CN102548388A - 百草枯抗性基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了种植植物的方法，其包括种植高百草枯抗性的转基因植物和施用高浓度的百草枯的步骤，其中所述转基因植物被导入编码如SEQIDNo：2所示的蛋白的基因。另外，本发明还提供了为植物带来高百草枯抗性的基因的筛选、检测和应用方法等。

Description

百草枯抗性基因及其应用 技术领域
本发明属于转基因植物技术领域， 具体而言， 本发明涉及高百草枯抗性基因在转基因植 株培育中的应用。 背景技术
百草枯 (paraquat, 1, 1-二甲基 -4,4'-联吡啶， 分子量 257.2) 是继草甘磷之后的第二大除草 剂， 是一种速效触杀型除草剂， 兼有一定内吸作用， 主要用于果园、 桑园、 茶园、 林带等作 物的杂草， 估计将来的应用呈上升、 递增趋势。 百草枯在农业种植中的广泛应用已近 50年， 应用在世界范围内超过 100个国家， 受到广泛接受与欢迎。 90年代以来， 随着农业生产的需 求， 我国若干农药企业先后开始规模生产百草枯原药， 并不断的改进生产工艺， 产品在各地 推广应用， 在生产中发挥了一定的作用。
百草枯是非选择性除草剂， 植物对其吸收非常迅速， 即使喷药后短期内降雨也不影响药 效的发挥； 吸收的药剂通过木质部中的逆向流进行传导， 在适宜条件下， 大量药剂被叶片吸 收并向其他部位传导， 此种传导仅仅是非原质体 (木质部)传导， 因而叶面处理的百草枯通常 停滞于被处理的叶片内。 作为典型的光合系统 I抑制剂， 白枯草的活性的发挥决定于光。 毒 理学机理研究表明， 百草枯的生物毒性与致突变性的原因是， 当双氧化合物存在时， 百草枯 被还原并重新被氧化， 在此循环反应过程中产生负自由基 02_并在活细胞体内积累。 Ju-Fang Ma等人从一株铜绿假单胞菌中克隆到 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因 zwf，该基因对百草枯产生的 负自由基 02_具有有效的脱毒作用。
美国专利 US6451543B1和 US7482425B2分别在其 SEQ ID No: 27中公开了一种与本发 明所涉及的 SEQ ID No: 2完全相同的蛋白，但是它们都用于整合入脂质基质，从而适于 FRET 分析膜上的多肽， 并没有提示本发明的应用。
Jinki Jo等人 （Biochem. Biophys. Res. Commun. 285 (4), 885-890 (2001)) 从无色杆菌中发 现一种与本发明所涉及的 SEQ ID No : 2 结构差异极大的基因 （即 pqrA， GenBank: AAF86626.1 ),其编码的蛋白对于百草枯具有一定抗性。 Jinki Jo等人将该 pqrA基因转进烟草 中， 在得到了很好的表达的情况下， 对比于野生株转基因烟草具有对百草枯有一定的抗性。 pqrA基因的转基因烟草植株在和野生型烟草相比时， 野生型生长在半固体培养基中当百草枯 为 ΙμΜ浓度时即出现枯萎， 百草枯达 20μΜ (约 5mg/L) 浓度时植株即死亡， 而转基因烟草 仍然是正常生长； 然而， 当在百草枯浓度达到 50μΜ (约 12.5mg/L) 的情况下， 转基因烟草 的叶片中叶绿素含量的损失也将达到约 15%， 因此该基因能够耐受的百草枯在培养基中的浓 度达基本停留在 5mg/L左右。
目前对培育高百草枯抗性的转基因植物的研究较少， 商品化的还没有， 研究主要停留在 实验室阶段。 根据本发明人经验， 田间除草时 20%百草枯水制剂用量为 100-200ml/亩， 按照 常规用法稀释到 25L水计算，一般 800-1600mg/L是常用的田间喷洒浓度，而实际使用时会被 部分农民超剂量使用，因此制约其商品化的原因之一是转基因植物对百枯草的耐受程度不高， 与实际使用相去甚远的抗性影响了实际应用； 另外， 也不清楚培育转基因植物所选用的基因 的抗性对不同植物 （如， 烟草、 棉花、 水稻、 玉米、 大豆等与遗传背景相互区别很大的常见 农作物）的适用性； 而且， 多药物抗性蛋白 （multidrug resistance protein)及其编码基因很多， 仅在公共数据库 PubMed上就有近 2万篇文章介绍上千种多药物抗性蛋白， 从中没有明确的 方向得到高百草枯抗性蛋白及其编码基因， 只能依赖于凭运气式的选择并验证， 由于无法预 期最初选择的蛋白是高抗性， 因此工作量惊人， 实际难以完成。
