CN102579449B - 一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的联合用药 - Google Patents
一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的联合用药 Download PDFInfo
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Abstract
一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的联合用药，涉及一种抗肿瘤药物。所述联合用药包括吡喹酮和紫杉醇，所述吡喹酮和紫杉醇的质量比为180～2200∶1。所述联合用药可提高肿瘤对紫杉醇的敏感性并可以有效提高紫杉醇对肿瘤的杀伤能力，能极大地促进肿瘤细胞凋亡的发生，可以有效提高对紫杉醇不敏感性或有抗药性的肿瘤对紫杉醇的敏感性，并且大大降低肿瘤细胞对紫杉醇的抗药性。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物，尤其是涉及一种在肿瘤治疗中可提高肿瘤对紫杉醇(Taxol)敏感性的新型联合用药。
背景技术
紫杉醇(Taxol)是一种能阻断细胞中微管功能而导致细胞死亡的药物，在临床上已被广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等实体瘤的治疗(1.Jordan MA，Wilson L：Microtubulesas a target for anticancer drugs.Nat Rev Cancer 2004；4：253-265)。但由于种种原因，如p-糖蛋白(P-Glygoprotein)过表达、微管蛋白突变等原因，肿瘤病人对紫杉醇的抗药现象却越来越突出，成为治疗肿瘤病人的一大障碍；而且，紫杉醇的临床毒副作用较广泛，主要包括过敏反应、神经毒性、造血抑制(2.Rodriguez-Antona C：Pharmacogenomics of paclitaxel.Pharmacogenomics 2010；11：621-623)；此外，由于天然的紫杉醇产量较少，临床上经常出现世界性的供不应求现象，这些因素都对紫杉醇在肿瘤治疗上的应用带来了很大的挑战。因此，近年来紫杉醇与其它药物的联合使用策略得到了高度的关注和发展，国外有很多这样的与紫杉醇药物联用已经成功地进入临床使用或临床前的测试。这种联合使用的优势在于一方面可以提高某些对紫杉醇不敏感或有抗药性的肿瘤对紫杉醇的敏感性并降低对紫杉醇的抗药性，同时在保证同样疗效的前提下降低紫杉醇的用药量，从而减少毒副作用的发生和对紫杉醇的依赖。
吡喹酮是一种高效广谱抗寄生虫药，已在临床上用于治疗寄生虫多年，对寄生于人体和动物的多种寄生虫，特别是对血吸虫、华支睾吸虫、并殖吸虫、姜片虫和多种绦虫的成虫及幼虫等都有显著的杀虫作用，且毒性低，使用方便(3.GonnertR，Andrews P：Praziquantel，a newboard-spectrum antischistosomal agent.ZParasitenkd 1977；52：129-150；4.Grover JK，Vats V，Uppal G，Yadav S：Anthelmintics：a review.Trop Gastroenterol 2001；22：180-189)，目前还未见到任何有关吡喹酮涉及抗肿瘤治疗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的联合用药。
所述一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的联合用药包括吡喹酮和紫杉醇，所述吡喹酮和紫杉醇的质量比为(180～2200)∶1。
所述吡喹酮是一种已经在临床上广泛应用于治疗寄生虫病的化学药物，所述紫杉醇是一种已经广泛应用于抗肿瘤化疗的药物。所述联合用药可提高肿瘤对紫杉醇的敏感性并可以有效提高紫杉醇对肿瘤的杀伤能力，能极大地促进肿瘤细胞凋亡的发生，可以有效提高对紫杉醇不敏感性或有抗药性的肿瘤对紫杉醇的敏感性，并且大大降低肿瘤细胞对紫杉醇的抗药性。
