CN102573892B - Gstp1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)在预防或治疗心肌病或缺血性心脏病和其诊断中的应用。

Description

GSTP1的应用

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽-S-转移酶P1的应用。

背景技术

谷胱甘肽S-转移酶(GST)为同工酶的多基因家族，其催化了谷胱甘肽(GSH)的硫原子对底物分子的亲电子基团的亲核攻击。GST已知为解毒酶，其将毒性物质与GSH缀合，以成为更加可水溶性的产物，该产物可在肝脏中被代谢并最终排出体外。在氨基酸序列的基础上，哺乳动物的GST被分成6类：α、μ、ω、π、θ和ζ。在这些同工酶中，谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1；GST-pi(GST-π)，GSTP1-1)在哺乳动物的细胞中是最普遍的一类。GSTP1作为瘤性标记已经引起关注，因为其在多种不同的人恶性肿瘤中过表达，所述恶性肿瘤包括肺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、口腔癌、肾癌、卵巢癌和睾丸癌。由于导致GSTP1转录减少的GSTP1启动子的超甲基化，相对于正常前列腺组织，大多数前列腺癌类型包含降低水平的GSTP1多肽(US 2009/0186360A1)。GSTP1是对氧化应激的细胞应答中的决定子，并保护肿瘤细胞免于由多种细胞毒剂，例如H₂O₂、UV、顺铂、阿霉素、依托泊甙、噻替派、苯丁酸氮芥、依他尼酸和三氧化二砷引起的细胞凋亡。因此，GSTP1被认为是肿瘤药中有前景的标靶——同时作为药物作用的标靶和作为肿瘤标记。

GSTP1也通过与其非催化和配体结合的活性相关的机制，参与调节应激信号传导和保护细胞免于细胞凋亡。例如，GSTP1预防LPS诱导的促炎因子的过度产生，并在应答LPS中起到抗炎作用。转录和翻译水平上的GSTP1表达，由LPS刺激上调。GSTP1经由与C-末端相互作用，也起到JNK(c-Jun氨基末端激酶)的内源性抑制剂的作用。也可证明外源性(重组)GSTP1蛋白可被递送至巨噬细胞中并抑制细胞中的iNOS和COX-2表达。此外，对小鼠进行GSTP1蛋白的腹膜内给药显著降低了内毒素性休克的死亡率，并抑制了急性肺损伤和腹膜炎(Luo et al.，Mol.Immunol.46(2009)，848-857)。

EP 1500709A1建议GSTP1作为22个炎症标记之一。

也已经发现由于GSTP1与来自交通(和烟草烟)的空气污染在呼吸系统中的相互作用以及与妊娠高血压的关联，GSTP1的各种同种型与哮喘和儿童期变应性疾病有关(Ohta et al.，Sem.Thr.Hem.29(2003)，653-659)。

心肌病(CMP)为异形疾病组，包括扩张性(DCM)形式——其是在心肌病中最常见的实体，和缺血性(ICM)形式。尽管药物疗法和外科手术已经改进——CMP中的生存率获益，但病因疗法仍然是模糊的目标。因此，识别介导CMP的未知机制可能是有益的。过去10年工作的结果明确提供了以下证据：炎症和促炎细胞因子特别是肿瘤坏死因子(TNF)-α的增强释放可能在CMP的发病机理中起作用。然而，临床试验已经矛盾地指示了TNF-α在CMP中更加复杂的作用，其抛出了TNF-α是否为CMP可用的治疗标靶的疑问。IHD的病理直接与CMP的发展相关，患者目前接受药疗法例如β-阻断剂或血管紧张素转化酶(ACE)-阻断剂，目标是改善患者的症状和预防或延迟由于IHD的(缺血性)CMP的发展。因此，通常使用也用于IHD的CMP疗法。重要地，基于IHD发展CMP特别是末期CMP的患者，目前仅具有有限的治疗选择(例如心脏移植或使用心室辅助设备，其又可能仅被提供给有限数量的患者)。

仍然需要进一步的药物标靶和治疗方案，以便有效预防和治疗CMP和IHD和其主要病因之一，即缺血性心脏病(也称为冠状动脉心脏病，其可导致心肌梗塞)，特别是升高的血压诱导的CMP和容积诱导(volume-induced)的CMP。

心肌病产生导致住院治疗或死亡的复发性恶化。因此，也要求密切的监视和全面的临床测试，以实现在这些患者中最佳的特制的心肌病治疗，这与极大的健康护理成本相关联。因此，能识别心肌病进展并帮助优化治疗监测和结果的生物标记是高度期望的。理想地，这种测试应当是敏感、特异性、非侵入性、快速和廉价的。尽管已经报道很多神经介质因子和炎症细胞因子作为心肌病中的诊断生物标记，但脑型利尿钠肽(BNP)和其非活性N-末端片段(proBNP)在患有被怀疑或确认的慢性CMP患者的临床诊断和监测中已经获得了最广泛的接受。然而，循环的BNP和proBNP水平被肾功能显著地影响，并且是年龄依赖性和性别依赖性的。另外，仍然未知proBNP在维持与减少的射血分数(EF)CMP相反的诊断中是否是有益的。

发明内容

因此，提供用于心肌病和缺血性心脏病的诊断手段也是本发明的目的。

因此，本发明提供了谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)，用于预防或治疗心肌病(CMP)，以及用于预防或治疗缺血性心脏病。通过本发明，可令人惊讶地显示GSTP1在CMP治疗和缺血性心脏病(IHD)的治疗中是有益的。GSTP1已经描述为癌症药(例如US 5,427,917A，US5,552,277A和WO 98/21359A1)和变应性疾病例如哮喘特别是与交通相关的空气污染相关联的哮喘(例如Melen et al.，Env.Health Persp.116(2008)，1077-1084)中的相关蛋白质。也已经提示GSTP1降低内毒素性休克的死亡率和抑制急性肺损伤和腹膜炎(Luo et al.，Mol.Immunol.46(2009)，848-875)。报道了GSTP1与TRAF2(肿瘤坏死因子受体相关因子2)相互作用，作为调节激酶信号传导中GSTP1的新型配体结合功能(Wu et al.，Oncogene 25(2006)，5787-5800)。尽管这提供了用于分析GSTP1利用的保护细胞免受不同的损伤刺激例如细胞因子、UV或H₂O₂的机制的新见解，并且GSTP1通过在肿瘤细胞中形成GSTP1-TRAF2复合体起到一般存活因子的作用的教导被认为可想到的，但是该复合体的抑制被认为限制于抗肿瘤疗法。

根据本发明，令人惊讶地发现与对照相比，GSTP1在CMP和IHD患者中被特异性地上调。进一步发现重组GSTP1介导的GSTP1-TRAF2联合减少促炎JNK1和p38活化和TRAF2表达，这依赖于其剂量和CMP的潜在形式。这使通过施用GSTP1提供用于CMP和IHD的新疗法策略得以实现。因为GSTP1通过与TRAF2的联合改善了TNF-α-介导的促炎JNK1/p38的活化，所以GSTP1不但有益于CMP和IHD治疗，而且有益于预防CMP和IHD，特别是在危险患者例如高血压患者中。

本发明提供了GSTP1在制造用于预防或治疗CMP和缺血性心脏病的药物中的应用。根据本发明的CMP和IHD的治疗涉及向需要这样治疗的个体，例如人CMP和IHD患者，施用有效量的GSTP1。因为这些原因并基于IHD的病理直接涉及CMP发展的事实，患者目前接受药疗法例如β-阻断剂或血管紧张素转化酶(ACE)-阻断剂，目标是改善患者的症状，并预防或延迟由于IHD的(缺血性)CMP的发展。IHD与CMP的病理的密切关系显示了本发明用于预防或治疗IHD和CMP的有效性，该密切关系基于患有IHD的患者，特别是由于IHD发展心肌梗塞的患者的心肌重建，其又导致了心腔的重建并随后导致削弱心脏的泵功能，这是一种CMP和IHD常见的病理状态，特别是在心肌梗塞患者中。因此，显而易见，本发明也适于预防或治疗IHD。重要地，基于IHD发展CMP特别是末期CMP的患者，目前仅具有有限的治疗选择(例如心脏移植或使用心室辅助设备，其又可能仅被提供给有限数量的患者)，并且该事实构成了本发明的优选应用，以预防或治疗遭受IHD的患者，旨在在一方面预防CMP的发展，并且在另一方面改善或稳定IHD患者的临床状况。

通过本发明，可治疗所有形式和阶段的CMP和IHD——其急性和慢性形式，其独立于CMP或IHD的发生。当然，术语“治疗”优选地包括改善疾病和预防或减缓疾病的进展。例如，CMP可由心肌梗塞引起，可为特发性扩张的或由高血压引起。所有这些形式都可用根据本发明的GSTP1进行治疗。具体地，可用GSTP1治疗例如由心肌梗塞引起的缺血性CMP，然而，也可治疗非缺血性形式(例如特发性扩张性CMP或高血压诱导的或容积诱导的CMP)。因为在所有这些CMP中包含炎性途径，这使它们适合使用根据本发明的GSTP1进行治疗(即使是罕见形式的CMP——如果包含这种炎性途径的话)。

因此，根据本发明的优选CMP为扩张性心肌病，特别是充血性心肌病；梗阻性肥厚性心肌病，特别是肥厚性主动脉瓣下狭窄；其他肥厚性心肌病，特别是非梗阻性肥厚性心肌病；心内膜心肌(嗜酸性的(eosinophilic))疾病，特别是心内膜心肌(热带的)纤维化症或吕弗勒心内膜炎；心内膜纤维弹力组织增生，特别是先天性心肌病；其他限制性心肌病，特别是限制型心病NOS(没有另外具体说明(根据ICD-10))；酒精性心肌病、由于药品和其他外部药剂引起的心肌病、未规定的(unspecified)心肌病，特别是心肌病(一级)(二级)NOS；传染性和寄生虫疾病中的心肌病，特别是白喉中的心肌病；代谢疾病中的心肌病，特别是心脏淀粉样变性；营养病中的心肌病，特别是营养性心肌病NOS；心脏痛风石或甲状腺毒性心脏病。

根据本发明，待治疗(或预防)的特别优选形式的CMP或IHD为由缺血引起的CMP，特别是由心肌梗塞、高血压或心肌炎引起的。因此，根据本发明的GSTP1治疗优选应用于患有以下疾病的患者中：急性心肌炎，优选感染性心肌炎，特别是脓毒性心肌炎；孤立性心肌炎，细菌性病害中的心肌炎，特别是白喉、淋球菌、脑膜炎球菌、梅毒性或结核性心肌炎；病毒疾病中的心肌炎，特别是流感性心肌炎或流行性腮腺炎性心肌炎；恰加斯病中的急性或慢性心肌炎、弓形体病中的心肌炎、类风湿性心肌炎或结节性心肌炎(sarcoid myocarditis)。

因此，根据本发明的优选适应症是列在ICD-10的第IX章下的那些(I11-I15，特别是I21、I22和I23；I20-I25，特别是I21和I22；I40-I43，特别是I42；I50-I57，特别是I50和I57)。

