CN102585034A - 果胶磺化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果胶磺化的方法，由果胶或者三乙胺果胶盐在二甲亚砜的环境下，由三氧化硫-吡啶复合物磺化，制得磺化果胶多糖。本发明的方法采用以下两种体系：三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系、TBA-三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系。本发明的方法具有操作较为简单、磺化效果较好等特点。利用本方法制备而得的磺化果胶多糖，在反应过程中降解小，副反应少，具有较好的抗凝血、抗肿瘤和抗病毒活性，应用范围很广。

Description

果胶磺化的方法

技术领域

本发明涉及一种果胶磺化的方法，属于高分子领域。该类磺化果胶多糖有显著的抗凝血活性。作为药物开发、保健品研发等都有较好的前景。

背景技术

磺化多糖是多糖分子中某些羟基被硫酸酯基取代而形成的一类带有负电荷的生物大分子，广泛存在于自然界的各种生物体中，具有广泛的生物活性。随着研究的深入，人们发现多数硫酸多糖具有显著的抗凝血、抗肿瘤和抗病毒等活性(Smorenburg等人，2001；Mao，W.等人，2009；Huashi，C.，1988)。目前，国内外对酸性多糖的研究主要集中在海洋领域，如海带岩藻聚糖硫酸酯，海参中的酸性粘多糖，绿藻酸性多糖等；以及动物体内的肝素，硫酸软骨素等，但是对陆生植物中酸性多糖的结构和活性研究尚未引起重视。而果胶多糖是一类以重复的聚半乳糖醛酸为主链的酸性多糖，其结构与海洋药物藻酸双酯钠(PSS)(Smorenburg等人，2001)的主要差别为其糖环羟基上未被硫酸基取代，而目前国内外有关其磺化化修饰方法及酯化后产物仍少有报道，而开展这方面的工作对进一步提高果胶产品的保健和医疗价值具有重要的意义。

磺化多糖同时是肝素替代药物重要来源。肝素用于预防和治疗血栓性疾病已有数十年的历史，但由于较大的出血副作用而限制了其临床应用。而且近年来发生的肝素污染事件也迫使人们寻找新的肝素类候选药物。当前研究者更有兴趣从非哺乳动物来源制备治疗性药物，以减少病原体污染的危险性，而天然酸性多糖是肝素类候选药物的重要来源。

管华诗等对海藻中的褐藻酸钠分子的羟基及羧基上分别引入硫酸酯基及丙二醇酯基所形成的藻酸双酯钠(Propylene Glycol Alginate Sulphate Sodium，PSS)，进一步研究表明其磺化衍生物具有良好的抗凝血、降血脂和抗血栓活性。同样类似的，甘糖酯(Propyleneglycol mannuronate sulfate，PGMS)是聚甘露糖醛酸磺化的衍生物，已作为防治心脑血管疾病的新药在临床上使用多年。赵峡等发现褐藻中另一种多糖聚古罗糖醛酸经硫酸化后在抗凝血和尿路结石症的预防和治疗方面显示出了良好的应用前景。陈士国等的研究则发现，岩藻糖基化的美国肉参硫酸软骨素在抗凝、抑制血栓生成方面活性甚至由于肝素，且其出血副作用低于肝素。赵雪等对海带中的硫酸化岩藻多糖和及其低分子量产物的研究也表明不同分子量海带硫酸岩藻多糖均具有抗凝活性，且分子量越大，硫酸根含量越高，抗凝效果越好。而同样作为酸性多糖的果胶与这些果糖相比，具有复杂的毛发支链区，只是支链未发生磺化。

国内外对多糖的磺化方法主要包括氯磺酸-吡啶法，浓硫酸法，三氧化硫吡啶法等。

现国内外对果胶的磺化方面的研究还没成熟，资料也相对较少。相比于传统抗凝血药物，磺化果胶在抗肿瘤，免疫调节活性，凝血性方面表现不仅更为优越，并且可以减少传统抗凝血剂的一系列如出血、过敏反应、血小板减少、潜在的人畜疾病传播等等副作用。果胶磺化多糖有着很大的开发潜力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种果胶磺化的方法，该方法是以果胶多糖为原料，制备出相应的磺化果胶多糖；该方法具有操作较为简单、磺化效果较好等特点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种果胶磺化的方法，由果胶(果胶多糖)或者三乙胺果胶盐在二甲亚砜的环境下，由三氧化硫-吡啶复合物磺化，制得磺化果胶多糖。