吡喹酮单独使用时对肿瘤细胞并没有明显的杀伤效果，但是当吡喹酮和紫杉醇联合使用时能有效提高紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤能力，并在细胞水平和动物肿瘤模型中明显增强紫杉醇对肿瘤的杀伤性。此外，这两个药物的联合使用还能有效地提高某些对紫杉醇不敏感性或有抗药性的肿瘤对紫杉醇的敏感性。
附图说明
图1为利用MTT(3-(4，5-cimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium Bromide；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝)方法检测不同肿瘤细胞在紫杉醇处理后的存活率，依此测量这些肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。在图1中，横坐标为IC50值，纵坐标为肿瘤细胞系。
图2为用MTT方法检测肿瘤细胞株乳腺癌细胞ZR-7530和Bcap37、人宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞Spc-a-1和Ltep-a-2经吡喹酮和紫杉醇单独处理及联合处理后细胞存活率的结果。在图2中，纵坐标为细胞存活率(％)；a为吡喹酮，b为紫杉醇，c为吡喹酮+紫杉醇。
图3用MTT方法检测对紫杉醇不敏感的结肠癌细胞DLD-1(A)经吡喹酮与紫杉醇联合处理后的存活率。在图3中，横坐标为紫杉醇浓度(nM)，纵坐标为细胞存活率(％)；□为紫彬醇，◇为紫杉醇+20μm吡喹酮。
图4用MTT方法检测对紫杉醇不敏感的肺癌细胞H1299经吡喹酮与紫杉醇联合处理后的存活率。在图4中，横坐标为紫杉醇浓度(nM)，纵坐标为细胞存活率(％)；□为紫彬醇，◇为紫杉醇+20μm吡喹酮。
图5为利用流式细胞术对经吡喹酮和紫杉醇分别单独处理及联合处理后结肠癌细胞DLD-1的细胞凋亡检测的结果。在图5中，纵坐标为细胞存活率(％)。
图6为利用流式细胞术对经吡喹酮和紫杉醇分别单独处理及联合处理后肺癌细胞H1299的细胞凋亡检测的结果。在图6中，纵坐标为细胞存活率(％)。
图7为在裸鼠动物中用对紫杉醇不敏感结肠癌细胞DLD-1所建立的肿瘤模型经吡喹酮和紫杉醇单独给药或联合给药后的抑瘤率结果。在图7中，纵坐标为抑瘤率(％)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1、检测不同肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性
用MTT方法检测不同肿瘤细胞系对紫杉醇的敏感性。将人宫颈癌细胞HeLa、前列腺癌细胞PC-3、结肠癌细胞SW620、HT29、HCT-116、DLD-1、肺癌细胞Ltep-a-2、Spc-a-1、H460、H1299、A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231、ZR-7530、Bcap37以每孔5000～7000个细胞的数量接种到96孔板，12～16h后，以0～200nM的紫杉醇处理48h，然后吸去培养液，每孔加入80～120μl含0.5mg/ml MTT的细胞培养液，37℃下反应2～4h后，去掉细胞培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)去溶解上一步骤中形成的甲瓒结晶，再用酶标仪检测OD570读值。紫杉醇对细胞的生长抑制率按如下公式计算：
抑制率＝(1-加药组OD570值/不加药物组OD570值)×100％
将浓度及浓度对应的抑制率输入GraphPad软件(GraphPad Software Inc)得到半数抑制浓度(IC50)，即对细胞的生长抑制率达50％时所需的药物浓度。
紫杉醇对不同肿瘤细胞的IC50值见图1。在这些肿瘤细胞中，结肠癌细胞DLD-1的IC50最大，为150nM，其次为肺癌细胞H1299细胞，IC50值为100nM，紫杉醇对其它细胞的IC50值在5～30nM范围内。一般情况下，当IC50值大于50nM时，可认为该细胞对紫杉醇不敏感或具有抗药性。上述检测结果表明，在我们所检测的肿瘤细胞中，如已经报道的一样，结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299为对紫杉醇不敏感细胞(即对紫杉醇有抗药性的细胞)。
