CN102573442A

CN102573442A - 百草枯抗性基因及其应用

Info

Publication number: CN102573442A
Application number: CN2010800415137A
Authority: CN
Inventors: 夏勉; 乔琳; 王丽英; 孔祥凤; 刘军华; 李毅
Original assignee: BEIJING WEIMING KAITUO CROP DESIGN CENTER CO LTD
Current assignee: BEIJING WEIMING KAITUO CROP DESIGN CENTER CO LTD
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-10-27
Also published as: CN102573442B; WO2011050715A1

Abstract

本发明提供了一种PqrA突变体蛋白，其包含选自Ser64→Ala、Ile85→Val、Val92→Ala、Va196→Leu、Va1389→Ala和Ala398→Val的突变，表达上述蛋白的转基因植物对至少800mg/l的百草枯具有抗性。本发明进一步提供了上述蛋白的编码基因、载体和细胞，以及种植所述转基因植物的方法。

Description

百草枯抗性基因及其应用技术领域

本发明属于转基因植物技术领域，具体而言，本发明涉及高百草枯抗性基因及其在转基因植株培育和种植中的应用。背景技术

百草枯 (paraquat, 1, 1-二甲基 -4,4'-联吡啶，分子量 257.2) 是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、林带等作物的杂草，估计将来的应用呈上升、递增趋势。百草枯在农业种植中的广泛应用已近 50年，应用在世界范围内超过 100个国家，受到广泛接受与欢迎。 90年代以来，随着农业生产的需求，我国若干农药企业先后开始规模生产百草枯原药，并不断的改进生产工艺，产品在各地推广应用，在生产中发挥了一定的作用。

百草枯是非选择性除草剂，植物对其吸收非常迅速，即使喷药后短期内降雨也不影响药效的发挥；吸收的药剂通过木质部中的逆向流进行传导，在适宜条件下，大量药剂被叶片吸收并向其他部位传导，此种传导仅仅是非原质体 (木质部)传导，因而叶面处理的百草枯通常停滞于被处理的叶片内。作为典型的光合系统 I抑制剂，白枯草的活性的发挥决定于光。毒理学机理研究表明，百草枯的生物毒性与致突变性的原因是，当双氧化合物存在时，百草枯被还原并重新被氧化，在此循环反应过程中产生负自由基 02_并在活细胞体内积累。 Ju-Fang Ma等人从一株铜绿假单胞菌中克隆到 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因 zwf，该基因对百草枯产生的负自由基 0₂_具有有效的脱毒作用。

Jinki Jo等人（Biochem. Biophys. Res. Commun. 285 (4), 885-890 (2001)) 从人苍白杆菌中发现一种新的基因（即 pqrA， GenBank: AAF86626.1 ), 其编码的蛋白对于百草枯具有一定抗性。 GenBank ( GenelD: 5382847) 公开了一种 pqrA突变体，但是其编码的蛋白仅仅是一种假设的蛋白，并不清楚是否有百草枯抗性，更不清楚能否带来高的百草枯抗性。 Jinki Jo等人将该 pqrA基因转进烟草中，在得到了很好的表达的情况下，对比于野生株转基因烟草具有对百草枯有一定的抗性。 pqrA基因的转基因烟草植株在和野生型烟草相比时，野生型生长在半固体培养基中当百草枯为 ΙμΜ浓度时即出现枯萎，百草枯达 20μΜ (约 5mg/L) 浓度时植株即死亡，而转基因烟草仍然是正常生长；然而，当在百草枯浓度达到 50μΜ (约 12.5mg/L) 的情况下，转基因烟草的叶片中叶绿素含量的损失也将达到约 15%，因此该基因能够耐受培养基中的百草枯浓度达基本停留在 5mg/L左右。至今，抗百草枯转基因植物的商品还未出现，研究主要停留在实验室阶段。根据本发明人经验，田间除草时 20%百草枯水制剂用量为 100-200ml/亩，按照常规用法稀释到 25L水计算，一般 800-1600mg/L是常用的田间喷洒浓度，而实际使用时会被部分农民超剂量使用，因此制约其商品化的原因之一是 pqrA基因对百枯草的耐受程度不高，与实际使用相去甚远的抗性影响了实际应用；另外也不清楚 pqrA基因抗性对不同植物（如，棉花、水稻、玉米、大豆等与烟草遗传背景区别很大的常见农作物）的适用性。然而，从现有基因获得百草枯高抗性基因突变体缺乏明确的筛选导向，而且当前没有很可靠地解决如何获得百草枯高抗性基因或其突变体的方法，基本只能依赖于凭运气式的筛选，工作量不但惊人，而且无法预期获得的基因或其突变体是高抗性的。

