在室内空气下在网格上避光干燥过夜。

按实施例6中所述，用Minolta CM 2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系，测定了处理后的污样颜色，以ΔL^*计算去污效果。

结果(图7)表明，蛋白酶Fa_RF7182还适用于极碱性条件下的粉状洗涤剂。在40℃下，性能类似于商用蛋白酶Purafect

4000L的性能。

实施例8.在40℃下在液体洗涤剂条件下重组蛋白Fa_RF7182的性能

在40℃和pH约7.9下，在不含酶的液体洗涤剂Ariel Sensitive(Procter & Gamble，England)存在下，测试在木霉中产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)去除血/牛奶/墨水标准污渍的能力。标准污渍、人为污染试验布料Art.117(血/牛奶/墨水，聚酯+棉，EMPA)用作试验材料。市售蛋白酶制品Purafect

4000L和SavinaseUltra16L及无酶处理(对照)用于比较。各种酶以0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/ml洗涤液的量投放。按实施例6中所述对活性进行了测定。

将量为3.3g的Ariel Sensitive溶于1升自来水(dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合，并调节至40℃。如实施例6中所述，将污渍织物切成片。将污样放入微量滴定板(Nunc 150200)的各孔中，将1.5ml含有洗涤剂和酶在水(＜70μl)中的稀释液的洗液加到织物上边。将有样品的板在水平振荡器中以125rpm于40℃温育60分钟。之后仔细地在流水(约45℃)下冲洗污样，并在室内空气下在网格上避光干燥过夜。

按实施例6中所述，用Minolta CM2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系，测定处理后的污样颜色，以ΔL^*计算去污效果。

根据图8所示结果，在40℃下在液体洗涤剂条件下Fa_RF7182具有优良性能。当投放等量的蛋白酶活性时，与市售制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 14L相比，Fa_RF7182对血/牛奶/墨水/污渍(聚酯+棉)的效率显著较高。4-8单位市售酶/ml液体的用量等于约0.2-0.5％酶制备物/洗涤剂重量的用量，这是洗涤剂酶的通常使用水平。

实施例9.30℃下在不同液体洗涤剂浓度条件下重组蛋白Fa_RF7182的性能

在30℃下，测试了在木霉中产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)在1-5g/l浓度的液体洗涤剂条件下去除血/牛奶/墨水标准污渍的能力。不含酶的Ariel Sensitive(Procter & Gamble，England)和含有25％洗涤活性物质、多元醇和聚合物的彩色织物液体基质洗涤剂(表4)用作洗涤剂，标准污渍Art.117(血/牛奶/墨水，棉+聚酯，EMPA)用作试验材料。市售蛋白酶制品Purafect

4000L、Savinase

Ultra 16L和无酶处理(对照)用于比较。各种酶以0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/ml洗涤液的量投放。按实施例6中所述对活性进行了测定。

表4.用于彩色织物的液体基质洗涤剂的组成

成分	％
		NaLES(月桂基乙醚硫酸钠)	4.9
非离子型C12-157EO(环氧乙烷)	15
		Na皂(Palm Kernel FA)	4.4
椰子葡糖苷(Coco Glucoside)	1
		<总表面活性剂>	<25.30>
多元醇(甘油)	5
		磷酸盐(32％)(ThermPhos)	2
PVP-Sokalan HP 53(BASF)	1
		Sokalan PA 15(BASF)	1.56
Sorez-100(ISP)	0.4
		水加至100％

将量为1g、3.3g和5g的液体洗涤剂溶于1升自来水(dH≤4)，用磁力搅拌器充分混合，并调节至30℃。含基质洗涤剂的洗涤液中的pH为约7.3-7.5，或含Ariel的洗涤液中的pH约7.6-8.0，这取决于洗涤剂浓度。如实施例6中所述，将污渍织物切成片。将污样放入微量滴定板(Nunc 150200)的各孔中，将1.5ml含有洗涤剂和酶在水(低于70μl)中的稀释液的洗涤液加到织物上边。将有样品的板在水平振荡器中以125rpm于30℃温育60分钟。之后将污样在温热的流水下仔细/彻底冲洗，并在室内空气下在网格上避光干燥过夜。

并按实施例6中所述，用Minolta CM 2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系，测定了处理后的污样颜色，以ΔL^*计算去污效果。