作为本发明的果胶磺化的方法的改进，采用三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系，包括以下步骤：

1)、制备磺化试剂：按照2～5g三氧化硫-吡啶复合物/10ml的二甲亚砜的用量比，将三氧化硫-吡啶复合物溶解于二甲亚砜中，得磺化试剂；

2)、称取果胶放入二甲亚砜中搅拌溶胀，得果胶悬浮液；所述果胶与二甲亚砜的料液比为：10～40mg果胶/1ml二甲亚砜；

3)、在60～100℃的水浴条件下，按照步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物与步骤2)中的果胶为10∶0.9～1.1的质量比，将磺化试剂加入果胶悬浮液中，反应1～3h；

4)、将步骤3)所得的反应产物滴加(缓慢)于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸馏水中透析20～30小时；

5)、将步骤4)所得的截留产物冷冻干燥，得磺化果胶多糖。

作为本发明的果胶磺化的方法的进一步改进：

步骤2)的搅拌时间为0.5～24h；

步骤4)为：将步骤3)所得的反应产物冷却至室温后滴加于5～10体积倍的冰水中；所述透析袋的截留分子量为7000Da。

作为本发明的果胶磺化的方法的另一种改进：采用TBA-三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系，包括以下步骤：

1)、制备磺化试剂：按照2～5g三氧化硫-吡啶复合物/1ml的二甲亚砜的用量比，将三氧化硫-吡啶复合物溶解于二甲亚砜中，得磺化试剂；

2)、按照10～30mg果胶/1ml的超纯水的料液比，称取果胶放入超纯水中，搅拌溶胀，使果胶完全溶解；得果胶溶液；

将上述果胶溶液过凝胶(过滤)层析柱，取分离后的果胶于培养皿中，用三乙胺滴定至pH为6.0-6.5，冷冻干燥，得三乙胺果胶盐；

3)、将步骤2)所得的三乙胺果胶盐放入二甲亚砜中，搅拌溶胀，制成果胶悬浮液；所述三乙胺果胶盐与二甲亚砜的料液比为：20～40mg的三乙胺果胶盐/1ml二甲亚砜；

4)、按照步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物与步骤2)中的果胶为10∶0.9～1.1的质量比，于室温下，在果胶悬浮液中加入磺化试剂，反应时间为1～3h；

5)、将步骤4)所得的反应产物滴加(缓慢)于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸馏水中进行透析20～30小时；

6)、将步骤5)所得的截留产物冷冻干燥，得磺化果胶多糖。

作为本发明的果胶磺化的方法的进一步改进：

步骤3)的搅拌时间为0.5～24h；

步骤5)为：将步骤4)所得的反应产物冷却至室温后滴加入5～10体积倍的冰水中；透析袋的截留分子量7000Da。

在本发明中，将果胶(特别为柑橘果胶)用二甲亚砜溶解，由三氧化硫-吡啶复合物对其进行磺化修饰，经过透析冻干，获得磺化果胶多糖。

在本发明中，二甲亚砜使用纯二甲亚砜(即事先作过干燥除水处理的二甲亚砜)，

本发明反应条件较易控制，得率高，重复性好。利用本方法制备而得的磺化果胶多糖，在反应过程中降解小，副反应少，具有较好的抗凝血、抗肿瘤和抗病毒活性，应用范围很广。

本发明的磺化果胶多糖实际用法和用量如下：口服，每天1～20mg/Kg。

相比现有的其他方法，本发明所使用的方法更温和，具有较好的实用性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例2制备而得的磺化果胶多糖的红外谱图；

图2为实施例4制备而得的磺化果胶多糖的红外谱图；

图3为实施例1制备而得的磺化果胶多糖的红外谱图；

图4为实施例3制备而得的磺化果胶多糖的红外谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的技术范围。