本发明人通过长期艰苦的研究，令人意外地发现了新 pqrA基因的突变体，其导入植物后可使植株对施用百草枯的耐受性（即，抗性）达到 3200mg/L 的高水平，同时使植株对培养基中百枯草浓度的耐受性达到 25mg/L 的高水平，而且该高抗性还是用于多种植物，应用前景广阔。发明内容

本发明要解决的技术问题在于满足在种植植物时的预防性除杂草或发现杂草后除杂草的过程中实际施用百草枯的要求，使要种植的植物在实际使用的高浓度百草枯的条件下的生长不受到影响，从而专一地杀灭杂草。本发明要解决的技术问题还在于提供高百草枯抗性的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白。另外，本发明要解决的技术问题还在于生产（如，表达）或应用（如，转化）上述基因突变体的载体、细胞和方法等。

令人意外的是，本发明的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白不但能够为相应转基因植物带来能够耐受常规田间施用的百草枯浓度，而其更能够耐受 3200mg/L左右的百草枯浓度，使得在实际使用中有较大的耐受冗余度，从而更符合实际施用的要求；另外，本发明的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白的植物适应性广，在大量与烟草遗传背景显著不同的转基因植物中都能取得良好的高百草枯抗性。

具体而言，在第一方面，本发明提供了种植植物的方法，其包括种植转基因植物和施用高浓度的百草枯的步骤，其中所述转基因植物被导入高百草枯抗性的 pqrA基因突变体。由于本发明的高百草枯抗性的 pqrA 基因突变体及其编码的蛋白能为相应转基因植物带来高百草枯抗性，因而能够耐受高浓度的百草枯，从而在施用高浓度的百草枯的时候，不影响相应转基因植物的生长，而专门除去或预防性地除去杂草。因而，本发明第一方面的种植植物的方法也包括了除去杂草的方法、或在种植植物时除去杂草的方法。在本文中， "施用 "指的是田间施用，如田间喷洒。与之相适应的，如未特别指明，本文中的百草枯的 "浓度"指田间施用施用的浓度，该浓度比百草枯在培养基中的浓度更加贴近于实际应用。当然，本发明人也发现，本发明的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白为植株带来耐受至少为 25mg/L的在培养基中的浓度，远远高于现有技术的野生 pqrA 基因所带来 5mg/L的在培养基中的浓度耐受性。这从另一个方面证实了本发明的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白是高百草枯抗性的。

在本文中，如未特别指明，百草枯的 "高浓度 "指的是百草枯的浓度大于 800mg/L。优选百草枯的浓度为 100(T3200mg/L，更优选为 1600〜3200mg/L，如田间常用的 1600mg/L、或可能过量施用的 1700 mg/L、 1800 mg/L、 2000 mg/L、 2300 mg/L、 2600 mg/L、 2900mg/L、或 3200mg/L。在本发明的具体实施方式中，本发明的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体及其编码的蛋白能为相应转基因植物带来高达 3200mg/L的百草枯抗性。相应地，在本文中， "高百草枯抗性"指的是能给相应植物带来的耐受所述高浓度的百草枯的性质。

在本文中， "PqrA蛋白"指的是 Jinki Jo等人（Biochem. Biophys. Res. Commun. 285 (4), 885-890 (2001) ) 从人苍白杆菌中发现一种新基因所编码的蛋白，即 GenBank 登录号 AAF86626.1 所公开的氨基酸序列。相应地，在本文中， "pqrA基因"指的是编码上述 PqrA 蛋白的基因。相应蛋白或基因的 "突变体"就是在相应蛋白的氨基酸序列的基础上添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列或编码其的核苷酸序列。除了本发明具体实施方式所述的突变体筛选方法之外，在蛋白质序列已知的情况下，本领域技术人员可以通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法记载于《分子克隆实验指南》（北京：科学出版社， 2002 年）等文献中。本文中所使用的蛋白及氨基酸、基因及核苷酸的表示方法均为所属领域公认的表示方法，如表 1所示的氨基酸或氨基酸残基符号，本领域技术人员根据它可以反推出相应的三核苷酸密码子。