用彩色织物基质洗涤剂获得的结果见图9A-D，用Ariel Sensitive获得的结果见图10A-D。当投放相同活性量时，与市售制品Purafect

4000L和SavinaseUltra 14L相比，对于两种洗涤剂和在所有洗涤剂浓度下，Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍的效率显著较高。同样，如果用量以所添加的蛋白质的量计算(图9B和10B)，则用Fa_RF7182的去污效率最高。使用牛丙种球蛋白(Bio-Rad)作为标准品，通过Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，测定酶制备物中蛋白质的量。这些测试的结果表明，Fa_RF7182蛋白酶在液体洗涤剂条件下在低温(如30℃)下具有优良性能。

实施例10.30℃下在液体洗涤剂条件下重组蛋白Fa_RF7182对不同污渍的效率(Launder Ometer)

在30℃下，测试了木霉产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)在液体洗涤剂条件下去除不同污渍的能力，并与市售蛋白酶制品Purafect

4000L和/或Savinase

Ultra 16L进行了比较。使用下列人为污染的来源于EMPA的试验布料：血/牛奶/墨水Art.117(聚酯+棉)、血/牛奶/墨水Art.116(棉)、草Art.164和可可Art.112。将织物切成9cm x 12cm污样，通过曲折缝线(zig-zag stitches)修整边缘。洗涤剂与实施例9中所述洗涤剂相同。

在LP-2 Launder Ometer中如下进行去污处理。先将LaunderOmeter预热至30℃。将450ml含有5g洗涤剂/升自来水(dH≤4)的调和洗涤液和酶稀释液加入装有污渍Art.116和117或污渍Art.164和Art.112的容器中。酶以0、1和/或2、5、10活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/ml洗涤液的量与血/牛奶/墨水污渍一起投放，以及以0、5、10和20活性单位(μmol酪氨酸/分钟)/ml的洗涤液的量与草和可可一起投放。按实施例6中所述，对活性进行了测定。Launder Ometer在30℃、约pH 7.5下运行60分钟。之后将污样在流水(约20℃)下仔细冲洗，并在室内空气下在网格上避光干燥过夜。

按实施例6中所述，用Minolta CM 2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系，测定处理后的污样颜色，以ΔL^*计算去污效果。各值为至少20次测量/污样的平均值。测量要避开因为织物(棉污渍Art.116和Art.112)中折叠而在处理期间形成的折痕。

用彩色织物基质洗涤剂(5g/l)得到的结果(图11A-D)表明，与市售制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L相比，当投放相同量的蛋白酶活性时，在30℃下Fa_RF7182对血/牛奶/墨水、草和可可污渍的效率显著较高。10单位市售酶/ml洗涤液的用量等于约0.4％酶制备物/洗涤剂重量的用量，这是洗涤剂酶的通常使用水平。这些测试的结果表明Fa_RF7182蛋白酶在低温(如30℃)下对若干污渍是有效的。

实施例11.在实物洗涤试验中对30℃液体洗衣洗涤剂中重组蛋白Fa_RF7182的性能的评价

在实物试验中，测试了洗衣机内30℃液体洗涤剂中木霉产生的重组蛋白Fa_RF7182制备物(按实施例4中所述)的性能，并与市售蛋白酶制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 16L及用不含酶的洗涤剂的处理进行了比较。使用按实施例9中所述的彩色织物液体基质洗涤剂和8种不同的蛋白酶敏感性示踪剂(表5)。另外，每次洗涤将两块压载污物(ballast soil)(CFT-SBL)装入洗衣网袋以避免因与其它污样接触而污染。示踪剂来自CFT(Center For Testmaterials BV，The Netherlands)。将污渍污样10cm x 10cm缝成厨房擦拭巾。表6中描述了处理参数和条件。以酶活性(约0-14活性单位/ml洗涤液)和以蛋白质量(约0-2.5mg/升洗涤液)计算用于试验的酶用量。按实施例6和9中所述，测定制备物的蛋白酶活性和蛋白质含量。

表5.用于测试的蛋白酶敏感性示踪剂。

表6.处理参数和条件

根据用Datacolor-分光光度计与UV滤光片测量R 457nm的反射度(发光(remission))，来评价去污效果，并计算为百分比去污效果(％SR)：

将结果计算为Δ％SR(delta％SR)，其表示酶处理织物的％SR减去无酶处理(仅洗涤剂)的％SR。

用各种用量的酶进行2次每种污渍含有2个污样的洗涤，每个污渍污样测定了3次测量值，使得值以12次测量/污渍/产品为基础。

总去污效率(delta％SR)的结果见图12A-B和图13A-E。当蛋白酶以活性量投放时，与市售蛋白酶制品Purafect

4000L和Savinase

Ultra 16L相比，用Fa_RF7182的总体去污效果显著较高，总体去污效果以用8种不同蛋白酶敏感性污渍(污渍1-8，表5)获得的结果的总和为基础(图12A)。Fa_RF7182尤其对血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黄有效(图13A-E)。