以下每个实施例的每个步骤中，没有明确告知温度的，均为在室温下进行。二甲亚砜均为无水二甲亚砜。

实施例1、一种果胶磺化的方法，依次进行如下步骤：

(1)酯化试剂的制备：将2g三氧化硫-吡啶复合物溶解于4ml无水二甲亚砜中，得磺化试剂；

(2)自提果胶悬浮液的制备：

将柑橘干果皮烘干后(含水率≤90％)粉碎成粉(过60目的筛)，然后加30体积倍的水浸泡过夜(即浸泡12小时)，3000r/min的转速下离心40min分钟，所得的上清液加3体积倍的无水乙醇沉淀。反复用相同用量的乙醇沉淀两次，即可得到水溶性果胶，烘干(于50℃烘干至恒重)后，得柑橘果胶。

将200mg柑橘果胶放入10ml无水二甲亚砜中，搅拌0.5小时，得果胶悬浮液。

(3)进行酯化反应：将所得果胶悬浮液于60℃下水浴，磁力搅拌，缓慢滴加入三氧化硫-吡啶复合物溶液(即步骤(1)所得的磺化试剂)，反应1h。

(4)纯化：

将步骤(3)所得的反应产物冷却至室温后滴加于5体积倍的冰水中。将所得溶液收集，置于截留分子量为7000Da的透析袋中，蒸馏水中透析24h，从而通过透析袋上的透析膜除去杂质和盐等物质。

将所得的截留产物冷冻(-40℃)真空冷冻干燥48h，得磺化果胶多糖97mg(其为DMSO体系下自提果胶硫酸酯产品)。

该磺化果胶多糖的红外谱图如图3所示。

实施例2、一种果胶磺化的制备方法，依次进行如下步骤：

(1)酯化试剂的制备：将2g三氧化硫-吡啶复合物溶解于4ml无水二甲亚砜中，得磺化试剂；

(2)商品果胶悬浮液的制备：

先将商品柑橘果胶(可购自购自sigma公司)通过乙醇和丙酮的分级沉淀纯化，得纯化后的商品果胶；具体如下：

取50ml的商品柑橘果胶，倒入50ml的无水乙醇，超声溶解后进入离心机以3000r/min的转速离心40分钟；将离心后所得的位于上层的乙醇层倒掉，取下层沉淀加入50ml的80％(体积浓度)的乙醇，超声溶解后进入离心机以3000r/min的转速离心40分钟，取下层沉淀加入50ml的丙酮溶解，超声溶解后进入离心机以3000r/min的转速离心30分钟，所得的沉淀为纯化后的柑橘果胶。

取200mg纯化后的柑橘果胶放入20ml无水二甲亚砜中，搅拌0.5小时，得果胶悬浮液。

(3)进行酯化反应：

将所得果胶悬浮液于70℃下水浴，磁力搅拌，缓慢滴加入三氧化硫吡啶复合物溶液(即步骤(1)所得的磺化试剂)，反应1.5h。

(4)纯化：

将步骤(3)所得的反应产物冷却至室温后滴加于8体积倍的冰水中。将所得溶液收集，置于截留分子量为7000Da的透析袋中，蒸馏水中透析24h，从而通过透析袋上的透析膜除去杂质和盐等物质；

将所得的截留产物冷冻(-40℃)干燥48h，得磺化果胶多糖105mg(为DMSO体系下商品果胶硫酸酯产品)。

实施例3、一种果胶磺化的制备方法，依次进行如下步骤：

(1)、酯化试剂的制备：

将2g三氧化硫-吡啶复合物溶解于4ml无水二甲亚砜中，得磺化试剂；

(2)、将200mg柑橘果胶放入10ml超纯水中，搅拌0.5小时，使果胶完全溶解；得果胶溶液。

柑橘果胶的制备方法同实施例1。

将上述果胶溶液过凝胶层析柱，具体如下：

采用Sephacryl S-300column(1.6cm×100cm)葡聚糖凝胶柱，以pH3.5的盐酸溶液作流动相，流速为0.5ml/min，第160分钟后开始采集，采集至750min，800分钟后停止洗脱。得采集液。