表 1 氨基酸缩写表

氨基酸三字母缩写一字母缩写氨基酸三字母缩写一字母缩写丙氨酸 Ala A 亮氨酸 Leu L

精氨酸 Arg R 赖氨酸 Lys K

天冬酰胺 Asn N 蛋氨酸 Met M

天冬氨酸 Asp D 苯丙氨酸 Phe F

半胱氨酸 Cys C 脯氨酸 Pro P

谷氨酰胺 Gin Q 丝氨酸 Ser S 谷氨酸 Glu E 苏氨酸 Thr T 甘氨酸 Gly G 色氨酸 Trp W

组氨酸 His H 酪氨酸 Tyr Y

异亮氨酸 lie I 缬氨酸 Val V

优选在本发明的第一方面，其中高百草枯抗性的 pqrA基因突变体编码选自以下位置突变的 PqrA蛋白： Ser64, Ile85， Val92， Val96， Val389，和 /或 Ala398。其中所述突变表示相应位置上的相应氨基酸残基被其他不相同的氨基酸残基所取代，如 Ile85表示第 85位的 lie被非 lie的氨基酸残基所取代。更优选在本发明的第一方面，其中高百草枯抗性的 pqrA 基因突变体编码选自以下突变的 PqrA蛋白： Ser64→Ala， Ile85→Val , Val92→Ala， Val96 →Leu, Val389→Ala，和 /或 Ala398→Val。其中所述突变表示相应位置上的相应氨基酸残基被箭头所示的氨基酸残基所取代，如 Ile85表示第 85位的 lie被 Val所取代。本发明最优选的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体是编码如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白的基因（即被命名为 pqrKl基因），其中 SEQ ID N0: 2具有 Ser64→Ala， Ile85→Val , Val92→Ala, Val96→Leu, Val389→Ala, 和 Ala398→Val这六个突变。蛋白质的空间结构与它的生物学功能是密切相关的，生物体中的各种蛋白质都有自己特定的空间构象，这种构象与它的功能是相适应的，构象改变，生理功能随之发生改变。根据本发明具体实施方式中所述的实验结果，就是这 6个氨基酸的改变，引起了蛋白质空间结构的改变，改变了酶和底物的亲和力，取得了正向的百草枯抗性功能增强的转变。在本发明的具体实施方式中，所使用的高百草枯抗性的 pqrA基因突变体的序列如 SEQ ID NO: 1所示。

在第二方面，本发明提供了在本发明第一方面的方法中所使用的高百草枯抗性的 pqrA 基因突变体的编码蛋白，即高百草枯抗性的突变的 PqrA蛋白，其突变位置选自： Ser64， Ile85， Val92， Val96， Val389， Ala398。更优选其中高百草枯抗性的突变的 PqrA蛋白的突变选自： Ser64→Ala, Ile85→Val , Val92→Ala， Val96→Leu, Val389→Ala，和 /或 Ala398→Val。根据本发明具体实施方式中所述的实验，这些蛋白在转基因植物中的表达将给相应转基因植物带来高百草枯抗性。

在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，即编码本发明第二方面所述的 PqrA蛋白的 pqrA基因突变体。本发明的核酸分子，可以是 DNA形式，也可以是 RNA形式，优选 DNA 形式。 DNA形式包括天然 cDNA和人工合成的 cDNA， DNA可以是编码链或模板链。在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如 PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码高百草枯抗性的突变的 PqrA蛋白的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。

在第四方面，本发明提供了包含本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体的载体。本文中的术语 "载体"是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同， "载体"在本文中可以分为 "克隆载体"、 "表达载体"和 "转化载体"，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体（原核表达载体）、在酵母中表达用的载体（如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等）、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体（痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等）、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。除了在克隆过程中必要的克隆载体之外，还优选本发明第四方面中的载体是转化载体，尤其是植物转化载体。在本发明的具体实施方式中，所述植物转化载体为 pCAMBIA1303-pqrKl ,其图谱如图 1所示。 pCAMBIA1303_pqrKl的构建是，先把 pCAMBIA1303 的约 2.5kb的 gus-gfp融合基因切除，保留 35S启动子部分，利用 Spel和 Bstpl—对酶切位点插入目的基因 pqrKl。