本发明人通过长期艰苦的研究， 令人意外地发现了如 SEQ ID No: 2所示的蛋白及其编 码基因导入植物后可使该转基因植物对施用百草枯的耐受性 （即， 抗性） 达到 3200mg/L 的 高水平， 同时使植株对培养基中百枯草浓度的耐受性达到 50mg/L 的高水平， 而且该高抗性 还是用于多种植物， 应用前景广阔。 发明内容
本发明要解决的技术问题在于满足在种植植物时的预防性除杂草或发现杂草后除杂草 的过程中实际施用百草枯的要求， 使要种植的植物在实际使用的高浓度百草枯的条件下的生 长不受到影响， 从而专一地杀灭杂草。 本发明要解决的技术问题还在于为植物带来高百草枯 抗性的基因的筛选、 检测和应用方法等。
令人意外的是，本发明的高百草枯抗性的 pqrK2基因及其编码的蛋白不但能够为相应转 基因植物带来能够耐受常规田间施用的百草枯浓度， 而其更能够耐受 200mg/L左右的百草枯 浓度， 使得在实际使用中有较大的耐受冗余度， 从而更符合实际施用的要求； 另外， 本发明 的高百草枯抗性的 pqrK2基因及其编码的蛋白的植物适应性广， 在大量与烟草遗传背景显著 不同的转基因植物中都能取得良好的高百草枯抗性。
具体而言， 在第一方面， 本发明提供了种植植物的方法， 其包括种植高百草枯抗性的转 基因植物和施用高浓度的百草枯的步骤， 其中所述转基因植物被导入编码如 SEQ ID No: 2 所示的蛋白的基因 （本文中命名为 pqrK2)。 由于本发明的高百草枯抗性的 pqrK2基因及其编 码的蛋白能为相应转基因植物带来高百草枯抗性， 因而能够耐受高浓度的百草枯， 从而在施 用高浓度的百草枯的时候， 不影响相应转基因植物的生长， 而专门除去或预防性地除去杂草。 因而， 本发明第一方面的种植植物的方法也包括了除去杂草的方法、 或在种植植物时除去杂 草的方法。 优选在在本发明的第一方面中， 所述植物是烟草、 玉米、 水稻、 棉花、 油菜或大 豆， 尤其优选是玉米、 水稻、 棉花或大豆。
在本文中， "施用 "指的是田间施用， 如田间喷洒。 与之相适应的， 如未特别指明， 本 文中的百草枯的 "浓度"指田间施用的浓度， 该浓度比百草枯在培养基中的浓度更加贴近于 实际应用。 当然， 本发明人也发现， 本发明的高百草枯抗性的 pqrK2基因及其编码的蛋白为 植株带来耐受至少为 50mg/L的在培养基中的浓度， 远远高于现有技术的野生 pqrA基因所带 来 5mg/L的在培养基中的浓度耐受性。 这从另一个方面证实了本发明的 pqrK2基因及其编码 的蛋白是高百草枯抗性的。
在本文中， 如未特别指明， 百草枯的 "高浓度 "指的是百草枯的浓度大于 800mg/L。 优 选百草枯的浓度为 100(T3200mg/L， 更优选为 1600〜3200mg/L， 如田间常用的 1600mg/L、 或 可能过量施用的 1700 mg/L、 1800 mg/L、 2000 mg/L、 2300 mg/L、 2600 mg/L、 2900mg/L、 或 3200mg/L。 在本发明的具体实施方式中， 本发明的高百草枯抗性的 pqrK2基因及其编码的 蛋白能为相应转基因植物带来高达 3200mg/L的百草枯抗性。 相应地， 在本文中， "高百草枯 抗性"指的是能给相应植物带来的耐受所述高浓度的百草枯的性质。