本发明主要关注的是人患者的治疗；然而，基于目前的发现，显而易见，涉及炎症的动物(哺乳动物)CMP和IHD也可由根据本发明的GSTP1进行成功地治疗。这可能对农场或动物园动物(特别是育种农场动物，例如(前者的)赛马)或宠物例如狗、猫和马很重要。

尽管本发明也可用预防CMP和IHD，但显而易见本发明的首要焦点在于治疗已经被诊断CMP或IHD或具有发展CMP或IHD高风险的人CMP和IHD患者，例如患有高血压的患者(例如具有收缩压160mmHg或更大和/或具有舒张压100mm Hg或更大的2期患者)。本发明预防方面的另一优选实施方式针对心绞痛患者，借此心肌梗塞可能已经或可能没有在该组患者中发生；并且心机能不全或心力衰竭(McMurray et al.，Lancet 365(2005)，1877-1889)可能存在或可能不存在。这里指示均匀、连续的静脉内给药或对心脏肌肉的连续给药。

根据本发明的包含GSTP1的药物的优选给药途径为肠胃外途径，优选腹膜内或静脉内给药，静脉内给药是特别优选的。静脉内给药可例如经由弹丸(bolus)注射或在长时间段(例如30min至6h，特别是1至3h)内通过连续静脉内递送进行。在心脏手术过程中也优选直接向心脏给药(心肌内注射)。通过该途径，GSTP1活性可被直接并以高浓度递送至所需区域，例如至梗塞区域。另一优选的给药途径为向冠状窦给药(例如经由插入冠状窦的导管)。口服或粘膜途径(尽管原则上针对GSTP1进行描述；见例如US 5,976,528A)是较不优选的，因为GSTP1是蛋白质，并且对于该途径，需要特定的保护措施(肠溶衣、胶囊化等)以及关于盖仑制造(galenic manufacture)的显著优化。

对人个体的优选给药剂量为0.001至100mg GSTP1/kg的剂量，优选0.01至10mg GSTP1/kg，特别是0.1至1mg GSTP1/kg，优选经由静脉内给药；或对人个体，0.1至10000U GSTP1/kg的剂量，优选1至1000U GSTP1/kg，特别是10至100U GSTP1/kg，优选经由静脉内给药。这些为优选的静脉内应用的每日剂量(“kg”表示被治疗的人的kg体重)。在手术期间，这些剂量也可作为整个剂量或甚至是多于一个的剂量；或仅部分剂量(记住在手术期间，在所需区域中，GSTP1可直接被应用)应用。“即用的(ready-to-use)”每日剂型(例如对80kg和/或60kg人个体)可被预制并可通过冻干或冷冻(以及保存在例如-20℃下)被制成储存稳定的。该剂量可随后完全或仅部分被消耗(例如基于要被治疗的人的体重)。

根据本发明的GSTP1也被称为“GSTP1-1”、“GST类-pi”、“DFN7”、“GST3”、“GSTπ”等，并且将还原的谷胱甘肽与大量外源性和内源性疏水亲电体缀合(EC 2.5.1.18；催化活性：RX+谷胱甘肽＝HX+R-S-谷胱甘肽)。人序列(Seq.ID.No.1)在UniProtKB/SwissProt数据库中列为“GSTP1人，P09211”(HGNC：4638，Entrez Gene：2950)。

SEQ.ID.NO.1：

1   mppytvvyfp vrgrcaalrm lladqgqswk eevvtvetwq egslkascly gqlpkfqdgd

61  ltlyqsntil rhlgrtlgly gkdqqeaalv dmvndgvedl rckyisliyt nyeagkddyv

121 kalpgqlkpf etllsqnqgg ktfivgdqis fadynlldll lihevlapgc ldafpllsay

181 vgrlsarpkl kaflaspeyv nlpingngkq

该人蛋白质(纯合以及杂合的)存在数种变体，最重要的变体为位置105处的Ile至Val交换和位置114处的Ala至Val交换(Melen et al.，2008)。其他变体包括位置78处的Gly至Glu交换、位置110处的Thr至Ser交换、位置139处的Gly至Glu交换、位置147处的Asp至Tyr交换和位置158处的Asp至His交换。数种其他的SNP是已知的，不影响氨基酸序列。

如果待用根据本发明的GSTP1治疗的CMP或IHD患者具有与SEQ.ID.NO.1相比产生(杂合或纯合的)氨基酸交换的这类等位基因，则可推荐向这样的患者施用该蛋白质的等位基因形式。这对于该等位基因是纯合的患者特别优选，例如具有纯合105Val或114Val等位基因的患者(其随后可分别接受105Val或114Val GSTP1变体)。在这样的情况下，产生不良反应特别是不良免疫反应的风险(其一直是蛋白质性质药物的论题)保持较低。不管怎样，如果可能，包含引出或促进患者体内免疫反应的根据本发明GSTP1的药物制剂中的任何组分应当保持在最小量。

来自哺乳动物的直向同源物是已知的，例如来自黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes)；NCBI登录号：745954，XM 001152516.1、XP 001152516.1)和小鼠(小家鼠(Mus musculus)；NCBI登录号：148701、NM 013541.11、NP 038569.11、AK0791445、BC0020485)，但也来自非哺乳动物，例如斑马鱼(斑马鱼(Danio rerio))和蠕虫(秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))。

本发明也涉及包括GSTP1——优选人重组GSTP1或人胎盘GSTP1——和药学上可接受的载体的药物组合物，用于预防或治疗心肌病或缺血性心脏病。

根据优选实施方式，根据本发明的组合物包含1至100000UGSTP1，优选10至10000U GSTP1，特别是10至1000U GSTP1。在pH 6.5、25℃下，一个GSTP1活性单位每分钟将1.0微摩尔的1-氯代-2，4-二硝基苯与还原的谷胱甘肽缀合。

根据本发明的优选组合物也包含缓冲剂。典型的缓冲剂系统为碳酸/HCO₃系统(pH 6.2至8.6；中性)、碳酸/硅酸盐缓冲剂(pH 5.0至6.2；弱酸性)、乙酸/乙酸盐缓冲剂(pH 3.7至5.7)、磷酸盐缓冲剂(NaH₂PO₄+Na₂HPO₄；pH 5.4至7.8)、氨水缓冲剂(NH₃+H₂O+NH₄Cl；pH 8.2至10.2)、TRIS/HCl(三(羟甲基)-氨基甲烷；pH 7.2至9.0)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；pH 6.8至8.2)、HEPPS(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-丙烷磺酸；pH 7.3至8.7)或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸；pH 5.2至6.7)。优选的根据本发明的缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂或HEPES缓冲剂，pH为5.5至9.0，优选6.0至8.5，特别是6.5至8.0。缓冲剂浓度可优选被调节至1mM至1M，特别是10mM至0.5M。其他优选的附加组分包括稳定剂、螯合剂、盐等，例如甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、EDTA或类似物质、NaCl、KCl、NH₄Cl和可用于药物制剂的类似盐。当然，药物制剂中的所有组分都必须是药用级品质的。

优选使用的药学上可接受的载体为生理盐水、植物油、矿物油、水性羧甲基纤维素钠或水性聚乙烯吡咯烷酮；然而，也可使用无菌水。

可通过多种方式提供根据本发明使用的GSTP1。如上面所提及的，来自人胎盘的GSTP1是GSTP1优选的天然来源之一。其他优选的来源为GSTP1(过)表达细胞培养物。GSTP1制剂也是商业可得的。然而，根据本发明的优选工业生产途径为GSTP1的重组生产。GSTP1的重组生产以及其从这样来源的纯化是良好确立的(例如Luo et al.，2009，Wuet al.，2006；WO 98/21359A1；US 5,976,528等)。包含GSTP1编码序列的表达载体(例如WO 98/21359A1，Part D(40至51页))被转移入合适的宿主细胞(例如COS、HEK 293、HeLa、VERO、W138、BHK或MDCK细胞，还有酵母、植物、昆虫和细菌细胞(酿酒酵母(S.cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)等)。随后根据标准方法表达和纯化GSTP1。重组GSTP1生产也可使用具有利于纯化的附加序列的GSTP1的变体形式，所述附加序列例如金属螯合肽、蛋白质A结构域、亲和纯化标签等(例如US5,976,528A，第16栏)。这样的变体可在纯化后或在纯化过程中被移出，例如经由可切割接头序列(蛋白酶、肠激酶等)。GSTP1的纯化批次制剂可包含例如每mg总蛋白质1至200U GSTP1活性。优选的药用GSTP1组合物包含5至200U/mg蛋白质，特别是10至150U/mg蛋白质。根据本发明的药物制剂总是作为被适当标记的产物而提供，其是无菌的并根据本发明可用于施用给人患者。

根据另一个方面，本发明涉及作为用于CMP或IHD的诊断标靶的GSTP1。本发明提供了GSTP1诊断CMP或IHD的应用。尽管在肿瘤诊断中GSTP1是已知和被确立的标记，但令人惊讶地是GSTP1是CMP或IHD的生物标记，就灵敏性和特异性而言，其甚至优越于目前的“黄金标准”-proBNP。

上面GSTP1的治疗应用涉及的心肌病或缺血性心脏病也可根据本发明进行诊断。

因此，本发明涉及通过测定生物样品中GSTP1或GSTP1 mRNA的量并将该量与具有确定和已知的CMP/IHD状态，特别是来自健康人个体或患者的生物样品中的GSTP1或GSTP1 mRNA量相比较，诊断CMP或IHD，特别是以上提及的适应症的方法。该比较可实际地实施，即其中真实样品以与生物样品相同的方式进行测试(并行的)，其也可为虚拟比较(virtual comparison)，以便测定值与健康或患病样品的已知值相比较。

用于测定GSTP1量的优选技术包括类抗体技术，例如ELISA，任选地与电泳技术或放射免疫分析法(RIA)相结合。电泳技术也可与MALDI技术相结合。

可选地，GSTP1 mRNA可例如通过定量实时RT-PCR进行测定。

优选诊断标靶为怀疑患有CMP或IHD的人患者，处于发展CMP或IHD风险下的人患者或患有CMP或IHD的人患者(其必须被监测疾病进展)。

根据本发明的优选生物样品包括人血液、血浆或血清样品或人心肌活检样品。这些样品也可通过常规方法进行测试。

通常，血清中高浓度的GSTP1是CMP或IHD的指示。在健康人中，GSTP1的血清浓度低于50ng/ml，或优选甚至低于10ng/ml。CMP或IHD患病状态可在50ng/ml或更高，优选100ng/ml或更高的血清水平下进行诊断。严重形式的CMP或IHD可在200ng/ml或更高下进行诊断。当然，这些水平总是依赖用于测定GSTP1蛋白质的技术。可选地，如果与健康状态特别是同一患者的健康状态相比，GSTP1的血清水平升高至少2倍(factor 2)，优选地至少5倍，则可诊断CMP或IHD患病状态。如果与健康状态特别是同一患者的健康状态相比，血清GSTP1水平升高至少10倍，特别是至少20倍，则可诊断严重的形式。