在第五方面，本发明提供了本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体的细胞。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。优选的细胞可以是农杆菌细胞，利用它可以将目的基因转化入植物。另外优选的是微生物细胞，如细菌细胞，它们可以作为克隆载体或转化载体的宿主细胞。最优选的微生物细胞是保藏号为 CGMCC No.2787的人苍白杆菌 Ochrobactrum an thropi KTQ-077株细胞。它是根据以下筛选方法得到的，其中包括了 pqrKl基因：

1 ) 取受百草枯污染过的土壤接种到含百草枯的液体选择性培养基中，于 35°C振荡培养一周；

2 ) 将液体培养获得的培养液涂布到固体选择性培养基上，于 35°C恒温培养，直至长出明显可见的菌落；以及

3 ) 取固体培养的单菌落，接种于液体选择性培养基中，于 35°C振荡培养，直至细胞浓度达到 10⁷〜10⁸cfu/mL;

任选地，重复步骤 2 ) -3 )。其中，所述液体选择性培养基为含有百草枯的液体 BS无机盐培养基，优选百草枯的含量为 3200mg/L; 固体选择性培养基为含有百草枯的固体 BS无机盐培养基，优选百草枯的含量为 3200mg/L; 液体 BS无机盐培养基的配方为：每 lOOOmL培养基中含： N¾HP0₄ · 2H₂0 7. Og, KH₂P04 3. Og, NaCl 0· 25g， MgS0₄ · 7H₂0 0· 3g， CaCl₂ · 2H₂0 0. 02g， FeCl₃ ·6Η₂0 0. 045g， MnS0₄ ·4Η₂0 0. 01g， ZnS0₄ ·7Η₂0 0. 01g， CuS0₄ ·5Η₂0 0. 002g， CoCl₂ · 6H₂0 0. 003g, NiCl₂ · 6H₂0 0. 003g, 和 N¾Mo0₄ · 2H₂0 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水；固体 BS无机盐培养基的配方为配方中进一步含有 13. 5g琼脂粉的液体 BS无机盐培养基的配方。作为单独的方面，本发明也提供上述高百草枯抗性菌的筛选方法以及培养基。

在第六方面，本发明提供了本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体在培育高百草枯抗性的转基因植物中的应用。在已知基因的条件下，培育转基因植物的方法是有先例的，例如可以通过农杆菌转化的方式或者微粒轰击或电穿孔的方式将基因导入植物或其组织中，然后培养该植物或其组织并在存在百草枯的环境中筛选。优选在本文中，所述植物是烟草、玉米、水稻、棉花、油菜或大豆，尤其优选是玉米、水稻、棉花或大豆。

在本发明的单独的方面，本发明提供了导入了本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体的高百草枯抗性的转基因植物或其后代、种子，优选所述植物是烟草、玉米、水稻、棉花、油菜或大豆。另外，本发明还提供了由上述转基因植物或其后代、种子的可利用部分加工而成的无繁殖能力的农业制成品，如食品或纺织品，如烟丝、大米（脱水后无繁殖能力的水稻种胚）、棉絮、植物油等。其中所述加工方法是本领域技术人员所公知的，完全可以使用加工相应的非转基因植物成相应的农业制成品的方法进行。

在本发明又一个单独的方面，本发明提供了鉴定导入了本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体的高百草枯抗性的转基因植物或其后代、种子的方法，其包括从所述转基因植物或其后代、种子中进行本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体或其同源序列的扩增，对扩增出的序列进行序列分析并与本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体相比较。其中扩增的方法是公知的，如 PCR扩增。由于本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体是从细菌中分离得到的，天然的植物或其种子中并不含有该基因，如果能够从植物或其种子中扩增出序列而且该序列与本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体相同，那么该植物或其种子就是导入了本发明第三方面所述的 pqrA基因突变体的高百草枯抗性的转基因植物或其后代、种子。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。附图说明

图 1为将 pqrKl基因插入到载体 pCAMBIA1303中以获得的 pCAMBIA1303- pqrKl载体的构建过程的示意图。

图 2为转基因烟草植株和野生型植株在百草枯浓度为 25mg/L的培养基上的表现照片，其中左图的转化有 pCAMBIA1303- pqrKl的转基因烟草苗百草枯抗性明显优于右图的野生型植株。