在本文中， "PqrK2蛋白"指的是氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示的蛋白或其功能等同 的突变体蛋白， 优选是氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示的蛋白。相应地， 在本文中， "pqrK2 基因"指的是编码上述 PqrK2蛋白的基因。 本发明的基因是核酸分子， 它可以是 DNA形式， 也可以是 RNA形式，优选 DNA形式。 DNA形式包括天然 cDNA和人工合成的 cDNA， DNA 可以是编码链或模板链。 在知晓具体序列的前提下， 通过常规技术， 如 PCR方法、 重组法或 人工合成的方法， 本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋 白的核酸分子或其片段。 这些序列一旦获得， 就可以将其克隆入载体， 再转化或转染入相应 的细胞， 然后通过常规的宿主细胞进行增殖， 从中分离得到大量的核酸分子。 当然， 本领域 技术人员根据本文的启示， 通过缺失、 取代和 /或添加 SEQ ID No: 2所示的蛋白中一个或几 个氨基酸的方式， 或者通过杂交来搜寻能在严紧条件下能与编码 SEQ ID No: 2所示的蛋白 的核酸杂交的核酸， 选择出与本发明 PqrK2蛋白及其 pqrK2基因功能等同的突变体蛋白及其 基因， 这也纳入本发明的范围之内。 编码缺失、 取代和 /或添加 SEQ ID No: 2所示的蛋白的 核酸或者在严紧条件下能与编码 SEQ ID No: 2所示的蛋白的核酸杂交的核酸， 可以被导入 无百草枯抗性的细菌中， 可以筛选出与氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示的蛋白功能等同的 突变体蛋白及其编码基因。 另外， 也优选将编码缺失、 取代和 /或添加 SEQ ID No: 2所示的 蛋白的核酸或者在严紧条件下能与编码 SEQ ID No: 2所示的蛋白的核酸杂交的核酸， 导入 植物中， 筛选百草枯抗性的转基因植物， 也可以筛选出与氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示 的蛋白功能等同的突变体蛋白及其编码基因。 例如， 可以采用将编码候选的 PqrK2蛋白功能 等同的突变体蛋白的基因导入植物中， 来观察是否具有氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示的 蛋白的功能， 由此筛选出功能等同的突变体蛋白及其编码基因。
本文中所使用的蛋白及氨基酸、 基因及核苷酸的表示方法均为所属领域公认的表示方 法， 如表 1所示的氨基酸或氨基酸残基符号， 本领域技术人员根据它可以反推出相应的三核 苷酸密码子。 在本发明的具体实施方式中， 所使用的编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基 因序列如 SEQ ID NO: 1所示。
表 1 氨基酸缩写表
氨基酸 三字母缩写 一字母缩写 氨基酸 三字母缩写 一字母缩写 丙氨酸 Ala A 亮氨酸 Leu L 精氨酸 Arg R 赖氨酸 Lys K 天冬酰胺 Asn N 蛋氨酸 Met M 天冬氨酸 Asp D 苯丙氨酸 Phe F 半胱氨酸 Cys C 脯氨酸 Pro P 谷氨酰胺 Gin Q 丝氨酸 Ser S 谷氨酸 Glu E 苏氨酸 Thr T 甘氨酸 Gly G 色氨酸 Trp w 组氨酸 His H 酪氨酸 Tyr Y 异亮氨酸 lie I 缬氨酸 Val V
优选在本发明的第一方面， 其中编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因是通过植物转 化载体导入转基因植物的，优选所述植物转化载体是 pCAMBIA1303-pqrK2。本文中的术语 "载 体"是指本领域中常用的细菌质粒、 粘粒、 噬菌粒、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 动物病毒及 其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同， "载体"在本文中可以分为 "克隆载体"、 "表达 载体"和 "转化载体"， 指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、 表达相应基因和将相 应基因转化。 