在上述采集液中滴加三乙胺(TBA)直至pH为6.0-6.5，冷冻(-40℃)干燥后，得三乙胺果胶盐102mg。

取三乙胺果胶盐102mg于圆底烧瓶中，加入5ml的无水二甲亚砜搅拌溶胀(搅拌0.5小时)，得果胶悬浮液。

(3)进行酯化反应：

在上述果胶悬浮液中，于磁力搅拌下加入步骤(1)制得的三氧化硫吡啶复合物的二甲亚砜溶液(即步骤(1)所得的磺化试剂)，室温下反应1h。

(4)纯化：将步骤(3)所得的反应物滴加于6体积倍的冰水中。将所得溶液收集，置于截留分子量为7000Da的透析袋中，蒸馏水中透析24h，将透析后的样品冷冻干燥48h，得磺化果胶多糖113mg(为TBA体系制备自提果胶硫酸酯产品)。

实施例4、一种果胶磺化的制备方法，依次进行如下步骤：

(1)将2g三氧化硫-吡啶复合物溶解于4ml无水二甲亚砜中，得磺化试剂；

(2)自提果胶悬浮液的制备：

取200mg纯化后的柑橘果胶放入10ml超纯水中，搅拌0.5小时，使柑橘果胶全部溶解；得果胶溶液。

由商品柑橘果胶获得纯化后的纯化后的柑橘果胶的方法同实施例2。

将上述果胶溶液过凝胶层析柱(操作方式同实施例3)，得采集液。

在上述采集液中滴加三乙胺直至pH为6.0-6.5，冷冻(-40℃)干燥后，得三乙胺果胶盐98mg。

取三乙胺果胶盐98mg于圆底烧瓶中，加入4.9ml的二甲亚砜溶解，完全搅拌后(搅拌0.5小时)，得果胶悬浮液。

(3)进行酯化反应：取已制备好的果胶悬浮液，在磁力搅拌下加入步骤(1)制得的磺化试剂中，室温下反应1h。

(4)纯化：将步骤3)所得的反应物滴加于10体积倍的冰水中。将所得溶液收集，置于截留分子量为7000Da的透析袋中，蒸馏水中透析24h，将透析后的样品冷冻干燥48h，得磺化果胶多糖102mg(为TBA体系制备商品果胶硫酸酯产品)。

实验1、将实施例1～实施例4所得的磺化果胶多糖进行抗凝血活性检测：

以实施例1～实施例4所得的磺化果胶多糖作为待测样品，以诺伊肝素和血浆作为对照样品；

分别称取待测样品和对照样品用Tris-HCl pH7.4缓冲液溶解，稀释到系列待测浓度。参照人凝血因子试剂盒所附说明书方法进行。在37℃预温比色杯中加入5ul样品/对照品溶液，然后加入45ul凝血质控血浆，37℃下预热2min，用力加50ul APTT试剂(试剂盒附带)入测定血浆中，37℃孵育3min，加入50ul 37℃预温的CaCl₂，同时开始计时。结果如表1所示。

表1、本发明所得的磺化果胶多糖对APTT(活化部分凝血活酶时间)的影响

说明：空白血浆：50ul血浆+50ul APTT+50ul CaCl₂；空白血浆响应时间为31.8±0.5s，APTT响应值正常范围为35.03±1.5s，正常使用。

实验2、检测实施例1～实施例4所得的磺化果胶多糖对TT的影响：

参照人凝血因子试剂盒所附说明书方法进行。在37℃预温比色杯中加入10ul样品/对照品溶液，然后加入90ul凝血质控血浆(试剂盒附带)，37℃下预热2min，加50ul 37℃预温TT试剂(试剂盒附带)，同时开始计时。结果如表2所示。

表2、本发明所得的磺化果胶多糖对对TT(凝血酶时间)的影响

说明：检测样品对TT的影响

空白血浆：100ul血浆+50ul TT；空白血浆响应时间为15.5±0.3s，TT响应值正常范围为16.2s，正常使用。

对比实验1-1、将瓜尔豆胶磺化衍生物按照实验1和实验2的方法，测定其抗凝血效果，结果如下表3和4所述。结果表示，本发明的磺化果胶多糖抗凝血性较好。

表3

表4

对比实验2、

将实施例1的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成1.0g，其余等同于实施例1。所得的磺化果胶多糖称为对比例1-1。