图 3 为 pqrKl转基因烟草 T_Q代植株苗叶片基因组 DNA的 PCR扩增的电泳照片，其中泳道 1一 10分别为转基因烟草，泳道 M为分子量标记，泳道 11为阳性对照， 12为阴性对照。

图 4为烟草苗生长 30天后喷洒 3200mg/L的百草枯前后的对比照片，其中上半部分（A 区）为喷洒 3200mg/L百草枯的区域，下半部分（B区）为喷洒水的对照区域，左半部分为喷洒前的情况，右半部分为喷洒后的 120小时的情况，野生为种植野生型植株， pqrKl-2为本发明的高百草枯抗性植株。

图 5为棉花苗生长 15天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 120小时的对比照片，其中两侧的野生型棉花已经干枯，而中间的本发明的高百草枯抗性棉花未受影响。

图 6为水稻苗期叶片耐受百草枯能力实验的结果照片，其中 A区为本发明的高百草枯抗性水稻苗， B区为野生型水稻苗。

图 7为玉米苗生长 12天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 120小时的对比照片，其中 B区的野生型玉米已经干枯，而 A区的本发明的高百草枯抗性玉米未受影响。

图 8为大豆苗生长 18天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 120小时的对比照片，其中 B区的野生型玉米已经干枯，而 A区的本发明的高百草枯抗性玉米未受影响。具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。

实施例 1、 pqrKl基因的获得

根据环境调查，发现武汉钢铁集团公司焦化废水车间的活性污泥受到百草枯污染。采集该地点土壤样品，接种到含百草枯的液体选择性培养基（即在 BS无机盐培养基（每 lOOOmL 培养基中含： Ν¾ΗΡ0₄ ·2Η₂0 7. 0g， KH₂P04 3. 0g， NaCl 0. 25g， MgS0₄ ·7Η₂0 0. 3g， CaCl₂ ·2Η₂0 0. 02g， FeCl₃ ·6Η₂0 0. 045g， MnS0₄ ·4Η₂0 0. 01g， ZnS0₄ ·7Η₂0 0. 01g， CuS0₄ ·5Η₂0 0. 002g， CoCl₂ · 6H₂0 0. 003g, NiCl₂ · 6H₂0 0. 003g, 和 N¾Mo0₄ · 2H₂0 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水）中添加 1600mg/L的百草枯）的摇瓶中，于 35°C以 120rpm振荡培养一周。

然后，将培养获得的培养液涂布到固体选择性培养基（每 lOOOmL培养基中还添加 13. 5g 琼脂粉）上，于 35°C恒温培养，直至长出明显可见的菌落。然后，挑取单菌落，移接到液体选择性培养基中，于 35°C以 120rpm振荡培养，直至细胞浓度达到 10⁷〜10⁸cfu/mL。然后，重复本段前述步骤，在固体选择性培养基和液体选择性培养基中反复筛选，最终得到 6株对百草枯有较好抗性的菌株，甚至可以在百草枯浓度达到 3200mg/L时生长良好。其中 1株人苍白杆菌 Wchrobactrum anthropi 被命名为 KT-q077，于 2008年 12月 9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No.2787。它经基因测序，发现其中与 pqrA同源性高的基因序列如 Seq ID No: 1所示，该新基因被命名为 pqrKl。 pqrKl所编码的蛋白如 Seq ID No: 2所示，其与 pqrA所编码的蛋白有 6个氨基酸突变，分别为 Ser64→Ala， Ile85→Val , Val92→Ala， Val96→Leu, Val389→Ala， Ala398→Val。实施例 2、植物表达载体的构建

抽提 KT_q077的基因组 DNA作为模板，利用分别引入 Spel 、 Bstp I酶切位点的引物 1303-P-F ( 5 ' -CGGACTAGTATGTCCAATCCATATAGAGAAATTT-3 ' ) 、 pqrKl- R ( 5'-GGGTCACCCTACTCTGCCGCTTCTGCTG-3' )进行 PCR扩增，于 58°C退火，扩增得到的 1233bp 的 PCR片段 pqrKl_1233。然后用 Spel、 Bstp I双酶切 pqr4_1233，回收产物作为连接片段，同时以 Spel 、 Bstp I双酶切 pCAMBIA1303 (可购自 Invitrogen公司）作为载体， T4 DNA连接酶连接片段和载体。最后筛选得到具有卡那霉素抗性的克隆，经验证正确后命名为质粒 PCAMBIA1303- pqrKl。实施例 3、植物转化以及苗期筛选