在不同机器的重复中，普通的去垢力示踪剂(颜料/油)用作对照。未观察到各个测试之间的差异。

实施例12.在10℃-60℃温度下在pH 9缓冲液中重组蛋白Fa_RF7182的性能

在10℃-60℃的温度下，测试了在木霉中产生重组蛋白Fa_RF7182(按实施例4中所述)去除血/牛奶/墨水标准污渍(Art.117，聚酯+棉，EMPA Testmaterialen AG，Swizerland)的能力。市售蛋白酶制品SavinaseUltra 16L、Purafect

4000L和Properase

4000E和无酶处理(对照)用于比较。按实施例6中所述，在pH 9缓冲液中进行了测试，除了温育温度范围更广、污染材料不同以及污样冲洗水的温度与洗涤温度相似。按实施例6中所述，用Minolta CM 2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系，测定了处理后污样的颜色，并以ΔL^*计算去污效果。

结果见图14A-F。与市售蛋白酶制品Savinase

Ultra 16L和Purafect

4000L和Properase

4000E相比，尤其在10℃-40℃的最低温度下，在pH 9缓冲液中，Fa_RF7182蛋白酶制备物的去污能力显著较高。

实施例13.在冷洗涤温度(10℃和20℃)下在液体洗涤剂条件下重组蛋白Fa_RF7182的性能

在低温下，测试了在木霉中产生重组蛋白Fa_RF7182(按实施例2中所述)在液体基质洗涤剂条件下去除血/牛奶/墨水标准污渍(Art.117，棉+聚酯，EMPA)的能力。测试方法类似于实施例9，仅除了使用3.3g/l的洗涤剂浓度，和更低的保温温度10℃和20℃。污样冲洗水的温度与洗涤温度类似。

按实施例6中所述，用Minolta CM 2500分光光度计，利用L^*a^*b^*色空间坐标系测定处理后污样的颜色，按ΔL^*计算去污效果。对于无酶处理(酶空白对照)，洗涤剂溶液用作洗涤液。

在10℃和20℃下用3.3g/l的液体基质洗涤剂浓度得到的结果见图15A和B。当投放相同活性量时，与市售制品SavinaseUltra 16L、Purafect

4000L和Properase

4000E相比，在10℃和20℃两者下，Fa_RF7182对血/牛奶/墨水污渍的效率显著较高。这些测试的结果表明，在非常低的洗涤温度下，Fa_RF7182蛋白酶在液体洗涤剂条件下具有优良性能。

实施例14.蛋白酶活性测定II

使用酪蛋白作为底物，通过酪蛋白Folin-Ciocalteau方法测定了蛋白酶活性。通过分光光度监测酸溶性片段随时间变化的释放，对酪蛋白被蛋白酶降解的速率进行了测定。用于该测定的酪蛋白底物如下制备：将6g酪蛋白Hammerstein Grade MP Biomedicals，LLC(101289)溶于500ml的30mM Tris、2.0mM CaCl₂、0.7mM MgCl₂、2.5mMNaHCO₃中。调节底物溶液的pH至8.5。使用0.11M TCA溶液终止酶反应。通过用蒸馏水将25ml 2N Folin-Ciocalteu苯酚试剂(SIGMA，F 9252)稀释至100ml，来制备用于该测定的Folin试剂。首先将2.5ml底物溶液在50℃下温育5分钟开始反应，之后加入0.5ml酶溶液，使反应进行30分钟。30分钟反应后，加入2.5ml反应终止溶液，将内容物混合后，在室温下静置30分钟。将管以4000rpm离心10分钟(Hettich Rotanta 460)。将1ml澄清的上清液与2.5ml 0.5M Na₂CO₃和0.5ml稀释的Folin试剂混合。等待至少5分钟(显色)后，以酶空白对照为背景于660nm测定混合物的吸光度(颜色)。酶空白对照如下制备：将0.5ml酶溶液与2.5ml终止溶液和2.5ml底物混合，将混合物在50℃下温育30分钟。1单位的酶活性定义为释放相当于1μg酪氨酸/ml(或g)反应混合物/分钟的酸溶性蛋白质水解产物的酶量。