通过本发明，可通过标准测试方法例如ELISA或PCR，在非常短的时间内进行样品中GSTP1或GSTP1mRNA量的测定。基于根据下面SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.1的DNA和氨基酸序列(和以上提及的GSTP1基因和GSTP1蛋白质的数据库实体)，

atgccgccct acaccgtggt ctatttccca gttcgaggcc gctgcgcggc cctgcgcatg    60

ctgctggcag atcagggcca gagctggaag gaggaggtgg tgaccgtgga gacgtggcag    120

gagggctcac tcaaagcctc ctgcctatac gggcagctcc ccaagttcca ggacggagac    180

ctcaccctgt accagtccaa taccatcctg cgtcacctgg gccgcaccct tgggctctat    240

gggaaggacc agcaggaggc agccctggtg gacatggtga atgacggcgt ggaggacctc    300

cgctgcaaat acgtctccct catctacacc aactatgagg cgggcaagga tgactatgtg    360

aaggcactgc ccgggcaact gaagcctttt gagaccctgc tgtcccagaa ccagggaggc    420

aagaccttca ttgtgggaga ccagatctcc ttcgctgact acaacctgct ggacttgctg    480

ctgatccatg aggtcctagc ccctggctgc ctggatgcgt tccccctgct ctcagcatat    540

gtggggcgcc tcagcgcccg gcccaagctc aaggccttcc tggcctcccc tgagtacgtg    600

aacctcccca tcaatggcaa cgggaaacag tga                                 633

本发明也提供了例如用于鉴定金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的PCR测定或夹心ELISA测定。在根据本发明的合适的ELISA中，GSTP1可用GSTP1-特异性抗体从生物样品中发现，并用针对GSTP1不同表位的第二抗体或对先前结合事件(binding event)特异性的抗体进行检测和量化。

通过标准定量核酸测试例如定量RT-PCR进行GSTP1转录物(m-RNA)检测是可能的。因此，本发明也提供了试剂盒，用于测定至少两个合成核酸序列中GSTP1 mRNA的量——用于扩增编码GSTP1或其部分的至少一个核酸序列，其中试剂盒中合成核酸序列至少之一选自：(a)合适的引物对，所述引物为包括以下至少一个的10-30个连续核苷酸的核酸序列：(i)根据SEQ.ID.NO.2或其互补序列的GSTP1mRNA；或(ii)来自GSTP1基因的5’或3’非编码区域(例如在延伸上至500个，优选上至200个，特别是上至100个核苷酸进入5′-或3′-方向的区域中或其互补序列；这样的序列存在于以上提及的序列库实体中)；所述引物适合于使位于GSTP1基因或其5′-或3′-区上的引物之间的核苷酸序列聚合(所述可聚合的GSTP1核苷酸序列是PCR可检测的，并且长度优选上至1000bp，更优选上至500bp，甚至更优选上至300bp；在另一方面，也可选择引物以使整个GSTP1m-RNA聚合(用PCR))；和(b)用于聚合酶链反应(PCR)的合适试剂。优选地，该试剂盒进一步包括：(c)使用说明书和(d)任选地，用于测定和/或量化GSTP1 mRNA的0 阳性和/或阴性对照，特别是编码GSTP1或其片段的对照核酸。合适的PCR试剂的例子包括PCR反应缓冲剂、Mg²⁺(例如，MgCl₂)、dNTP、DNA聚合酶(例如逆转录酶和热稳定DNA聚合酶(例如，Taq相关的DNA聚合酶和Pfu相关的DNA聚合酶))、RNase、PCR反应增强剂或抑制剂、PCR反应监测剂(例如，双链DNA染料(例如SYBRTM绿)、TaqManTM探针、分子信标和ScorpionsTM)和PCR级水。

在此描述的引物特别可用于聚合酶链反应(PCR)测定。PCR是用于体外扩增DNA碱基序列的实用系统。例如，PCR测定可使用热稳定的聚合酶和两个大约10至30个碱基的引物：一个与待扩增序列一端的(+)-链互补，和另一个与在另一端的(-)-链互补。因为新合成的生物样品包括：(a)包括DNA链的引物组可随后用作相同引物序列的附加模板，连续轮次的引物退火、链延长和解离可产生所需序列的快速且高特异性的扩增。PCR也可用于检测包含GSTP1 m-RNA的样品中确定序列的存在。

举个例子，根据本发明的典型的PCR测定可任选地在mRNA逆转录成DNA后开始，分别特异性和互补地结合到靶DNA或其互补链的两个区域的两个合成寡核苷酸引物编码待扩增的GSTP1或其5′-和/或3′区域(每个链一个)。这些可在过量脱氧核苷酸(dNTP)和热稳定DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)的存在下加至靶DNA(其不必是纯的)。在一系列(通常20-40个)温度周期中，靶DNA可被重复变性(大约80-100℃，例如90℃)，与引物退火(通常在40-65℃下)，并且可从引物延伸子链(通常在65-80℃下，例如72℃)。因为子链本身起随后循环的模板的作用，所以匹配两种引物的DNA片段被指数扩增，而不是线性扩增。靶DNA不需要是纯的或丰富的；因此，PCR特别适于根据本发明的临床诊断。

这些测试可优选地使用也适于量化的标记，例如生物素、荧光分子、放射性分子、显色底物、化学发光标记和类似物。用于生物素化核酸的方法在本领域中是公知的，如用于将荧光分子和放射性分子引入寡核苷酸和核苷酸的方法。对于荧光的、放射性的、化学发光的、显色的标记，以及其他通常使用的标记的检测方法是公知的。简言之，化学发光可通过它们的发射波长和强度被最直接地鉴定和量化。当使用生物素时，其可由与可检测标记例如酶(例如辣根过氧化物酶)缀合的抗生物素蛋白、链霉抗生物素或类似物进行检测。链霉抗生物素以高亲和力与生物素结合，未结合的链霉抗生物素被洗掉，并且随后用光发射底物(luminescence-emission substrate)，在过氧化物和合适的缓冲剂的存在下，检测辣根过氧化物酶的存在。

测定样品中GSTP1的量优选包括ELISA、RIA和FACS。在本领域中(特别是在肿瘤药中)通过利用抗GSTP1抗体检测和量化GSTP1是良好确立的，并可容易地用于根据本发明的诊断CMP或IHD的目的(例如WO 98/21359A1(“F.Antibodies”)；US 5,976,528A、US 5,427,917A)。通过将从正常哺乳动物对象优选人取得的体液或细胞提取物与GSTP1的抗体在适于复合体形成的情况下结合，确立GSTP1表达的正常或标准值。标准复合体形成的量可通过多种方法进行量化，优选通过光度测定手段。在对象、样品、对照和疾病中，从活检组织表达的GSTP1的数量与标准值进行比较。标准和对象值之间的偏差建立了用于诊断疾病的参数。如以上已经陈述的，最优选样品为人心脏活检的和源于患有CMP或IHD、怀疑患有CMP或IHD或处于发展CMP或IHD风险下的个体人患者的人血液的样品。

通过以下实施例和附图进一步说明本发明，但不被限制于此。

附图说明

图1显示了DCM和ICM患者中增加的GSTP1和TRAF2。(A)代表性的基因阵列图像显示了与标记的cDNA探针的GSTP1和TRAF2阵列序列(箭头)的杂交增加。(B)代表性的蛋白质阵列图像，其说明了与对照的Cy3(绿)染色相比，DCM和ICM患者心脏的GSTP1和TRAF2蛋白质Cy5(红)染色增强。(C)通过实时RT-PCR量化心肌的GSTP1和TRAF2 mRNA表达。与对照相比，在心力衰竭患者中，GSTP1(*P＜0.0001)和TRAF2(P＜0.0001)mRNA表达被显著地上调。(D)代表性的蛋白质印迹图像和针对蛋白质上样对照水平校正的心肌GSTP1和TRAF2蛋白质表达的量化。与对照相比，在DCM和ICM中对于GSTP1(P＜0.0001，P＝0.0019)和TRAF2(P＜0.0001，P＝0.005)，心肌的蛋白质表达水平升高。当比较DCM和ICM时，在GSTP1 mRNA和蛋白质表达中没有发现显著不同；尽管与ICM相比，TRAF2mRNA(P＝0.001)和蛋白质(P≤0.0001)表达水平在DCM中明显更高。*，对对照显著不同。

图2显示了DCM和ICM中JNK和p38的GSTP1-TRAF2相互作用和活化。(A)DCM、ICM和对照中心肌GSTP1-TRAF2复合体形成的代表性蛋白质印迹图像和量化。LV心肌的溶胞产物被免疫沉淀(IP)，并在蛋白质印迹上分析沉淀物。发现与ICM和对照(*P≤0.008)相比，DCM中明显较低的GSTP1-TRAF2联合。(B)DCM、ICM和对照中心肌的活性JNK1和p38蛋白质表达的代表性蛋白质印迹图像和量化。与对照相比，在DCM和ICM中，活性JNK以及p38(P＜0.0001)的心脏蛋白质表达被显著上调。此外，与ICM相比，DCM患者显示了明显更高的心脏JNK和p38蛋白质表达(P＜0.0001)。所有蛋白质表达都针对蛋白质上样对照水平进行校正。*，对对照显著不同。

图3显示了GSTP1调节心脏组织培养物中心脏的TRAF2-JNK1/p38系统。(A)用5μg/mL重组GSTP1处理(治疗)的心脏组织培养物中TRAF2、GSTP1、活性JNK和活性p38蛋白质表达的代表性蛋白质印迹图像。(B)用重组GSTP1(2.5、5、10μg/ml)处理24h的DCM、ICM和对照心脏组织培养物中TRAF2、活性JNK和活性p38蛋白质表达的量化。与未处理的相比，TRAF2的蛋白质表达显著降低，这依赖于所用的浓度(DCM：P＝0.011对于2.5μg/mL，P＝0.014对于5μg/mL，P＝0.003对于10μg/mL；ICM：P＝0.006对于2.5μg/mL，P＝0.003对于5μg/mL，P＝0.0001对于10μg/mL；对照：P＝0.19对于2.5μg/mL，P＝0.0003对于5μg/mL，P＝0.03对于10μg/mL)。与未处理的组相比，在GSTP1处理之后，DCM、ICM和对照心脏组织中活性JNK表达下降，这依赖于所用的浓度(DCM：P＝0.0009对于2.5μg/mL，P＝0.01对于5μg/mL，P＝0.0003对于10μg/mL；ICM：P＝0.0005对于2.5μg/mL，P＝0.007对于5μg/mL，P＜0.0001对于10μg/mL；对照：P＝0.001对于2.5μg/mL，P＝0.69对于5μg/mL，P＝0.71对于10μg/mL)。同样地，与未处理的相比，响应在DCM、ICM和对照心脏组织中GSTP1处理，活性p38表达减少，这依赖于所用的浓度(DCM：P＝0.004对于2.5μg/mL，P＜0.0001对于5μg/mL，P＝0.0009对于10μg/mL；ICM：P＝0.03对于2.5μg/mL，P＝0.0001对于5μg/mL，P＝0.008对于10μg/mL；对照：P＝0.008对于2.5μg/mL，P＝0.0004对于5μg/mL和10μg/mL)。对于TRAF2、JNK和p38减少，所应用的GSTP1浓度的比较指示在DCM和ICM而不在对照中，2.5μg/mL和5μg/mL以及10μg/mL之间的差异是显著的。TRAF2：(DCM：P＝0.01对于2.5对5μg/mL和对10μg/mL，P＝0.62对于5对10μg/mL；ICM：P＝0.0007对于2.5对5μg/mL，P＝0.0004对于2.5对10μg/mL，P＝0.35对于5对10μg/mL；对照：P＝0.07对于2.5对5μg/mL，P＝0.06对于2.5对10μg/mL，P＝0.15对于5对10μg/mL)。JNK：(DCM：P＝0.0006对于2.5对5μg/mL，P＝0.003对于2.5对10μg/mL，P＝0.48对于5对10μg/mL；ICM：P＝0.004对于2.5对5μg/mL，P＝0.01对于2.5对10μg/mL，P＝0.88对于5对10μg/mL；对照：P＝0.02对于2.5对5μg/mL，P＝0.05对于2.5对10μg/mL，P＝0.97对于5对10μg/mL)。p38(DCM：P＝0.0002对于2.5对5μg/mL，P＝0.04对于2.5对10μg/mL，P＝0.76对于5对10μg/mL；ICM：P＝0.0006对于2.5对5μg/mL，P＝0.02对于2.5对10μg/mL，P＝0.41对于5对10μg/mL；对照：P＝0.06对于2.5对5μg/mL，P＝0.08对于2.5对10μg/mL，P＝0.29对于5对10μg/mL)。(C)来自用重组GSTP1(5μg/ml)处理并经历免疫沉淀(IP)的DCM、ICM和对照心脏组织培养物的心肌GSTP1-TRAF2复合体的代表性蛋白质印迹图像。GSTP1处理的心脏组织培养物的GSTP1和TRAF2之间联合是独立于剂量和疾病的并且与未处理的样品相比，明显更高(P＝0.02对于5μg/mL GSTP1浓度；2.5和10μg/mL GSTP1浓度的结果未示出)。*，对对照显著不同。对用GSTP12.5μg/ml处理的组织培养物显著不同。对用5μg/ml和10μg/ml GSTP1处理的组织显著不同。

