CN102579659A - 荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒（AdV）药物中的应用。荔枝核黄酮类化合物在体外具有显著抑制AdV的作用，具体体现在：随药物浓度增高，典型AdV感染所致的细胞病变效应（CPE）逐渐减弱、病毒抑制率逐渐增高、病毒滴度逐渐降低，并呈明显的量效关系。

Description

荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途

技术领域

本发明涉及荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途，属于医药技术领域。

背景技术

腺病毒感染所导致的呼吸道传染病——腺病毒肺炎，常发生在6个月至2岁的婴幼儿，患儿出现高热、呼吸困难、口周紫绀、抽风、惊厥、昏迷等中毒症状，多因抢救不及时或不当而死亡，病死率约为20％～50％，严重威胁婴幼儿健康。现在临床上对于腺病毒肺炎的治疗，主要应用酚妥拉明、病毒唑、干扰素、聚肌胞注射液、左旋咪唑等，但均未获得明显效果。因此，研究和开发新的抗腺病毒药物具有重要的现实意义和社会意义。

荔枝核是无患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn)的干燥成熟种子，又名荔仁或荔核，味甘、微苦，我国古代药典记载荔枝核性温、归肝、肾经、能祛寒止痛和行气散结；荔枝核的化学成分有甾类、皂苷、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素、糖类、蛋白质以及无机盐。黄酮类化合物为荔枝核提取物中的主要成分，具有毒性低、副作用小等特点。荔枝核黄酮类化合物除具有降血糖、调血脂和抗氧化作用等多种功效外，还具有抗病毒作用，已有文献报道其具有体外抗乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒等多种病毒作用，但其对腺病毒的作用尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途。

本发明发现荔枝核黄酮类化合物能抑制腺病毒在细胞中的生物合成，临床上可用于腺病毒感染引起的肺炎的治疗。

本发明采用的荔枝核黄酮类化合物的提取方法，其过程如下：将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取荔枝核粉，加入乙醇溶液，采用微波预处理，恒温提取并间歇震荡，经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍量的无水乙醇静置一段时间后，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收乙醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨口锥形瓶中加入预处理好的吸附树脂和上述制备的荔枝核浸出液，于室温下振荡，调节上柱液pH＝5.0左右，室温下以相应流速吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用乙醇解吸，控制脱附剂流速和脱附剂的用量，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剂，最后获得纯度更高，活性更好的荔枝核黄酮类化合物。

荔枝核黄酮类化合物在体外具有明显抑制腺病毒的作用。具体体现在：随药物浓度增高，典型AdV感染所致的细胞病变效应(CPE)逐渐减弱、病毒抑制率逐渐增高、病毒滴度逐渐降低，并呈明显的量效关系。

本发明可从荔枝核中获得含量更高、纯度更高的黄酮类化合物。提取的黄酮类化合物能有效抑制腺病毒在细胞中的复制与增殖，可用于制备抗腺病毒药物。

附图说明

图1.荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的毒性作用，

A：正常Hep-2细胞；B：80mg·L^-1的FLC处理Hep-2细胞24h(×400)。

图2.荔枝核黄酮类化合物在Hep-2细胞中对AdV-7致细胞病变作用的抑制效应。100TCID₅₀腺病毒AdV-7感染Hep-2细胞，37℃吸附1h后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓度FLC(40，20，10，5，2.5，1.25mg·L^-1)100ul/孔，5％CO₂，37℃培养观察。

A：AdV-7感染的Hep-2细胞；B：10mg·L^-1FLC处理的AdV-7感染Hep-2细胞；C：80mg·L^-1FLC处理的AdV-7感染Hep-2细胞。

具体实施方式

实施例1：荔枝核黄酮类化合物的提取与纯化

将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取一定量的荔枝核粉，按照料液比1∶12加入相应体积的浓度为60vol％乙醇溶液，在700W频率微波下作用150S后，恒温提取并间歇震荡，经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍体积量的无水乙醇静置一段时间，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收乙醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨口锥形瓶中加入600mg预处理好的X-5吸附树脂和450ml上述制备的荔枝核浸出液，并调整上样液质量浓度为0.5mg/ml，于室温25℃下振荡(180r/min)24h，调节上柱液pH＝5.0，室温下以流速2ml/min吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用85vol％乙醇解吸，控制脱附剂流速为0.5ml/min，脱附剂的用量为50ml/批，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剂。