将实施例1的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成3.5g，其余等同于实施例1。所得的磺化果胶多糖称为对比例1-2。

将实施例2的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成1.0g，其余等同于实施例2。所得的磺化果胶多糖称为对比例2-1。

将实施例2的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成3.5g，其余等同于实施例2。所得的磺化果胶多糖称为对比例2-2。

将实施例3的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成1.0g，其余等同于实施例3。所得的磺化果胶多糖称为对比例3-1。

将实施例3的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成3.5g，其余等同于实施例3。所得的磺化果胶多糖称为对比例3-2。

将实施例4的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成1.5g，其余等同于实施例4。所得的磺化果胶多糖称为对比例4-1。

将实施例4的步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物由2g改成3.5g，其余等同于实施例4。所得的磺化果胶多糖称为对比例4-2。

将所得的产物按照实验1和实验2进行检测，结果如下表5和表6所示；

表5

表6

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.果胶磺化的方法，其特征是：由果胶或者三乙胺果胶盐在二甲亚砜的环境下，由三氧化硫-吡啶复合物磺化，制得磺化果胶多糖。

2.根据权利要求1所述的果胶磺化的方法，其特征是：采用三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系，包括以下步骤：

1)、制备磺化试剂：按照2～5g三氧化硫-吡啶复合物/10ml的二甲亚砜的用量比，将三氧化硫-吡啶复合物溶解于二甲亚砜中，得磺化试剂；

2)、称取果胶放入二甲亚砜中搅拌溶胀，得果胶悬浮液；所述果胶与二甲亚砜的料液比为：10～40mg果胶/1ml二甲亚砜；

3)、在60～100℃的水浴条件下，按照步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物与步骤2)中的果胶为10∶0.9～1.1的质量比，将磺化试剂加入果胶悬浮液中，反应1～3h；

4)、将步骤3)所得的反应产物滴加于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸馏水中透析20～30小时；

5)、将步骤4)所得的截留产物冷冻干燥，得磺化果胶多糖。

3.根据权利要求2所述的果胶磺化的方法，其特征是：

所述步骤2)的搅拌时间为0.5～24h；

所述步骤4)为：将步骤3)所得的反应产物冷却至室温后滴加于5～10体积倍的冰水中；所述透析袋的截留分子量为7000Da。

4.根据权利要求1所述的果胶磺化的方法，其特征是：采用TBA-三氧化硫吡啶复合物-DMSO体系，包括以下步骤：

1)、制备磺化试剂：按照2～5g三氧化硫-吡啶复合物/1ml的二甲亚砜的用量比，将三氧化硫-吡啶复合物溶解于二甲亚砜中，得磺化试剂；

2)、按照10～30mg果胶/1ml的超纯水的料液比，称取果胶放入超纯水中，搅拌溶胀，使果胶完全溶解；得果胶溶液；

将上述果胶溶液过凝胶层析柱，取分离后的果胶于培养皿中，用三乙胺滴定至pH为6.0-6.5，冷冻干燥，得三乙胺果胶盐；

3)、将步骤2)所得的三乙胺果胶盐放入二甲亚砜中，搅拌溶胀，制成果胶悬浮液；所述三乙胺果胶盐与二甲亚砜的料液比为：20～40mg的三乙胺果胶盐/1ml二甲亚砜；

4)、按照步骤1)中的三氧化硫-吡啶复合物与步骤2)中的果胶为10∶0.9～1.1的质量比，于室温下，在果胶悬浮液中加入磺化试剂，反应时间为1～3h；

5)、将步骤4)所得的反应产物滴加于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸馏水中进行透析20～30小时；

6)、将步骤5)所得的截留产物冷冻干燥，得磺化果胶多糖。

5.根据权利要求4所述的果胶磺化的方法，其特征是：

所述步骤3)的搅拌时间为0.5～24h；

所述步骤5)为：将步骤4)所得的反应产物冷却至室温后滴加入5～10体积倍的冰水中；透析袋的截留分子量7000Da。

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