图4显示了在DCM心脏培养物中，TNF-α消除了TRAF2-JNK1/p38级联(cascade)对GSTP1的灵敏性。用TNF-α(50ng/ml)和GSTP1(5μg/ml)处理的DCM、ICM和对照心脏组织培养物的(A)代表性蛋白质印迹图像和(B)量化。在DCM心脏组织培养物中，TNF-α-活化的JNK(P＝0.08)和p38(P＝0.75)级联以及TRAF2(P＝0.18)蛋白质表达不被重组GSTP1影响。在ICM和对照中，响应GSTP1刺激，活性JNK(P＜0.001；P＜0.002)，活性p38(P＜0.0002；P＜0.0001)和TRAF2(P＜0.001；P＝0.003)蛋白质表达显著降低。GSTP-处理的ICM和DCM心脏组织培养物的比较指出与DCM相比，ICM中明显更低的TRAF2、活性JNK和p38(P＜0.001)蛋白质表达。(C)用TNF-α(50ng/ml)和GSTP1(5μg/ml)处理的免疫沉淀的心脏组织溶胞产物的代表性蛋白质印迹图像。与ICM和对照心脏组织相对，在DCM心脏组织中TNF-α刺激后存在GSTP1与TRAF2的联合失败。

图5显示了较高的GSTP1浓度拯救(rescue)TNF-α处理后TRAF2-介导的JNK1/p38下调。用TNF-α(50ng/ml)和GSTP1(10μg/ml)处理的DCM、ICM和对照心脏组织培养物的(A)代表性蛋白质印迹图像和(B)量化。(B)该结果说明与TNF-α-处理的对照相比，用10μg/mL GSTP1和TNF-α处理的DCM心脏组织培养物表示显著降低的JNK和p38活化，以及降低的TRAF2蛋白质表达(*P＜0.0001)。(C)DCM心脏组织溶胞产物的免疫沉淀说明与5mg/ml GSTP1相比，10μg/ml GSTP1显著(P≤0.035)增加GSTP1-TRAF2联合。

图6显示了血清和心脏的GSTP1与CMP有关。(A)代表性的血清蛋白质阵列图像说明与对照(EF≥65％；n＝40)相比，末期心力衰竭(HF)(EF≤35％；n＝40)患者中血清GSTP1蛋白质增强的Cy3(绿)和Cy5(红)染色。(B)ELISA测量指示相比于对照(EF≥65％；n＝40)，在末期HF患者(EF≤35％；n＝40)中，血清GSTP1浓度的显著(*P＜0.0001)升高。(C)代表性的心脏组织蛋白质阵列图像说明与对照(EF≥65％；n＝20)相比，末期HF患者(EF≤35％；n＝40)中心脏的GSTP1蛋白质增强的Cy3(绿)和Cy5(红)染色。(D)针对蛋白质上样对照水平校正的心肌GSTP1蛋白质表达的代表性蛋白质印迹图像和量化。相比于对照心脏的移植组织(*P≤0.001)，在末期HF患者中GSTP1蛋白质水平显著升高，EF≤35％。

图7显示了血清GSTP1和proBNP与射血分数(EF)关联，以及GSTP1和proBNP之间的相关性。(A)与所有其他EF组相比，具有EF≤22％的心力衰竭患者具有显著较高的血清GSTP1浓度。与具有EF＞52％和EF 43-52％的患者相比，具有EF33-42％、EF23-32％和EF≤22％的患者具有显著较高的血清GSTP1浓度。(B)与所有其他EF组相比，具有EF≤22％的患者具有显著较高的血清proBNP浓度。在所有其他EF组之间没有观察到血清proBNP中的显著差异。(C)所有研究对象的血清GSTP1和血清proBNP测量的相关性图。注意到在血清GSTP1和proBNP之间的显著的正关联(r＝0.47；P＜0.0001)。*P＜0.001对对照，P＜0.0001对EF＞52％，P＜0.0001对EF 43-52％，§P＜0.0001对EF 33-42％，‖P＜0.0001对EF 23-32％。

图8显示了血清GSTP1和proBNP与心脏功能的相关性。(A)在研究对象中，血清GSTP1和proBNP浓度与心脏射血分数(EF)的相关性。该分析指示了与血清proBNP浓度(r＝-0.27；P＝0.0006)相比，EF与血清GSTP1(r＝-0.74；P＜0.0001)的显著负相关较高。(B)对于鉴定EF≤22％，ROC曲线分析指示了在≥226ng/ml的最佳截止水平上(黑线；AUC＝0.891，P＜0.0001)，血清GSTP1的81％的灵敏性和82％的特异性和在≥527pg/ml的最佳截止水平上(红线；AUC＝0.624，P＝0.0039)，血清proBNP的97％的灵敏性和26％的特异性。(C)对于鉴定EF≤42％，ROC曲线分析指示了在≥76ng/ml的最佳截止水平上(AUC＝0.974，P＝0.0008)，血清GSTP193％的灵敏性和100％的特异性。

图9显示了GSTP1抑制大鼠急性MI模型中的炎性细胞因子。(A)免疫沉淀和蛋白质印迹显示了在GSTP1-处理和对照动物之间GSTP1-TRAF2复合体形成没有差异；(B)如由蛋白质印迹分析的，GSTP1减少活化的JNK1蛋白质表达水平；(C)GSTP1抑制了数种炎性细胞因子的心肌组织mRNA表达。*；p＜0.01。

图10显示了GSTP1改善大鼠衰竭(缺陷，failing)心脏中的炎症。(A)GSTP1-处理的动物具有GSTP1-TRAF2、GSTP1-JNK1和GSTP1-p38之间显著较高水平的复合体形成，如通过免疫沉淀和蛋白质印迹分析所示的；(B)与对照相比，在GSTP1-处理的动物中活化JNK1、p38和NF-κB的蛋白质表达显著较低，如蛋白质印迹分析所示的；(C)GSTP1抑制了炎性细胞因子TGF-B、IL-1B、IL-2和IL-17的mRNA表达；和与对照相比，衰竭心肌中抗炎性细胞因子IL-10的mRNA表达增加。*；p＜0.001。

图11显示了GSTP1减弱心力衰竭的大鼠缺血诱导模型的心肌重建。(A)Goldner三色胶原蛋白染色显示了与对照相比，GSTP1-处理的动物心脏中显著较低的组织重建；(B)与对照相比，在GSTP1-处理的大鼠的左心室(梗塞)壁厚度显著更大；(C)用GSTP1或对照载体处理的大鼠心脏的代表性Tunnel测定图像。条(bar)＝25μm；(D)与对照相比，GSTP1-处理的大鼠具有显著较低的细胞凋亡指数。*；p＜0.01。

图12显示了GSTP1改善缺血诱导的心力衰竭的大鼠模型的左心室功能。(A)在心肌梗塞后21天，GSTP1-处理的大鼠具有显著较高的左心室射血分数；(B)与GSTP1-处理的动物相比，对照中左心室端舒张期容积显著更大。*；p＜0.05。

实施例

1、GSTP1改善了心肌病(CMP)和缺血性心脏病(IHD)中的炎症

患者和组织取样

该研究得到维也纳医科大学伦理委员会(Ethics Committee of theMedical University of Vienna)许可。给出知情同意书而被登记的70位CMP患者(特发性扩张性心肌病(DCM)，n＝35；缺血性心肌病(ICM)，n＝35)的心脏组织样品用于最初的阵列分析。随后，包括在2004年1月和2008年7月之间的总计100位CMP患者(DCM，n＝50；ICM，n＝50)。表1概括了人口统计学、最重要的临床和血液动力学特点和患者的治疗。所有患者都已经优化了心力衰竭治疗并根据美国心脏协会标准(American Heart Association Criteria)计划心脏移植。所有患者都经历了回波心脏描记术、冠状动脉血管造影术、右心导管插入术和磁共振成像，用于由独立的心脏病学家评估心室功能、心肌生存力和标准血液动力学参数。病历、临床测试结果和治疗被记录和编码并对心脏活检的研究者隐藏(blinded)。对照组由20位没有心脏疾病史的心脏捐献者组成，他们的心脏由于质量原因不能被移植。

表1：研究患者的人口统计学数据、血液动力学参数和药物治疗。

ACE，血管紧张素转化酶；BMI，体重指数；BSA，体表面积；DCM，扩张性心肌病；ICM，缺血性心肌病；LVEF，左心室射血分数；PAP，肺动脉压；PCWP，肺毛细血管楔压；PVR，肺血管阻力。

cDNA阵列

用Oligotex-dT试剂盒(Quiagen，Valencia CA)分离聚(A+)-RNA，并且第一链cDNA合成用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Promega，Madison，WI)在2μg聚(A+)RNA上进行。降解在DNA-RNA双链体内的RNA链，并在Sephadex G-50离心柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上纯化产物。对于反链引发，如所描述的，使用第一链cDNA生成cDNA阵列(GEArray Q Human Apoptosis Gene Array，SuperArray Bioscience，Frederick，MD)的[α-32P]dCTP-标记的第二链cDNA(et al.，Circulation 108(2003)，1585-1591)。用ImageQuant软件(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)量化混合cDNA杂交信号。心脏组织蛋白质阵列