实施例2、检测紫杉醇单独使用或吡喹酮单独使用以及他们联合使用时对ZR-7530、HeLa、Spc-a-1、Ltep-a-2、Bcap-37等多种肿瘤细胞系存活率的影响
将乳腺癌细胞ZR-7530和Bcap-37、人宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞Spc-a-1和Ltep-a-2等细胞以每孔5000～7000个细胞的密度接种到96孔板上，12～16h后，加入吡喹酮和紫杉醇单独使用或联合使用。采用不同的吡喹酮和紫杉醇的配比对不同的肿瘤细胞系进行药物处理，药物配比和处理时间分别为：处理HeLa和ZR-7530细胞时，采用吡喹酮和紫杉醇的配比为730∶1(质量比)，处理时间为48h；处理Bcap-37和Spc-a-1细胞时，采用吡喹酮和紫杉醇的配比为2200∶1(质量比)，处理时间为48h；处理Ltep-a-2细胞时，采用吡喹酮和紫杉醇的配比为2200∶1(质量比)，处理时间为60h。然后按实施例1所述的MTT方法得到OD570读值，再按如下公式计算得到不同处理条件下细胞的存活率，细胞存活率＝加药组OD570值/不加药物组OD570值×100％。由此得出这些肿瘤细胞系在吡喹酮、紫杉醇单独使用时或联合使用下的细胞存活率。
由图2结果表明，在所述条件处理下，吡喹酮的单独使用几乎不对肿瘤细胞有影响；而在上述条件下，紫杉醇的单独处理，这些肿瘤细胞仍可达70％～80％的存活率；当在所述条件下，吡喹酮和紫杉醇两种药物联合使用后，它们能显著降低细胞的存活率，这些细胞的存活率都下降到不到50％。这些结果表明吡喹酮可在多种肿瘤细胞中增强紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例3、比较紫杉醇单独使用及其与吡喹酮的联合使用对结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299细胞存活率的影响
将对紫杉醇不敏感的结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299以每孔5000～7000个细胞的密度接种到96孔板上，12～16h后，加入浓度为0-80nM的紫杉醇，或20μM吡喹酮，或20μM吡喹酮与0～80nM紫杉醇联合作用，处理时间为24～48h。然后按实施例1所述的MTT方法得到OD570读值，再按实施例2中的公式计算得到不同处理条件下细胞的存活率。
图3和图4分别是结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299经紫杉醇单独处理或紫杉醇和吡喹酮联合处理后得到的细胞存活率曲线，由图3和4可知，在吡喹酮浓度为20μM，紫杉醇浓度为10～40nM，即吡喹酮和紫杉醇配比在(180～730)∶1(质量比)时，吡喹酮可极大地促进紫杉醇对其不敏感的肿瘤细胞系结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299的杀伤力。在没有吡喹酮存在的条件下，紫杉醇杀伤它们而达到的IC50值高于80nM；而当紫杉醇和20μM吡喹酮联合作用时，紫杉醇杀伤结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299的IC50值仅为10nM到20nM。与紫杉醇单独使用时相比，IC50值显著降低。这个结果表明在有吡喹酮存在的条件下，结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299对紫杉醇的敏感性显著提高。
实施例4、检测吡喹酮、紫杉醇单独使用以及它们联合使用对结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299细胞凋亡的影响