参考文献

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶可获自锐顶镰孢菌。

3.权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。

4.权利要求1-3中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶的成熟形式的分子量介于20kDa和35kDa之间。

5.权利要求1-4中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在pH 9下用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物的最适温度为30℃-70℃。

6.权利要求1-5中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在50℃下用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物的最适pH为至少pH 6-pH 12的pH范围。

7.权利要求1-6中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在洗涤剂存在下在10℃和60℃之间能够降解和去除蛋白质污渍。

8.权利要求1-7中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与质粒pALK2530中所包含的多核苷酸序列杂交，所述质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO：12、保藏于保藏号DSM 22208的大肠杆菌RF7803中。

9.权利要求1-8中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列编码包含SEQ IDNO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列的多肽。

10.权利要求1-9中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：18中表征的氨基酸序列的多肽。

11.权利要求1-10中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO：17的分离核酸分子编码。

12.权利要求1-11中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由pALK2531中所包含的多核苷酸序列编码，所述pALK2531保藏于保藏号DSM 22209的大肠杆菌RF7879中。

13.权利要求1-12中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由重组表达载体产生，所述载体包含与能够指导丝氨酸蛋白酶编码基因在合适的宿主中表达的调节序列有效连接的编码权利要求1-12中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子。

14.权利要求1-13中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在异源宿主中产生。

15.权利要求1-14中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在微生物宿主中产生。

16.权利要求1-15中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在以下宿主中产生：木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属。

17.权利要求16的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在木霉属或曲霉属中产生。

18.权利要求17的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在里氏木霉中产生。

19.一种选自以下的编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子：

(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO：18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；

(b)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与SEQ ID NO：18的氨基酸序列有至少81％同一性的多肽的核酸分子；

(c)包含SEQ ID NO：13所述核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(e)其编码序列由于遗传密码简并性而与(c)-(d)中任一项的核酸分子的编码序列不同的核酸分子；和

(f)在严格条件下与DSM 22208中所包含的核酸分子杂交，并编码具有丝氨酸蛋白酶活性和与SEQ ID NO：18所述氨基酸序列显示至少81％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

20.一种重组表达载体，其包含权利要求19的核苷酸序列，所述核苷酸序列与能够在合适的宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因的调节序列有效连接。

21.一种宿主细胞，其包含权利要求20的重组表达载体。

22.权利要求21的宿主细胞，其特征在于所述宿主是微生物宿主。

23.权利要求21或22的宿主细胞，其特征在于所述宿主是丝状真菌。

24.权利要求21-23中任一项的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属的宿主。

25.权利要求24的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属或曲霉属。

26.权利要求25的宿主细胞，其特征在于所述宿主是里氏木霉。

27.一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养权利要求21-26中任一项的宿主细胞并回收所述多肽的步骤。

28.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其由权利要求19的核酸序列编码，并可通过权利要求27的方法获得。

29.一种用于获得酶制备物的方法，所述酶制备物包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述方法包括培养权利要求21-26中任一项的宿主细胞以及从所述细胞中回收所述多肽或由培养基分离细胞并得到上清液的步骤。

30.一种可通过权利要求29的方法获得的酶制备物。

31.一种酶制备物，其包含权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶。

32.权利要求30或31的酶制备物，其特征在于所述制备物包含选自以下含有或不含介质的其它酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶。

33.权利要求30-32中任一项的酶制备物，其特征在于所述制备物包含选自以下的合适添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、介质、防腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光学增亮剂、染料、颜料和防腐剂。

34.权利要求30-33中任一项的酶制备物，其特征在于所述酶制备物呈液体、粉末或颗粒的形式。

35.权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶或权利要求30-34中任一项的酶制备物用于洗涤剂、用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食品或饲料或者用于包括改变、降解或去除蛋白质物质的任何应用的用途。

36.权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶或权利要求30-34中任一项的酶制备物作为洗涤剂添加剂的用途。

37.权利要求36的用途，所述用途用于液体洗涤剂。

38.权利要求36的用途，所述用途用于粉状洗涤剂。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

        根据“专利合作条约第19条”所作的修改的说明

中国知识产权局专利局PCT处：

Re：国际申请号：PCT/EP2010/055894

国际申请日：2010年4月30日

我公司卷号：CPCH1163032P

申请人根据“专利合作条约第19条”的有关规定，对本国际申请的权利要求书作了如下修改：

原权利要求书第29项作了修改，其余未作变动。特此说明。

随函附上原权利要求书全文替换页1份4页及修改手稿1份。

    此致

敬礼！

Claims (38)