如所描述的，蛋白质阵列在抗体微阵列500(Clontech，MountainView，CA；507蛋白质)上进行(Aharinejad et al.，Circulation 120(2009a)，11Suppl：S198-205)。每个样品中的蛋白质用2种不同荧光染料标记并在微阵列抗体包被的载玻片上温育。两个载玻片的蛋白质荧光信号通过GenePix 4000B扫描仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)检测。信号的量化通过计算内源标准化信噪比(internally normalized ratio，INR)进行，这通过使用自动微阵列分析工作书(Microarray AnalysisWorkbook)(http://bioinfo.Clontech.com)，相对于对照样品中的抗原丰度产生CMP样品中的抗原丰度。具有阈值区间外的INR值的蛋白质被认为差异性地表达。

mRNA分离和定量实时RT-PCR

用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)将总RNA从心肌活检中分离。在MagNA Lyser系统(Roche，Mannheim，Germany)中，用MagNA LyserGreen Beads在6000rpm下匀浆组织20-30秒。被匀浆的样品随后与200μL氯仿混合，在室温下温育2-3分钟并在12000g、4℃下离心15分钟。收集RNA，并用2μg总RNA和M-MuLV-RT试剂盒(Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)合成cDNA。如所描述的，实时RT-PCR在LightCycler仪器(Roche)上进行(Aharinejad et al.，Am J Transplant.5(2005)，2185-2192)。该引物序列是有义/反义的：

GSTP 1：5′-GGCAACTGAAGCCTTTTGAG-3′/5′-TCATGGATCAGCAGCAAGTC-3′；

TRAF2：5′-GCAGAAGGTCTTGGAGATGG-3′/5′-GGTGGAGCAGCATTAAGGTC-3′；和β2-微球蛋白：5′-GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3′/5′-CAATCCAAATGCGGCATCT-3′。如先前所描述的，在对持家基因β2-微球蛋白的表达标准化后，mRNA表达单元被确定(Aharinejad et al.，2009a and 2005；Pfaffl，Nucleic AcidsRes.29(2001)：e45)，并作为相对于对照中那些的百分比绘制CMP患者。测量进行三次。每个样品中三个PCR测量的平均值用于数据分析。

共免疫沉淀和蛋白质印迹

如所描述的，在4℃下，人心脏组织在补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)的溶胞缓冲剂中裂解，该溶胞缓冲剂包含20mM Tris(pH 7.5)、135mM NaCl、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2mM二硫苏糖醇(DTT)、25mMβ-磷酸甘油、2mM焦磷酸钠、10％甘油、1％Triton X-100、1mM原钒酸钠、10mM NaF和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)(Aharinejad et al.，2005)。溶胞产物在4℃下离心(15000g)15min。为了鉴定GSTP1-TRAF2复合体形成，将蛋白质(500μg)用TRAF2抗体(0.5μg，BD Pharmingen，San Diego，CA)进行免疫沉淀。预清除的蛋白质A/G PLUS-琼脂糖珠(Santa CruzBiotechnology)与免疫复合体一起温育另外2h，并用溶胞缓冲剂冲洗四次。免疫沉淀物进一步经历SDS-PAGE并用抗-GSTP1单克隆抗体(Bethyl，Montgomery，TX)进行蛋白质印迹分析。

如所描述的，蛋白质溶胞产物(50μg/泳道)在电泳转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)前，通过SDS-PAGE(10％)分离(Aharinejadet al.，2005)。在与辣根过氧化物酶-缀合的第二抗体(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)一起温育前，将印迹与以下物质进行温育：一级人单克隆抗-GSTP1抗体(Bethyl，Montgomery，TX)、人单克隆抗-TRAF2(BD Pharmingen，San Diego，CA)、人多克隆磷-p38(Promega，Madison，WI)、人多克隆磷-JNK(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、人多克隆抗JNK(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、人多克隆抗p38(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。蛋白质上样由丽春红S染色评估，并且通过化学发光进行免疫检测(Supersignal-West-Pico，Pierce，Rockford，IL)。条带通过ImageQuant软件量化，并且特异蛋白质信号对于上样对照标准化，并表达为任意单位。每个样品中三个测量的平均值用于数据分析。

心脏组织培养物实验

如所描述的，对照、DCM或ICM患者的新鲜分离的心肌(2至3mm³)，在包含5％CO₂的完全潮湿化的空气气氛中，在37℃下，在包含10％胎牛血清(Gibco，Carlsbad，CA)、50U/ml青霉素和250μg/ml链霉素(pH 7.2)的DMEM中进行温育(100片每6孔平板)(et al.，2003)。6小时后，孔用重组GSTP1(2.5、5或10μg/ml；Assay Design(测定设计)，Ann Arbor，MC)和/或TNF-α(50ng/ml；eBioscience，San Diego，CA)处理(Wu et al.，2006)。温育24小时后，更换培养基并分析心脏组织培养物溶胞产物。实验进行三次。

统计学分析

通过方差的x2检验和单向分析(单向ANOVA；Tukey检验)，根据变量(连续或绝对的(categorical))的标度，比较组之间的临床参数、患者特点、GSTP1和TRAF2的mRNA表达水平，和GSTP1、TRAF2、活性p38和活性JNK的蛋白质表达水平。所有统计学分析都利用Windows，9.1.3版和Enterprise Guide，4.1版的SAS系统(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)进行。统计学显著性被设定为P＜0.05。结果表达为平均±标准差(SD)。

结果

GSTP1和TRAF2在衰竭心肌中过表达

与对照个体相比，在随机选择的患有DCM和ICM二者的患者中，筛选组织表达谱阵列(screening tissue profiling array)鉴定较高的心脏GSTP1和TRAF2基因以及蛋白质表达水平(图1A、1B)。为了证实在筛选阵列中获得的结果，随后通过研究群组中的实时RT-PCR和蛋白质印迹预期地检查GSTP1和TRAF2的心肌表达。这些分析指示与对照相比，对于GSTP1(P＜0.0001)和TRAF2(P＜0.0001)，DCM和ICM中心肌mRNA表达水平显著升高(图1C)。同样地，与对照相比，对于GSTP1(P＜0.0001，P＝0.0019)和TRAF2(P＜0.0001，P＝0.005)，在DCM和ICM中心肌蛋白质表达水平升高(图1D)。当比较DCM和ICM时，没有发现GSTP1 mRNA和蛋白质表达中的显著差异；尽管与ICM相比，TRAF2mRNA(P＝0.001)和蛋白质(P≤0.0001)表达水平在DCM中明显较高(图1C、1D)。

JNK/p38活化中的GSTP1-TRAF2相互作用

因为在肿瘤细胞中GSTP1物理上与TRAF2联合并形成细胞内复合体，所以确定是否该途径在衰竭心肌中是活性的。在心脏组织培养物中的本分析显示了GSTP1与ICM和对照心脏组织中的TRAF2联合，然而该联合在DCM中是明显小不可检测的(P＜0.0001)(图2A)。因为TRAF2据报道活化对介导衰竭心肌中的炎症已知的两个主要的MAP激酶，JNK和p38，所以检查了研究患者中活性p38和JNK蛋白质的心肌表达。结果显示与对照相比，在DCM和ICM二者中，活性JNK以及p38(P＜0.0001)的心脏蛋白质表达被显著上调。此外，与ICM相比，DCM患者显示了明显较高的心脏JNK和p38蛋白质表达(P＜0.0001)(图2B)。这些结果显示了GSTP1-TRAF2联合在DCM和ICM中被差异性地调节，并且这可影响MAPK活化。

GSTP1调节心脏的TRAF2-介导的JNK/p38活化

为了确定GSTP1是否调节TRAF2-介导的JNK和p38活化，来自衰竭心脏和对照的心脏组织培养物用三个不同浓度的重组GSTP1处理。结果显示与未处理的相比，在从DCM、ICM和对照获得的GSTP1-处理的组织培养物中，TRAF2的蛋白质表达显著降低。相似地，与未处理组相比，GSTP1处理后，在DCM、ICM和对照心脏组织中活性JNK和p38表达下降。相对于TRAF2、JNK和p38减少，所应用的GSTP1浓度的比较显示了在DCM和ICM而不在对照中，2.5μg/mL和5μg/mL以及10μg/mL之间的差异是显著的(图3A、3B)。

为了测试外源性补充的GSTP1是否影响GSTP1-TRAF2复合体形成，GSTP1-处理的心脏组织溶胞产物用TRAF2抗体进行免疫沉淀，并且免疫沉淀经历蛋白质印迹。结果显示在GSTP1-处理的心脏组织培养物中，GSTP1和TRAF2之间的联合独立于剂量和疾病并且与未处理的样品相比，明显更高(对于5μg/mL GSTP1浓度，P＝0.07)(图3C)。

这些结果显示了在心脏组织培养物中，GSTP1影响TRAF2蛋白质表达并通过GSTP1-TRAF2复合体形成起到JNK1和p38活化的负调节物的作用。

在DCM中，TNF-α消除了TRAF2/JNK/p38级联对GSTP1的灵敏性

为了确定在衰竭心肌中GSTP1是否与报道的TNF-α诱导的JNK和p38活化相互作用，从DCM、ICM和对照分离的心脏组织培养物用重组TNF-α随后用5μg/ml的GSTP1进行处理。这些实验说明在DCM心脏组织培养物中，TNF-α-活化的JNK(P＝0.08)和p38(P＝0.75)级联以及TRAF2(P＝0.18)蛋白质表达不被重组GSTP1影响。然而，在从ICM和对照分离的培养物中，响应GSTP1刺激，JNK(P＜0.001；P＜0.002)，p38(P＜0.0002；P＜0.0001)和TRAF2(P＜0.001；P＝0.003)蛋白质表达显著降低(图4A)。为了理解从DCM对ICM组获得的该分歧的结果，用TNF-α和GSTP1处理的心脏组织溶胞产物被免疫沉淀，并且该免疫沉淀经历蛋白质印迹。这些分析显示了在DCM心脏组织中TNF-α刺激后GSTP1与TRAF2的联合失败(图4B)。然而，该作用在ICM和对照心脏组织中不存在(图4C)。这些数据显示了在5μg/ml GSTP1下，在DCM心脏组织培养物中，TNF-α-介导的TRAF2结合GSTP1失败。

较高浓度的GSTP1拯救TNF-α处理后TRAF2-介导的JNK1/p38下调

记住与ICM和对照相比，DCM中TRAF2心脏组织蛋白质表达高出大约两倍，并且考虑到以上描述的结果，我们测试了TNF-α处理后较高GSTP1浓度的影响。结果说明用10μg/mL GSTP1和50ng/mLTNF-α处理的DCM心脏组织培养物表示了显著降低的JNK和p38活化以及降低的TRAF2蛋白质表达(P＜0.0001；图5A、5B)。重要地，DCM心脏组织溶胞产物的免疫沉淀物说明与5mg/ml GSTP1相比，10μg/ml下的GSTP1-TRAF2联合显著(P≤0.035)增加。