本发明中适用的载体包括但不限于： 在细菌中表达用的载体 （原核表达载体）、 在酵母中表达用的载体（如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等）、在昆虫细胞中表达的杆状病毒 载体、 在哺乳动物细胞中表达用的载体 （痘苗病毒载体、 逆转录病毒载体、 腺病毒载体、 腺 伴病毒载体等）、 在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。 除了在克隆过程中必要的克隆载体之外， 还优选本发明第四方面中的载体是转化载体， 尤其 是植物转化载体。 在本发明的具体实施方式中， 所述植物转化载体为 pCAMBIA1303-pqrK2， 其图谱如图 1所示。 pCAMBIA1303-pqrK2的构建是，先把 pCAMBIA1303的约 2.5kb的 gus-gfp 融合基因切除， 保留 35S启动子部分， 利用 Ncol和 Bstpl—对酶切位点插入目的基因 pqrK2。
优选在本发明的第一方面， 其中编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因来自于高百草 枯抗性的细菌细胞。 文中的术语 "细胞" 可以是原核细胞， 也可以是真核细胞， 如， 细菌细 胞、 酵母细胞、 植物细胞、 昆虫细胞、 哺乳动物细胞等。 优选的高百草枯抗性的细菌细胞是 大肠杆菌细胞。 这类高百草枯抗性的大肠杆菌可以通过以下方面的筛选方法来获得。
施用通常根据百草枯的经营商的说明来进行，如根据经营商说明的开始时间、施用浓度、 施用范围和持续时间来进行。 通常， 田间除草时 20%百草枯水制剂用量为 100-200ml/亩， 按 照常规用法稀释到 25L水计算，一般 800-1600mg/L是常用的田间喷洒浓度。优选在本发明的 第一方面， 其中施用的开始时间， 即开始施用的时间可以是在发现有杂草生长的时候。 也优 选在本发明的第一方面， 其中施用的开始时间是在植株开始生长后 3至 60天， 优选在植株开 始生长后 5至 50天， 更优选是在植株开始生长后 7至 30天。 植株开始生长的时间指的是在 适合植株种子生长的条件下种植植株种子的时间。 本发明人发现， 过晚施用， 则杂草也会在 施用前生长出， 已经会对植株的生长产生一定的影响。
在第二方面， 本发明提供了筛选高百草枯抗性的细菌的方法， 其包括，
1 ) 取受百草枯污染过的土壤接种到含百草枯的液体选择性培养基中， 于 35°C振荡培养 一周；
2 ) 将液体培养获得的培养液涂布到固体选择性培养基上， 于 35°C恒温培养， 直至长出 明显可见的菌落； 以及
3 ) 取固体培养的单菌落， 接种于液体选择性培养基中， 于 35°C振荡培养， 直至细胞浓 度达到 107〜108cfu/mL; 任选地， 重复步骤 2 ) -3)；
其中， 所述液体选择性培养基为含有百草枯的液体 BS无机盐培养基， 优选百草枯的含 量为 200mg/L; 固体选择性培养基为含有百草枯的固体 BS无机盐培养基， 优选百草枯的含量 为 200mg/L; 液体 BS无机盐培养基的配方为： 每 lOOOmL培养基中含： Ν¾ΗΡ04 · 2¾0 7. 0g， KH2P04 3. 0g, NaCl 0· 25g， MgS04 · 7H20 0· 3g， CaCl2 · 2H20 0· 02g， FeCl3 · 6H20 0. 045g, MnS04 ·4Η20 0. 01g， ZnS04 ·7Η20 0. 01g， CuS04 ·5Η20 0. 002g, CoCl2 ·6Η20 0. 003g, NiCl2 ·6Η20 0. 003g， 和 N¾Mo04 · 2H20 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水； 固体 BS无机盐培养基的配方为配方 中进一步含有 13. 5g琼脂粉的液体 BS无机盐培养基的配方。 优选在本发明的第二方面， 其中所述细菌是大肠杆菌。