用流式细胞术检测吡喹酮、紫杉醇单独使用以及它们联合作用后诱导的结肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H1299的细胞凋亡情况。先将DLD-1和H1299细胞分别以每孔(1～2)106个细胞的密度接种到60mm培养板上培养12～16h，再将DLD-1和H1299细胞各分四个实验组：第一组细胞为对照组不处理；第二组细胞用20μM吡喹酮单独处理48h；第三组细胞用10nM紫杉醇单独处理48h；第四组细胞用20μM吡喹酮和10nM紫杉醇(吡喹酮和紫杉醇的配比为730∶1)联合处理48h。然后用胰酶消化的办法收获这些细胞，1000转离心5min，去掉上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次。加入70％乙醇4℃固定12～24h，1000转离心5min，去掉上清，PBS重悬后，加入0.1mg/ml RNA酶于37℃反应30min，然后加入0.1mg/ml碘化丙锭于37℃反应30min，样品随后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
结果如图5和6所示，图5和图6分别是DLD-1和H1299细胞经吡喹酮、紫杉醇单独处理以及它们联合处理后细胞的凋亡情况。吡喹酮单独处理DLD-1和H1299细胞几乎不能诱导细胞凋亡；DLD-1和H1299细胞经紫杉醇在上述用量下单独处理后的细胞凋亡率分别仅为12％和20％；而用上述用量的吡喹酮和紫杉醇联合处理DLD-1和H1299这两个细胞后，细胞的凋亡率分别上升到49％和45％。这些结果表明，吡喹酮可显著提高那些对紫杉醇不敏感细胞(或紫杉醇抗性细胞)被紫杉醇诱导所产生的细胞凋亡率。
实施例5、检测吡喹酮、紫杉醇单独给药和它们联合给药对裸鼠移植肿瘤生长的抑制情况
以裸鼠(雄性，18～20g)为实验动物。取对数生长期的结肠癌细胞DLD-1细胞，按每只(1～5)×106的细胞数接种裸鼠，5天后将裸鼠随机分成4组，对照组即不给药组，吡喹酮单独给药组，紫杉醇单独给药组，吡喹酮和紫杉醇联合给药组，每组6只，按以下方式给药：
对照组：细胞接种后未给予任何药物治疗；
吡喹酮组：每只裸鼠使用剂量80～120mg/kg的吡喹酮，腹腔注射，一共给药5次；
紫杉醇组：每只裸鼠使用剂量25～35mg/kg的紫杉醇，腹腔注射，一共给药3次；
吡喹酮和紫杉醇联合给药组：吡喹酮和紫杉醇同时应用，剂量与给药方式与单独用药相同。
给药两周后用脱颈法处死裸鼠，解剖取肿瘤，称瘤重，根据以下公式计算肿瘤生长抑制率：
抑制率＝(1-给药组瘤重/对照组瘤重)×100％
不同药物处理对裸鼠的抑瘤率统计结果见图7，在上述吡喹酮单独给药的条件下，几乎不能抑制移植肿瘤的生长；在上述紫杉醇单独给药条件下能在一定程度上抑制移植肿瘤的生长，其抑瘤率可达20％；而在上述吡喹酮和紫杉醇联合给药的条件下，其抑瘤率可达52％，较紫杉醇单独给药，紫杉醇和吡喹酮的联合给药可显著抑制肿瘤的生长。这些结果表明，吡喹酮和紫杉醇这两个药物的联合使用对肿瘤的生长有更强的抑制效果，大大地提高了紫杉醇对紫杉醇不敏感细胞(或紫杉醇抗性细胞)的杀伤能力。
综上所述，实验结果表明，吡喹酮可显著提高多种肿瘤细胞对紫杉醇杀伤的敏感性，包括对紫杉醇有抗性的肿瘤细胞。在已获得的实验数据中，吡喹酮和紫杉醇的药物组合，可以大大降低肿瘤细胞对紫杉醇的抗药性。并且，吡喹酮与紫杉醇的联合作用，与药物单独作用相比，极大地促进了细胞凋亡的发生。以吡喹酮和紫杉醇联合应用于肿瘤治疗具有以下优点：
1)疗效显著，吡喹酮极大地提高了肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性；
2)在保证同样治疗效果的情况下，吡喹酮和紫杉醇联合使用可以降低紫杉醇的用药量，从而可减少紫杉醇单独用药带来的毒副作用；
3)两种药物都已在临床上广泛使用，临床的安全性已被证实；
4)紫杉醇价格昂贵，但吡喹酮和紫杉醇联用可以降低紫杉醇的用药量，节省成本，且吡喹酮价格低廉，该药物组合可减轻病人的经济负担。
本发明为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。
Claims (1)
1.一种可提高肿瘤对紫杉醇敏感性的药物，其特征在于由吡喹酮和紫杉醇组成，所述吡喹酮和紫杉醇的质量比为180～2200∶1。
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