这些数据显示了在DCM中较高的GSTP1浓度通过GSTP1-TRAF2复合体形成抑制了TNF-α诱导的JNK和p38活化，并且也影响了TRAF2表达。

在本实施例中，GSTP1和TRAF2被认为是CMP的新型介质。GSTP1和TRAF2之间的相互作用之前已经在恶性肿瘤中被鉴定(Wu etal.2006)，然而，与CMP的联系之前还没有被提示。有趣地，GSTP1联合TRAF2的能力以TNF-α依赖的方式在DCM和ICM之间不同。尽管在CMP中破坏TNF-α信号传导的促炎作用被很好地确立了，但临床试验已经矛盾性地指示了TNF-α在CMP中更复杂的作用。靶向涉及TNF-α信号传导的特定途径可因此提供CMP治疗中更可选择的方法。TRAF2为介导MAPK活化的TNF-α信号传导的中心调节物。同时，GSTP可通过与TRAF2的联合消除MAPK活化，并因此阻止TNF-α信号传导。本数据显示了与ICM和对照相比，DCM心肌中活性JNK和p38的显著升高。

重要地，说明了用重组GSTP1蛋白质补充细胞内GSTP1储存通过抑制MAPK信号传导有效阻止了全身和局部炎性应答。令人感兴趣地，与在该研究的天然DCM心肌中观察到的发现相对，重组GSTP1诱导JNK和p38活性的抑制以及心脏组织培养物中总TRAF2蛋白质表达的降低。该作用伴随所有GSTP1处理的心脏细胞培养物中GSTP1-TRAF2联合的大大增加。此外，在5μg/ml下，观察到GSTP1弱化(attenuation)对TRAF2-JNK/p38系统的最大作用，并且其不被进一步的浓度增加影响。这些结果与那些用心脏组织获得的结果矛盾。然而，在GSTP1处理后，活性JNK/p38和TRAF2的表达水平在来自DCM患者的培养物中最高。因为与ICM和对照心脏组织培养物相比，在DCM中没有观察到GSTP1温育后GSTP1-TRAF2复合体形成的差异，所以另外的因子可能有助于在CMP中GSTP1-TRAF2联合的细胞内调节。通过分析心肌样品和体外实验获得的数据之间的差异可由通常存在于天然心肌但不在心脏组织培养物中的可溶、循环因子的存在解释。因为TNF-α在CMP患者血清中被极大升高，并且已经涉及潜在的病理，所以心脏组织培养物在重组GSTP1施用前被预温育，以便引入体外模型中TNF-α的作用。明显地，在ICM心脏培养物中，TNF-α刺激的心脏组织培养物与5μg/ml GSTP1的温育不影响GSTP1-TRAF2联合，但是在DCM心脏培养物中，GSTP1-TRAF2复合体形成被完全消除了。此外，除了在DCM心脏组织培养物中之外，观察到活性JNK/p38以及TRAF2未改变的高表达。这些结果与那些通过分析心肌活检获得的结果一致，并完全支持在DCM患者中，被削弱的GSTP1-TRAF2相互作用导致MAPK活性增加。

这些数据显示了GSTP1浓度的进一步增加恢复GSTP1-TRAF2联合并且抑制TNF-α刺激后DCM心脏组织培养物中的JNK1和p38活性。这些结果显示仅与DCM病理相关的TNF-α诱导的GSTP1-TRAF2结合的弱化，可通过较高浓度的GSTP1消除。此外，说明在ICM心脏组织培养物中，重组GSTP1，以独立于剂量和TNF-α的方式抑制JNK1和p38活性。这些结果显示ICM中的GSTP1作用可通过独立于TRAF2的方式发生。

综上所述，这些结果显示了GSTP1在调节TNF-α/TRAF2中的新功能引发了DCM中JNK1/p38活化。另外，GSTP1-TRAF2联合，在DCM中而不在ICM或对照心肌中通过TNF-α-刺激以GSTP1浓度依赖性的方式保证(guard)。这些发现显示了(也见：张贴公开的摘要Aharinejad et al.，Circulation 120(November 2009)，S905；enhancement ofcardiovascular sensitivity to cyclophosphamide：Haberzettl et al.，Circulation 120(November 2009)，S718)本发明的功能性——作为以GSTP1的抗炎作用为目标的可靠、先进的治疗策略。

2、血清GSTP1为CMP的敏感标记

患者和方法

患者

该研究得到维也纳医科大学伦理委员会的许可。CMP患者(EF≤35％；n＝40)和健康志愿者(EF≥65％；n＝40)的血清样品用于最初的阵列分析。随后，预期包括给出知情同意书而被登记的总共161位患者。该研究群组包括计划心脏移植的141位末期CMP患者和经历传统分离主动脉瓣或二尖瓣手术，具有维持的EF的20位患者。所有患者都经历了回波心脏描记术、冠状动脉血管造影术和右心导管插入术，用于由两个独立的心脏病学家评估心室功能和标准血液动力学参数。病历、临床测试结果和治疗被记录和编码并对血清样品的研究者隐藏。

基于他们由回波心脏描记术评估的左心室EF，将研究患者再分组，如下：EF＞52％；EF 52-43％；EF 42-33％、EF 32-23％和EF≤22％，如所描述的(Lee et al.，Circulation 119(2009)3070-3077)。对照组(n＝20)由10位男性和10位女性组成，年龄为30-61岁(51.8±3.2岁)。

血清和心脏组织收集

在CMP诊断中或在移植前不久收集外周静脉血液样品(Aharinejadet al.，Am.J.Transplant.9(2009b)，149-159)。血清样品被编码并储存在液氮中直到分析。多个心肌活检从移植患者(EF≤35％；n＝40)的移植心脏的前部左心室壁(LV)和由于质量原因不能被移植的20位捐献者心脏(EF≥65％，平均年龄45±10，12位男性，8位女性)获得，编码并在液氮中速冻。

血清和心脏组织蛋白质阵列

对于蛋白质阵列，随机选择的血清样品从移植前不久的末期CMP患者和健康志愿者获得，并对每个组进行集合(pool)。对于心脏组织蛋白质阵列，使用来自移植患者(n＝40)的移植心脏和捐献者对照心脏(n＝20)的LV心肌活检的组织溶胞产物(Abraham et al.，Circ.Res.87(2000)，644-647)。根据制造商的方案，蛋白质阵列在抗体微阵列500(Clontech，Mountain View，CA；507蛋白质)上进行。每个样品中的蛋白质用2种不同荧光染料(Cy3和Cy5)标记并在微阵列抗体包被的载玻片上温育。两个载玻片的蛋白质荧光信号通过GenePix 4000B扫描仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)检测。信号的量化使用自动微阵列分析工作书(http://bioinfo.clontech.com)，通过计算内源标准化信噪比(INR)进行。

GSTP1和proBNP测定

对GSTP1的酶联免疫吸附测定(ELISA)(HEPKIT^TM-Pi，BiotrinInternational Ltd.，Dublin，Ireland)根据制造商的方案进行。底物反应在450nm处，通过使用96孔自动微平板读出器(Anthos，Salzburg，Austria)进行分光光度测量量化。N-末端proBNP在ROChe Elecsys 2010分析仪上，在未稀释的血清中通过化学发光非竞争性ELISA(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)进行自动测量。

mRNA分离和定量实时RT-PCR

利用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)和MagNA Lyser系统(Roche，Mannheim，Germany)将总RNA从LV活检中分离。如所描述的，实时RT-PCR在LightCycler仪器(Roche)上进行(Aharinejad et al.，2009b，Abraham et al，2000)。引物序列是有义/反义的：

GSTP1：5′-CCAAAGGTGGTGAGCTTCAT-3′/5′-TCTACCCAGCATGGAGGAAC-3′；和β2-微球蛋白：5′-GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3′/5′-CAATCCAAATGCGGCATCT-3′。GSTP1的mRNA表达水平对作为持家基因的β2-微球蛋白信号标准化(Aharinejad et al.，2009b，Abraham et al，2000)。每个样品中三个PCR测量的平均值用于数据分析。

蛋白质印迹分析

制备组织溶胞产物(Aharinejad et al.，2009b)，并利用一级人单克隆抗GSTP1抗体(Bethyl，Montgomery，TX)，通过蛋白质印迹分析GSTP1表达。蛋白质带通过ImageQuant软件量化，并且特异蛋白质信号对上样对照标准化。每个样品中三个测量的平均值用于数据分析。

统计学分析

通过方差分析(单向ANOVA；Tukey检验)，在患者组之间比较GSTP1和proBNP血清浓度。为了研究GSTP1和proBNP之间的关系，以及GSTP1与年龄、PAP、PCWP、PVR、心脏指数和肌酸酐的关系，计算了施佩尔曼秩相关系数(Spearman′s rank correlationcoefficients)(rS)。一元逻辑回归用于描述GSTP1和proBNP作为EF预测因子的使用。相应的接受者操作特性曲线(ROC)分析用于发现最佳截止水平。GSTP1和proBNP截止的灵敏性和特异性通过表分析进行计算。所有统计学分析都利用Windows，9.1.3版和Enterprise Guide，4.1版的SAS系统(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)进行。统计学显著性被设定为P＜0.05。结果表达为平均±标准差。

结果

GSTP1与CMP相关

研究患者的人口统计学数据、临床特点和最CMP相关药物治疗在表2中示出。

表2：研究患者的人口统计学数据、临床特点和最CMP相关药物治疗。

DCM＝扩张性心肌病；EF＝左心室射血分数；ICM＝缺血性心肌病；IDDM＝胰岛素依赖性糖尿病；NIDDM＝非胰岛素依赖性糖尿病；NYHA＝纽约心脏协会；PAP＝肺动脉压；PCWP＝肺毛细血管楔压；PVR＝肺血管阻力。

在选择的CMP患者中混合血清样品的定向蛋白质阵列筛选中，GSTP1被鉴定为与CMP相关的新蛋白质。图6A显示了GSTP1的阵列图像，并指出与健康志愿者相比，GSTP1的血清蛋白质水平在CMP患者中增加。这些筛选分析后，通过GSTP1-特异性ELISA，在选择用于筛选分析的相同患者群组中确定血清GSTP1浓度。这些结果显示与对照样品相比，在末期HF患者中，血清GSTP1浓度显著上调(图6B，P≤0.001)。

为了了解心肌GSTP1蛋白质水平，使用通过血清阵列分析的相同末期HF患者的LV心肌样品开始组织蛋白质表达谱，并使用捐献心脏的LV心肌活检作为对照。组织表达谱的结果指出与对照相比，在末期HF患者的心肌中，GSTP1表达水平升高(图6C)。为了证实这些发现，对心脏组织进行蛋白质印迹分析，并发现与对照相比，在患有末期HF的患者中，GSTP1蛋白质表达水平显著上调(P＜0.001；图6D)。GSTP1和proBNP与EF的关联

为了理解GSTP1与CMP的关联，在所有研究患者中分析其血清水平，并相对于患者的EF绘制这些结果。通过选择使被维持和减少的EF之间的差异得以实现的该类型分析，与所有其他EF组相比，在具有EF≤22％的患者中发现显著较高的血清GSTP1浓度(图7A；P＜0.0001)。另外，与那些具有EF在43-52％之间或＞52％的患者相比，具有EF在23-32％之间和EF 33-42％之间的CMP患者具有显著较高GSTP1血清浓度(图7A；P＜0.0001)。对血清proBNP的相同类型的分析显示在本患者群组中，与除了具有EF在33-42％之间的患者的所有其他EF组相比，仅那些具有EF≤22％的患者具有显著较高的血清proBNP浓度(P＜0.0001)(图7B)。当比较其他EF组时，没有观察到循环的proBNP的显著差异。在整个人群中，注意到在GSTP1和proBNP之间的显著正相关(r＝0.47，P＜0.0001；图7C)。