在第三方面， 本发明提供了用于筛选高百草枯抗性的细菌的选择性培养基， 其为含有百 草枯的 BS无机盐培养基， 其中所述 BS无机盐培养基含有的配方为： 每 lOOOmL培养基中含： Ν¾ΗΡ04 · 2¾0 7. 0g， KH2P04 3. 0g， NaCl 0. 25g， MgS04 · 7H20 0. 3g， CaCl2 · 2H20 0. 02g， FeCl3 ·6Η20 0. 045g， MnS04 ·4Η20 0. 01g， ZnS04 ·7Η20 0. 01g， CuS04 ·5Η20 0. 002g， CoCl2 «6H20 0. 003g， NiCl2 · 6H20 0. 003g， 和 N¾Mo04 · 2H20 0. 002g， pH 7. 5， 其余为水， 并任选所述 BS无机盐培养基含有的配方中进一步含有 13. 5g琼脂粉。 SP， 所述 BS无机盐培养基是液体 BS无机盐培养基， 则所述 BS无机盐培养基含有的配方中不含有 13. 5g琼脂粉； 而所述 BS无 机盐培养基是固体 BS无机盐培养基， 则所述 BS无机盐培养基含有的配方中还含有 13. 5g琼 脂粉。
在本发明的一个单独的方面， 本发明提供了导入了编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的 基因的高百草枯抗性的转基因植物或其后代、 种子， 优选所述植物是烟草、 玉米、 水稻、 棉 花、 油菜或大豆。 这类植物或其后代、 种子可以通过本发明第一方面的种植方法种植而得。 另外， 本发明还提供了由上述转基因植物或其后代、 种子的可利用部分加工而成的无繁殖能 力的农业制成品， 如食品或纺织品， 如烟丝、 大米 （脱水后无繁殖能力的水稻种胚）、 棉絮、 植物油等。 其中所述加工方法是本领域技术人员所公知的， 完全可以使用加工相应的非转基 因植物成相应的农业制成品的方法进行。
在第四方面， 本发明提供了鉴定导入了编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因的高百 草枯抗性的转基因植物或其后代、 种子的方法， 其包括从所述转基因植物或其后代、 种子中 进行编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的序列的扩增， 对扩增出的序列进行序列分析并与编 码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因相比较。 其中扩增的方法是公知的， 如 PCR扩增。 由 于本发明编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因是从细菌中分离得到的， 天然的植物或其 种子中并不含有该基因，如果能够从植物或其种子中扩增出序列而且该序列与编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因相同， 那么该植物或其种子就是导入了编码如 SEQ ID No: 2所示的 蛋白的基因的高百草枯抗性的转基因植物或其后代、 种子。
在第五方面， 本发明提供了编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因在培育高百草枯抗 性的转基因植物中的应用。 在已知基因的条件下， 培育转基因植物的方法是有先例的， 例如 可以通过农杆菌转化的方式或者微粒轰击或电穿孔的方式将基因导入植物或其组织中， 然后 培养该植物或其组织并在存在百草枯的环境中筛选。 优选在在本发明的第六方面中， 所述植 物是烟草、 玉米、 水稻、 棉花、 油菜或大豆， 尤其优选是玉米、 水稻、 棉花或大豆。 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。 需要特别指 出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 并不构成对本发明范围的限制。 显然本领域的普通 技术人员可以根据本文说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变， 这些 修正和改变也纳入本发明的范围内。 另外， 本发明引用了公开文献， 这些文献也是为了更清 楚地描述本发明， 它们的全文内容均纳入本发明进行参考， 就好像它们的全文已经在本发明 说明书中重复叙述过一样。 附图说明