1.一种真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶可获自锐顶镰孢菌。

3.权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。

4.权利要求1-3中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶的成熟形式的分子量介于20kDa和35kDa之间。

5.权利要求1-4中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在pH 9下用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物的最适温度为30℃-70℃。

6.权利要求1-5中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在50℃下用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物的最适pH为至少pH 6-pH 12的pH范围。

7.权利要求1-6中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在洗涤剂存在下在10℃和60℃之间能够降解和去除蛋白质污渍。

8.权利要求1-7中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在严格条件下与质粒pALK2530中所包含的多核苷酸序列杂交，所述质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO：12、保藏于保藏号DSM 22208的大肠杆菌RF7803中。

9.权利要求1-8中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列编码包含SEQ IDNO：18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18限定的成熟Fa_RF7182的氨基酸序列有至少81％同一性的氨基酸序列的多肽。

10.权利要求1-9中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的核酸分子编码，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：18中表征的氨基酸序列的多肽。

11.权利要求1-10中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO：17的分离核酸分子编码。

12.权利要求1-11中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由pALK2531中所包含的多核苷酸序列编码，所述pALK2531保藏于保藏号DSM 22209的大肠杆菌RF7879中。

13.权利要求1-12中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由重组表达载体产生，所述载体包含与能够指导丝氨酸蛋白酶编码基因在合适的宿主中表达的调节序列有效连接的编码权利要求1-12中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶的核酸分子。

14.权利要求1-13中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在异源宿主中产生。

15.权利要求1-14中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在微生物宿主中产生。

16.权利要求1-15中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在以下宿主中产生：木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属。

17.权利要求16的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在木霉属或曲霉属中产生。

18.权利要求17的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在里氏木霉中产生。

19.一种选自以下的编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离核酸分子：

(a)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO：18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；

(b)编码具有丝氨酸蛋白酶活性且与SEQ ID NO：18的氨基酸序列有至少81％同一性的多肽的核酸分子；

(c)包含SEQ ID NO：13所述核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的编码序列的核酸分子；

(e)其编码序列由于遗传密码简并性而与(c)-(d)中任一项的核酸分子的编码序列不同的核酸分子；和

(f)在严格条件下与DSM 22208中所包含的核酸分子杂交，并编码具有丝氨酸蛋白酶活性和与SEQ ID NO：18所述氨基酸序列显示至少81％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

20.一种重组表达载体，其包含权利要求19的核苷酸序列，所述核苷酸序列与能够在合适的宿主中指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因的调节序列有效连接。

21.一种宿主细胞，其包含权利要求20的重组表达载体。

22.权利要求21的宿主细胞，其特征在于所述宿主是微生物宿主。

23.权利要求21或22的宿主细胞，其特征在于所述宿主是丝状真菌。

24.权利要求21-23中任一项的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、金孢子菌属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢霉属的宿主。

25.权利要求24的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属或曲霉属。

26.权利要求25的宿主细胞，其特征在于所述宿主是里氏木霉。

27.一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养权利要求21-26中任一项的宿主细胞并回收所述多肽的步骤。

28.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其由权利要求19的核酸序列编码，并可通过权利要求27的方法获得。

29.一种用于获得酶制备物的方法，所述方法包括培养权利要求21-26中任一项的宿主细胞以及从所述细胞中回收多肽或由培养基分离细胞并得到上清液的步骤。

30.一种可通过权利要求29的方法获得的酶制备物。

31.一种酶制备物，其包含权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶。

32.权利要求30或31的酶制备物，其特征在于所述制备物包含选自以下含有或不含介质的其它酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶。

33.权利要求30-32中任一项的酶制备物，其特征在于所述制备物包含选自以下的合适添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、介质、防腐蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、光学增亮剂、染料、颜料和防腐剂。

34.权利要求30-33中任一项的酶制备物，其特征在于所述酶制备物呈液体、粉末或颗粒的形式。

35.权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶或权利要求30-34中任一项的酶制备物用于洗涤剂、用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食品或饲料或者用于包括改变、降解或去除蛋白质物质的任何应用的用途。

36.权利要求1-18中任一项的丝氨酸蛋白酶或权利要求30-34中任一项的酶制备物作为洗涤剂添加剂的用途。

37.权利要求36的用途，所述用途用于液体洗涤剂。

38.权利要求36的用途，所述用途用于粉状洗涤剂。

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