与CMP中的proBNP相比，血清GSTP1的诊断价值

为了说明具有血清GSTP1和proBNP与EF之间的相关性，进行溜冰图(skater plot)分析，其包括所有研究患者(图8A)。这些分析显示了GSTP1和EF之间显著的负相关(r＝-0.74；P＜0.0001)，其高于proBNP和EF之间的相关性(r＝-0.27；P＝0.0006)。当进入对EF≤22％的ROC曲线分析中的血清GSTP1测量时，在一元逻辑回归分析中，对于GSTP1和proBNP，EF≤22％被鉴定为显著不同的，对于鉴定EF≤22％，在≥226ng/ml的最佳截止水平上，血清GSTP1具有81％的灵敏性和82％的特异性(AUC＝0.891，P＜0.0001)。对于诊断具有EF≤22％的CMP患者，在≥527pg/ml的截止水平上的相同类型的分析对于血清proBNP显示97％的灵敏性和26％的特异性(AUC＝0.624，P＝0.0039)(图8B)。随后分析GSTP1血清水平诊断较高EF患者组的能力，如由以上示出的一元分析所指示的(proBNP在具有EF＞22％的患者组之间没有显著差异)。ROC曲线分析指示在≥76ng/ml的最佳截止水平上的GSTP1，诊断具有EF≤42％的CMP患者，其具有93％灵敏性和100％特异性(AUC＝0.974，P＝0.0008)(图8C)。

GSTP1和proBNP与人口统计学和临床参数的相关性

研究患者的GSTP1和proBNP与临床特点之间的关联在表3中说明。

表3：研究患者的GSTP1和proBNP与临床变量之间的施佩尔曼相关分析

EF＝射血分数；PAP＝肺动脉压；PCWP＝肺毛细血管楔压；PVR＝肺血管阻力。

对于血清GSTP1(r＝-0.137；P＝0.0241)和proBNP(r＝0.175；P＝0.0259)，在研究患者之间发现与患者年龄仅轻微但不重要的相关性。没有观察到血清GSTP1浓度和肺动脉压、肺毛细血管楔压、肺血管阻力、血清肌酸酐水平和心脏指数之间的显著的相关性。同样地，对于血清GSTP1和proBNP，没有观察到与性别和糖尿病(P≥0.408)的关联。

尽管从随机的临床试验得到乐观的结果，但使用基于证据的管理中的明显治疗缺口持续存在。作为日益有效的临床工具的心脏生物标记的出现提示了有可能成功指导治疗并减少疾病负担。创新的研究已经鉴定了多种在CMP中具有诊断和程序价值的新型分子标记。目前接受proBNP为CMP监测中的替代参数，但临床常规工作指出在CMP患者中有分歧的结果。因此本研究的目的是发现非侵入性和快速响应CMP血清标记，该标记允许监测具有减少和维持的EF的CMP患者。根据本发明的定向筛选显示了GSTP1与末期CMP相关。血清GSTP1浓度特异性诊断CMP，其独立于我们患者群组中人口统计学和临床特点，与EF显著相关。值得注意的是，与proBNP相比，对于血清GSTP1与EF的关联，显示了明显较高的相关系数。另外，与proBNP相比，血清GSTP1在具有EF≤22％的CMP患者中显示了更好的诊断能力。更重要地，GSTP1诊断EF≤42％，但proBNP不能诊断。

已经很好地确立了EF是CMP患者中心脏病风险的决定子。在低于45％的EF中每减少10％，所有全因死亡率的危险比率就增加39％。然而，CMP临床特征可出现在具有EF＞45％的患者中，其被称为具有维持EF的CMP。因此，GSTP1能够分辨具有EF≤42％的CMP患者的本发现具有重要的诊断和预后意义。尽管proBNP是已确立的用于CMP诊断的工具，并与EF相关联，但关于proBNP的报告价值是非常有分歧的，并在具有维持EF和减少EF的CMP中明显升高，这导致其有限的临床应用。另一方面，推荐proBNP主要用于在具有归因于CMP的症状的患者中，排除具有正常EF的CMP。然而，考虑到性别和较高年龄与较高的proBNP水平相关(Costello-Boerrigter er al.，J.Am.Coll.Cardiol.47(2006)，345-353)，所提议的proBNP的诊断性质可能是太非特异性的，以至不能区别在上年纪的患者中具有维持EF的CMP。

据报道，proBNP可预测EF＜30％，其在具有EF＜45％的CMP人群中分别为90％和71％的灵敏性和特异性。其他研究报道血浆proBNP检测EF＜28％，其在具有EF＜50％的患者群组中为77％灵敏性和69％特异性，并且发现proBNP可预测EF＜40％，其曲线下方面积为0.69。在本研究中，proBNP对于诊断EF≤22％具有97％灵敏性但仅26％特异性，其曲线下方面积为0.62。本研究中proBNP较低的特异性可由以下事实解释：与其他研究相比，我们的截止水平被选择以鉴定较低的EF。选择该标准以说明利用GSTP1诊断EF≤22％。此外，本研究没有对于EF的排除标准，并且这可能影响关于proBNP的测试特性，该proBNP先前示出在具有维持EF的CMP患者中变化。

血清GSTP1在CMP患者中上升的原因尚不清楚。然而，以下的证据正在积累：GSTP1经由其非催化的、配体结合活性，参与调节应激信号传导并保护细胞免于细胞凋亡。

本研究的结果显示在CMP中，GSTP1是优于proBNP的灵敏、特异、廉价和可快速测量的血清标记。重要地，GSTP1以高灵敏性和特异性，在维持和减少EF之间分辨，并因此可用作指导CMP患者中的临床试验的新型工具。

3、用于GSTP1治疗的动物IHD和CMP模型

为了具有模拟人中IHD和CMP的模型，已经选择了大鼠中左冠状动脉前部分支的结扎模型，以进一步证明本发明的原理。在该模型中，在结扎所述冠状动脉分支后诱导IHD，并且经过一段时间后，动物将随后发展CMP。因此，该模型最适于显示用于预防或治疗IHD和CMP所建议发明的效力。

以下的实验将根据由Aharinejad等公布的方案进行(Cardiovasc.Res.79(2008)，395-404)。该研究将遵守由美国国家健康协会(USNational Institutes of Health)公布的护理和使用实验室动物指南(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)(NIH Publication No.85-23，revised 1996)，并将由在维也纳医科大学的公共伦理委员会(InstitutionalEthics Committee)证实。Prof.Dr.Seyedhossein Aharinejad、MD、PhD将负责进行该研究的设计和监督。

雄性斯普拉道来大鼠(Sprague Dawley rat)(Harlan，Borchen，Germany)将被编码用于实验。由于心肌梗塞(MI)后预期的血液动力学损伤(hemodynamic compromise)、心室纤维性颤动、心肌破裂和出血，存活动物的数量预计为大约60-70％。因此，在患有心肌梗塞的每个组中，将包括总共18个动物。在经历左侧胸廓切开术前，大鼠将用腹膜内注射Ketasol(100mg/kg体重)和甲苯噻嗪(Rompun)(10mg/kg体重)进行麻醉，用14号(规格，gauge)的导管进行气管插管并以55个循环每分钟(潮气量：2.5ml)用1.5％异氟烷(Isofluran)通气。左冠状动脉的前部分支(LCA)将用7-0聚丙烯圈套(Ethicon，Somerville，NJ)进行结扎或在虚拟手术(sham procedure)中保持完整。在MI后的第7天(d)，左心室(LV)功能将由回波心脏描记术进行评估。随后，具有可比较的基线心脏功能的动物将被编码并被分配到组1-8中，如表4所示。为了治疗MI后预期的疼痛，在MI诱导后立刻和在MI后的第一天，动物将接受皮下注射(s.c)0.6mg/100g体重的哌腈米特(Piritramid)(5％葡萄糖溶液中的)。此外，动物将经由它们的饮用水，以0.6mg/100g体重(250ml水加20ml 5％葡萄糖溶液)接受哌腈米特3天，并且在MI后的天4-7以0.3mg/100g体重接受。

在d7中，在MI诱导后立刻，在如下组1-4中开始治疗。组1将接受林格溶液(Ringer’s solution)的每日腹膜内注射，持续两周(对照)，而组2-4将分别以10、20和40mg/体重的剂量接受重组GSTP1的每日注射，持续两周。在d21中，在如下组5-8中开始治疗。组5将接受林格溶液的每日腹膜内注射，持续两周(对照)，而组6-8将分别以10、20和40mg/体重的剂量接受重组GSTP1的每日注射，持续两周。组9包括接受虚拟手术的10个动物。在d52和d86，LV功能被重新估计，并且动物将在MI后的第88天处死。

表4：动物组和它们的治疗

bw：体重

以下的参数将被评估(1-11)：

1、LV射血分数(EF)、LV端收缩期容积(ESV)、LV端舒张期容积(EDV)，利用回波心脏描记术

2、心脏-体重比率

3、针对梗塞大小、梗塞壁厚度和纤维化，以及血管生成、包括p38、june激酶和白细胞介素(实施例仅对炎性途径提及)的炎性蛋白质的组织学和免疫细胞化学

4、信号传导途径

5、启动子结合测定

6、对细胞凋亡评估的TUNEL-测定

7、定量RT-PCR以及蛋白质印迹，和用于评估GSTP1的免疫沉淀，并涉及其途径、TRAF、TNF-α和其受体；MMP和它们的抑制剂TIMP、VEGF-A和其受体(这里仅实施例提及)

8、血清GSTP1水平和相关蛋白质的ELISA

所有数据都将通过使用Microsoft ACCESS进行编码和储存。方差的分析(ANOVA；t-检验或非参数ANOVA)和x2检验将基于待分析的参数(数字或字母数字的，正态分布或非正态分布)的相关性使用，以比较组之间的数据。施佩尔曼相关检验和逻辑回归分析将用于评估被评估参数之间的相关性。SAS 9.1.3版将用于统计学分析。

4、GSTP1治疗对急性心肌梗塞和缺血性诱导的心力衰竭的大鼠模型中炎症、心脏形态和功能的影响。

以下实验证明了该原理，谷胱甘肽S-转移酶P1-1(GSTP1)治疗是否在对抗急性心肌梗塞后活化的炎性级联中和在接受的实验大鼠模型中所得到的缺血诱导心力衰竭的过程中是有益的。

材料和方法

动物和心肌梗塞模型

所有的实验都得到维也纳医科大学的公共动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的许可。总共60个雄性斯普拉道来大鼠(Harlan，Borchen，Germany)被编码用于实验。由于心肌梗塞后血液动力学损伤、心室纤维性颤动、心肌破裂和出血，具有可比较的基线心脏功能的存活动物的数量为48个。在经历左侧胸廓切开术前，大鼠被麻醉，进行气管插管和用氧气/异氟烷混合物进行通气。随后用7-0聚丙烯圈套(Ethicon，Somerville，NJ，USA)结扎左冠状动脉的分支。在诱导心肌梗塞后1h，应用重组GSTP1(1mg/kg，溶解在1ml磷酸盐-缓冲盐水PBS中)；n＝24)(Assay Design(测定设计)，AnnArbor，MI)或1ml PBS(n＝24)的腹膜内单剂量注射。如下所述，左心室(LV)功能在诱导心肌梗塞后一天(n＝48)和三周(n＝24)，通过回波心脏描记术进行评估。每组中的总共12个动物随后在治疗后-天被处死；并且剩余的每组中的12个动物在诱导心肌梗塞后3周被处死(Aharinejad etal.，2008)。