使用常规农杆菌转化法转化烟草、棉花、水稻、玉米以及大豆。具体而言，将构建好的植物表达载体 PCAMBIA1303- pqrKl转化农杆菌，然后分别转化上述植（作）物。转化后，用潮霉素（50mg/L) 抗性和一定浓度 (25— 50mg/L)的百草枯筛选出 T_Q代（转化进行的当代）转基因植（作）物苗，然后从筛选得到的转基因植株 T_Q代叶片中提取基因组 DNA，以 PCR法测定 pqrKl基因阳性。然后， T_Q代植株自交，分别得到 1 代植株：烟草 30株，水稻 23株，玉米 19株、棉花 21株和大豆 22株。将1 代种子按每个株系 50— 100粒分别种植，待植株长到 4-5叶期时，取植株叶片做叶片耐百草枯能力实验和 /或对植株做喷洒实验。其中，叶片耐百草枯能力实验的过程如下：每个单株取新叶中段 2cm长左右，浸泡于 lml ( 5μΜ百草枯， 0. 025% Tween) 百草枯溶液 24小时观察叶片；喷洒实验的过程如下：用浓度为 1700 mg/L、 1800 mg/L、 2000 mg/L、 2300 mg/L、 2600 mg/L、 2900mg/L、或 3200mg/L的百草枯分别喷洒幼苗，加野生型作为阴性对照，观察并统计能正常生长的抗性苗。具体结果如下：

1，烟草

共筛选出百草枯抗性阳性的烟草 T_Q代植株 31株。图 2显示了 T_Q代转基因烟草植株和野生型植株在百草枯浓度为 25mg/L 的培养基上的表现，表明阳性转基因烟草苗对百草枯的一定抗性，这些 T_Q代阳性转基因烟草植株的叶片中所提取的基因组 DNA都能扩增出大小为 1.2kb的 pqrKl基因片段（参见图 3 )。

自交后，获得代植株 30株，命名为 Y37-1 30, 每个 1 代植株分别种植种子 100粒，以野生型烟草为对照进行喷洒实验。结果发现 800mg/L百草枯的条件下处理 5天后野生型全部枯死，阳性转基因烟草植株均未见明显损伤；而 1600mg/L百草枯的条件下，野生型处理 2 天后就已全部枯死，而大部分阳性转基因烟草植株生长良好。我们逐渐增加百草的浓度，即使在 3200mg/L百草枯浓度喷洒下，如表 2所示，大量 1 代植株的种苗也生长良好，表现出很好的百草枯抗性。

表 2 T1代转基因烟草种苗筛选情况

Y37-1 45 Y37-16 45

Y37-2 33 Y37-17 33

Y37-3 43 Y37-18 43

Y37-4 41 Y37-19 39

Y37-5 54 Y37-20 34

Y37-6 34 Y37-21 34

Y37-7 42 Y37-22 42

Y37-8 33 Y37-23 31

Y37-9 50 Y37-24 30

Y37-10 35 Y37-25 55

Y37-11 20 Y37-26 20

Y37-12 35 Y37-27 49

Y37-13 41 Y37-28 41

Y37-14 39 Y37-29 40

Y37-15 33 Y37-30 56 2，棉花

将筛选出的百草枯抗性阳性的棉花 T_Q代植株自交后，获得 1 代植株 21株，每个 1 代植株分别种植种子 50粒，以野生型棉花为对照进行喷洒实验。当百草枯浓度为 800mg/L时，野生型棉花枯萎，转基因棉花生长良好。当百草枯浓度达到 3200mg/L时，仍有 8株棉花植株的种苗表现出很好的抗百草枯能力，其生长状况如图 5所示。

3，水稻

将筛选出的百草枯抗性阳性的水稻 T_Q代植株自交后，获得 1 代植株 23 株，命名为 KT00491-广 23，每个 1 代植株分别种植种子 100粒，以野生型水稻为对照进行叶片耐百草枯能力实验和喷洒实验。

叶片耐百草枯能力实验的结果如图 6所示，其中 A区为百草枯抗性阳性的水稻苗的植株叶片，明显优于 B区中常规种植（未添加百草枯）的野生型植株的叶片。

喷洒实验后，当百草枯浓度为 800mg/L时，野生型水稻枯萎，转基因水稻生长良好。即使在 3200mg/L百草枯浓度喷洒下，如表 3所示，大量 1 代植株的种苗也生长良好，表现出很好的百草枯抗性。表 3 T1代转基因水稻种苗筛选情况