实施例2：荔枝核提取物中黄酮的定性鉴定和含量测定

1)首先取荔枝核提取物，溶于60vol％乙醇，与HCl-Mg，AlCl₃，Pb(Ac)₃反应均为阳性，表明荔枝核提取物中含有黄酮类化合物。

2)以60vol％乙醇为溶剂，以NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH作为显色剂，分别作芦丁标准品及荔枝核提取物的吸收曲线，二者均在508nm有一强吸收峰，故选择508nm为测定波长。准确称取芦丁标准品5.00mg，用50vol％乙醇溶解后定容至50ml容量瓶中，配制成芦丁标准溶液(100μg/ml)。精确量取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.0、6.0、7.0ml分别置于25ml容量瓶中，各加入5wt％亚硝酸钠溶液1ml摇匀，放置6min，加10wt％硝酸铝溶液1ml，摇匀放置6min，加4wt％氢氧化钠溶液10ml，然后用60vol％乙醇稀释至刻度，摇匀放置15min，试剂为空白作参比，测定吸光度，显色测定吸光度A，用最小二乘法得到回归方程为：A＝0.0049C(μg/ml)+0.0027。取荔枝核提取物1ml置于25ml容量瓶中，依次加入5wt％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6min，加10wt％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加4wt％氢氧化钠溶液10ml，然后用60vol％乙醇定容，摇匀，放置15min，以不含荔枝核提取物的上述试剂作参比液，在508nm处测定吸光度，得到黄酮类化合物的浓度为13.33333mg·mL^-1，从而推知荔枝核中黄酮类化合物含量为1.98％。

实施例3：荔枝核黄酮类化合物体外抗腺病毒作用

1、荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的细胞毒性

Hep-2细胞经胰酶消化后，以含10％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，加到96孔培养板中，每孔10⁵/100μl，待细胞长满80％后每孔加入100μl不同稀释浓度的荔枝核黄酮类化合物(160，80，40，20，10mg·L^-1)。每一药物浓度均重复4孔，置培养箱中37℃连续培养24小时后，MTT法测Hep-2细胞的存活率。

Hep-2细胞存活率＝药物组平均吸光度值(OD)/细胞对照组OD×100％

荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞毒性作用表现为：细胞粘连、变圆、壁厚、破碎脱落，胞质内颗粒增加(见图1)，折光性增强并且吸光值明显下降。随着荔枝核黄酮类化合物的浓度增加细胞存活率呈递减趋势，用SPSS 19.0的Probit回归法计算、经直线回归分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线相关关系(R²＝0.99，P＜0.05)，荔枝核黄酮类化合物半数毒性浓度TC₅₀为116.83mg·L^-1。荔枝核黄酮类化合物在80mg·L^-1范围内均未见明显的细胞毒性，从而确定该浓度为抗病毒实验的最高允许浓度。结果见表1。

表1.荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的毒性作用

注：-为无CPE；+为25％细胞出现CPE；++为50％细胞出现CPE；+++为75％细胞出现CPE。

2、荔枝核黄酮类化合物体外抗腺病毒作用

荔枝核黄酮类化合物对腺病毒的作用分成三个组。Ⅰ组(药物抗病毒生物合成组)：先加病毒液吸附Hep-2细胞2小时后再加含药维持液。Ⅱ组(药物直接作用组)：病毒液与不同浓度的药物作用2小时，然后将混合液与Hep-2细胞孵育2小时后更换细胞维持液。Ⅲ组(药物抗病毒吸附组)：将不同浓度的药物加入到细胞内分别作用2小时后，弃去药液，再加病毒液，吸附2小时后更换细胞维持液。

上述三个实验组每孔剂量设4个重复孔，同时设立未感染细胞对照、病毒对照。37℃、5％CO₂培养，每天于倒置显微镜下观察细胞变化。待病毒对照孔细胞病变程度呈+++～++++，且对照细胞正常时，MTT法进行活细胞染色，在570nm波长读取OD值，根据OD值判断不同浓度药物对病毒抑制作用的大小，公式如下：

取实验孔、病毒对照孔、细胞对照孔的培养上清液系列对数稀释，测定TCID₅₀。

Probit回归方法计算药物半数有毒浓度(TC₅₀)和半数有效浓度(IC₅₀)，治疗指数(TI)＝药物半数有毒浓度(TC₅₀)/半数有效浓度(IC₅₀)，用Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀，应用LSD方法进行不同组别之间的两两比较，判断其间差别有无显著性，用Linear Regression对药物剂量与其产生的细胞效应(抑制率)进行相关性分析，判断是否存在量效关系。数据处理用SPSS 19.0软件完成。

实验结果表明荔枝核黄酮类化合物对腺病毒无预防和直接杀伤作用，但荔枝核黄酮类化合物对腺病毒有抗生物合成作用，当AdV病毒对照组CPE达++++，FLC作用组随着药物浓度的增加，细胞病变程度逐渐减弱(见图2)。其抗生物合成的半数有效浓度(IC₅₀)为17.53mg·L^-1，治疗指数为6.67。详细实验结果见表2。

表2.荔枝核黄酮类化合物抗病毒生物合成作用

注：-为无CPE；+为25％细胞出现CPE；++为50％细胞出现CPE；+++为75％细胞出现CPE。

Claims (1)

1.荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物中的应用。

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