回波心脏描记术血液动力学测量

在麻醉的大鼠中，最大LV长轴长度(L)和心脏内区域追踪利用15MHz线性阵列扫描头进行测量，以计算LV端舒张期容积(LVEDV)和末端收缩期容积(LVESV)以及射血分数(LVEF  ＝LVEDV-LVESV/LVEDV)。测量利用三个连续的心脏的周期(Aharinejadet al.，2008)。

组织学和免疫细胞化学

心室在它们被冷冻或被浸没固定在福尔马林中前，在它们长轴的中点处横切。石蜡包埋的样本用于H&E、Tunnel测定以及Goldner三色胶原蛋白染色。根据制造商的方案(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)，进行TUNEL测定(原位细胞死亡检测试剂盒)三次。载玻片用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Molecular Probes，Eugene，OR)进行复染，并包埋在AF1抗荧光衰退剂(antifadent)(Citifluor，Leicester，UK)中。数字图像通过荧光显微镜(Nikon，Melville，NY)获得。如所描述的进行形态计量(Aharinejad et al.，2008)。

mRNA分离和定量实时RT-PCR

如所描述的，使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)和MagNA Lyser系统(Roche，Mannheim，Germany)将总RNA从心肌组织中分离(Aharinejad et al.，2008)。如所描述的，实时RT-PCR测量在LightCycler仪器(Roche)上进行三次(Aharinejad et al.，2008)。引物序列是有义/反义的：

GSTP1：5′-GGCAACTGAAGCCTTTTGAG-3′/5′-TCATGGATCAGCAGCAAGTC-3′；肿瘤坏死因子受体-相关因子2(TRAF2)：

5′-GCAGAAGGTCTTGGAGATGG-3′/5′-GGTGGAGCAGCATTAAGGTC-3′；和β2-微球蛋白：5′-GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3′/5′-CAATCCAAATGCGGCATCT-3′。mRNA表达被计算并作为相对于对照中的百分比绘制治疗的动物。

共免疫沉淀和蛋白质印迹

如所描述的，制备心脏组织溶胞产物(et al.，2003)。对于GSTP1-TRAF2、GSTP1-JNK1和GSTP1-p38复合体检测，蛋白质(500μg)用0.5μg抗TRAF2(BD Pharmingen，San Diego，CA)、JNK1和p38(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的相应抗体进行免疫沉淀。如所描述的，免疫复合体与A/G PLUS-琼脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology)一起温育，并用GSTP1抗体(Bethyl，Montgomery，TX)通过蛋白质印迹进行沉淀(et al.，2003)。在与第二抗体(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)一起温育前，印迹与一级人单克隆GSTP1(Bethyl)和TRAF2(BD Pharmingen)或多克隆磷-p38(Promega，Madison，WI)、磷-JNK1、JNK1和p38(Santa Cruz Biotechnology)抗体一起温育。所有实验都进行三次，并且表达水平针对对照上样蛋白质进行校正。

统计学分析

通过方差的X2检验和单向分析(单向ANOVA；Tukey检验)，根据变量(连续或绝对的)的标度，比较组之间的所有参数。所有统计学分析都利用Windows，9.1.3版和Enterprise Guide，4.1版的SAS系统(SASInstitute，Inc.，Cary，NC)进行。统计学显著性被设定为P＜0.05。结果表达为平均±标准差(SD)。

结果

GSTP1改善了急性MI后炎性细胞因子的心肌过表达

免疫沉淀和蛋白质印迹分析显示了在急性心肌梗塞模型中，GSTP1治疗不改变GSTP1-TRAF2复合体的形成(图9A)。蛋白质印迹显示了尽管与对照相比，GSTP1可减少活化的JNK1的心脏组织蛋白质水平(p＜0.01；图9B)，但活化的P38和NF-kB的蛋白质表达水平没有差异。此外，与对照相比，GSTP1抑制了包括TGF-β、IL-1β、IL-2和IL-17在内的炎性细胞因子的心脏组织表达(p＜0.01；图9C)；尽管GSTP1治疗后IL-10表达水平没有显著改变(图9C)。

在衰竭心肌中，GSTP1通过TRAF2-调节的NF-kB信号传导改善了促炎细胞因子的心肌表达

免疫沉淀和蛋白质印迹分析显示了与对照相比，在MI后的3周，GSTP1-治疗的大鼠在它们的衰竭心脏组织中具有显著增加的GSTP1-TRAF2、GSTP1-JNK1和GSTP1-p38复合体的形成(p＜0.001；图10A)。另外，与对照相比，GSTP1-治疗的大鼠在它们的衰竭心肌组织中具有显著减少的活化JNK1和p38的蛋白质表达(p＜0.001；图10B)。此外，与对照相比，GSTP1-治疗的大鼠具有较低的TGF-β、IL-1β、IL-2和IL-17的心脏组织mRNA表达(P≤0.001；图10C)。与之相对，与对照相比，在GSTP1-治疗的动物中，抗炎细胞因子IL-10的心脏组织mRNA表达显著增加(p＜0.001；图10C)。这些结果显示了GSTP1治疗抑制了TRAF2-介导的JNK1、p38和NF-kB促炎信号传导并改善了缺血诱导的心力衰竭中心肌细胞因子表达。

GSTP1改善了大鼠衰竭心肌中的重建

形态计量分析显示了与对照大鼠(1.3±0.5mm；图11A和11B)相比，在GSTP1-治疗的大鼠(2.2±0.4mm)中，LV壁厚度显著增加。为了分析GSTP1治疗对拯救梗塞和梗塞外周区域中的心肌组织的影响，进行TUNEL测定。这些测定的结果显示了与对照动物相比，在GSTP1-治疗动物的梗塞和梗塞外周区域中细胞凋亡事件显著减少(图11C和11D)。这些数据显示了GSTP1治疗显著减少了大鼠衰竭心脏中心肌重建和MI后心肌组织细胞凋亡。

GSTP1改善了心脏功能

已经显示了GSTP1在对抗缺血诱导的心力衰竭和急性心肌梗塞的大鼠模型的炎症和心肌重建中有效，证明了衰竭大鼠心肌中的LV功能。结果显示了与未治疗的组相比，在MI后的3周，在GSTP1治疗的大鼠中，左心室射血分数(LVEF)显著较高(p＜0.05，图12A)。此外，与对照动物相比，在MI后的3周，在GSTP1治疗的组中，LV端舒张期容积(LVEDV)显著改善(减少的)(p＜0.05，图12B)。这些数据显示了GSTP1治疗显著改善了LVEF并减弱了与缺血诱导的心力衰竭相关的LV扩张。

在过去的二十年中，在心力衰竭的病理生理学中，炎性介质的作用已经得到了不断增长的关注。不同的实验研究已经描述了TNF-α对LV功能的负的收缩能效应。此外，已经报道了TNF-α通过细胞凋亡，促进LV重建、心脏肥厚和进行性心肌细胞损失。在心力衰竭背景下对炎性介质的病理学作用不断增长的证据已经产生了一系列意欲以心力衰竭患者中的TNF-α为目标的多中心临床试验。然而，这些试验的结果令人气馁的。这些结果的一种解释是TNF-α的低生理水平可能对心脏组织重建和修复是重要的。与该论点相呼应，实验研究已经通过TNF-α的两个不同的受体TNFR1和TNFR2描述了TNF-α在心脏组织重建中的相反作用。已经显示了尽管TNFR1加剧了重建、肥厚和细胞凋亡，但TNFR2改善了这些事件。然而，心力衰竭中TNFR2-介导作用的机制仍然不清楚。最近，已经显示了TRAF2是介导MAPK活化的TNF-α信号传导的中心调节物。此外，TNFR2和TRAF2之间的相互作用导致了NF-κB的活化。此外，已经报道了通过与TRAF2形成相互作用，GSTP1是TNF-α诱导的信号传导的重要的负调节物。与此一致，GSTP1可间接通过其与TRAF2的相互作用或直接通过其与JNK1和P38的相互作用，抑制恶性细胞系中的MAPK活化。这些结果连同本发明的发现——GSTP1和TRAF2在患有心力衰竭的患者中上调——一起，显示了GSTP1-TRAF2复合体形成与心力衰竭的发病机理相关。心力衰竭患者中的组织培养物实验显示了尽管加入TNF-α能阻止GSTP1的抗炎作用，但是该作用可通过增加GSTP1剂量得以保持。体内目前的结果支持GSTP1的该抗炎性质。在此使用的实验模型显示了在MI诱导后，GSTP1能够改善炎性反应并降低心脏重建。有趣地是，GSTP1不仅能阻止促炎介质如IL-1、IL-2、JNK1、P38和NF-kB，而且能增加抗炎细胞因子IL-10的表达。此外，根据本发明的结果显示了在衰竭心脏中，GSTP1保护心脏组织免于细胞凋亡。与此一致，已经显示了在肿瘤学背景下，GSTP1减弱了TRAF2-增强细胞凋亡信号-调节激酶1(ASK1)的自磷酸化，并因此通过阻止TRAF2和ASK1的相互作用，抑制TRAF2-ASK1诱导的细胞凋亡。

综上所述，本发明提供了GSTP1在调节心力衰竭中TNF-α/TRAF2引出的JNK1/p38活化中的新功能。由GSTP1进行的TNF-α/TRAF2-介导的炎性信号传导的选择性抑制是由于本动物模型示出对患有心肌病或缺血性心脏病的患者，特别是对患有心肌梗塞和心力衰竭的患者是有益的治疗。

Claims (19)

1.谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)在制造用于预防或治疗心肌病或缺血性心脏病的药物中的应用，其中所述心肌病为缺血性心肌病并且其中所述缺血性心脏病是由心肌梗塞引起的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物被肠胃外给药。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物被腹膜内或静脉内给药。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物被静脉内给药。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以0.001至100mg GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以0.01至10mg GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以0.1至1mg GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以0.1至10000U GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以1至1000U GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于所述药物以10至100U GSTP1/kg的剂量施用给人个体。

11.包括GSTP1和药学上可接受的载体的药物组合物在制造用于预防或治疗心肌病或缺血性心脏病的药物中的应用，其中所述心肌病是缺血性心肌病并且其中所述缺血性心脏病是由心肌梗塞引起的。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述GSTP1为人重组GSTP1或人胎盘GSTP1。

13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述组合物包含1至100000U GSTP1。

14.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述组合物包含10至10000U GSTP1。

15.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述组合物包含10至1000U GSTP1。

16.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于所述组合物包含具有5.5至9.0的pH的缓冲剂。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂或HEPES缓冲剂。

18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述组合物包含具有6.0至8.5的pH的缓冲剂。

19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述组合物包含具有6.5至8.0的pH的缓冲剂。