KT00491- -1 45 KT00491- -13 45

KT00491- -2 53 KT00491- -14 43

KT00491- -3 53 KT00491- -15 43

KT00491- -4 51 KT00491- -16 49

KT00491- -5 34 KT00491- -17 34

KT00491- -6 34 KT00491- -18 34

KT00491- -7 42 KT00491- -19 42

KT00491- -8 43 KT00491- -20 51

KT00491- -9 30 KT00491- -21 31

KT00491- 10 38 KT00491- -22 55

KT00491- ■11 27 KT00491- -23 53

KT00491- ■12 55 4，玉米

将筛选出的百草枯抗性阳性的玉米 T_Q代植株自交后，获得 1 代植株 19株，每个 1 代植株分别种植种子 50粒，以野生型玉米为对照进行喷洒实验。当百草枯浓度为 800mg/L时，野生型棉花枯萎，转基因玉米生长良好。当百草枯浓度达到 3200mg/L时，仍有 7株玉米植株的种苗表现出很好的抗百草枯能力，其生长状况如图 7所示。

5，大豆

将筛选出的百草枯抗性阳性的大豆 T_Q代植株自交后，获得 1 代植株 22株，每个 1 代植株分别种植种子 50粒，以野生型玉米为对照进行喷洒实验。当百草枯浓度为 800mg/L时，野生型棉花枯萎，转基因大豆生长良好。当百草枯浓度达到 3200mg/L时，仍有 7株大豆植株的种苗表现出很好的抗百草枯能力，其生长状况如图 8所示。

下面的说明与本申请说明书中此处提到的

保藏的微生物或其他生物材料相关：

-1 页码 8

-2 行号： 6-8

-3 保藏事项

-3-1 保藏单位名称 CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 -3-2 保藏单位地址中国微生物菌种保藏委员会，中国北京市 2714信箱，邮政编码：100080， Be i j i ng (GN)。

-3-3 保藏日期 2008年 12月 09日（09. 12. 2008)

-3-4 保藏号 CGMCC 2787

-5 本说明是对下列指定国

所有指定国由受理局填写

-4 本表格与国际申请一起收到：

(是或否）

-4-1 受权官员由国际局填写 -5 国际局收到本表格日期： -5-1 受权官员

Claims

权利要求书

1，种植植物的方法，其包括种植转基因植物和施用高浓度的百草枯的步骤，其中所述转基因植物被导入高百草枯抗性的 pqrA基因突变体。
2，权利要求 1 所述的种植植物的方法，其中百草枯的浓度为 100(T3200mg/L，优选为 1600〜3200mg/L，如 1600mg/L或 3200mg/L。

3，权利要求 1或 2所述的种植植物的方法，其中高百草枯抗性的 pqrA基因突变体编码选自以下位置突变的 PqrA蛋白: Ser64, I le85， Val92， Val96， Val389， Ala398。

4，权利要求 3所述的种植植物的方法，其中高百草枯抗性的 pqrA基因突变体编码选自以下突变的 PqrA蛋白： Ser64→Ala, I le85→Val , Val92→Ala, Val96→Leu, Val389→Ala, Ala398

→Val。
5，权利要求 3所述的种植植物的方法，其中高百草枯抗性的 pqrA基因突变体是编码如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白的基因，优选其序列如 SEQ ID NO: 1所示。

6，高百草枯抗性的突变的 PqrA蛋白，其突变位置选自： Ser64, I le85， Val92， Val96， Val389， Ala398。
7，编码权利要求 6所述的 PqrA蛋白的 pqrA基因突变体。
8，包含权利要求 7 所述的 pqrA 基因突变体的载体，优选是植物转化载体，如 pCAMBIA1303-pqrKl。

9，包含权利要求 7所述的 pqrA基因突变体的细胞，优选是微生物细胞，更优选是保藏号为 CGMCC No.2787的人苍白杆菌 Ochrobactrum an thropi KTQ-077株细胞。

10，权利要求 7所述的 pqrA基因突变体在培育高百草枯抗性的转基因植物中的应用，优选所述植物是烟草、玉米、水稻、棉花、油菜或大豆。