图 1为将 pqrK2基因插入到载体 pCAMBIA1303中以获得的 pCAMBIA1303- pqrK2载体 的构建过程的示意图。
图 2为转基因烟草植株和野生型植株在百草枯浓度为 50mg/L的培养基上的表现照片，其 中左图的转化有 pCAMBIA1303- pqrK2的转基因烟草苗百草枯抗性明显优于右图的野生型植 株。
图 3 为 pqrK2转基因烟草 TQ代植株苗叶片基因组 DNA的 PCR扩增的电泳照片，其中泳 道 1一 10分别为转基因烟草， 泳道 M为分子量标记， 泳道 +为阳性对照， -为阴性对照。
图 4为烟草苗生长 30天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 2天的对比照片， 其中标记有 "野 生"字样的箭头所指的区域种植野生型植株， 其他长势良好的区域种植本发明的高百草枯抗 性植株。
图 5为棉花苗生长 7天后喷洒 3200mg/L的百草枯前后的对比照片， 图 5a为喷洒前的照 片， 图 5b为喷洒后 120小时的照片， 其中图 5b的 B为已经干枯的野生型棉花， 而图 5b中 的 A为未受影响的本发明的高百草枯抗性棉花。
图 6为水稻苗期叶片耐受百草枯能力实验的结果照片， 其中 A区为本发明的高百草枯抗 性水稻苗， B区为野生型水稻苗。
图 7为玉米苗生长 12天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 120小时的对比照片， 其中 B区的 野生型玉米已经干枯， 而 A区的本发明的高百草枯抗性玉米未受影响。
图 8为大豆苗生长 18天后喷洒 3200mg/L的百草枯后 120小时的对比照片， 其中 B区的 野生型玉米已经干枯， 而 A区的本发明的高百草枯抗性玉米未受影响。 具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。 实施例 1、 pqrK2基因的获得
根据环境调查， 发现武汉钢铁集团公司焦化废水车间的活性污泥受到百草枯污染。采集 该地点土壤样品， 接种到含百草枯的液体选择性培养基 （即在 BS无机盐培养基 （每 lOOOmL 培养基中含： Ν¾ΗΡ04 ·2Η20 7. 0g， KH2P04 3. 0g， NaCl 0. 25g， MgS04 ·7Η20 0. 3g， CaCl2 ·2Η20 0. 02g， FeCl3 ·6Η20 0. 045g， MnS04 ·4Η20 0. 01g， ZnS04 ·7Η20 0. 01g， CuS04 ·5Η20 0. 002g， CoCl2 · 6H20 0. 003g, NiCl2 · 6H20 0. 003g, 和 N¾Mo04 · 2H20 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水） 中添加 200mg/L的百草枯） 的摇瓶中， 于 35°C以 120rpm振荡培养一周。
然后，将培养获得的培养液涂布到固体选择性培养基（每 lOOOmL培养基中还添加 13. 5g 琼脂粉） 上， 于 35°C恒温培养， 直至长出明显可见的菌落。 然后， 挑取单菌落， 移接到液体 选择性培养基中， 于 35°C以 120rpm振荡培养， 直至细胞浓度达到 107〜108cfu/mL。 然后， 重 复本段前述步骤， 在固体选择性培养基和液体选择性培养基中反复筛选， 最终得到 6株对百 草枯有较好抗性的菌株。 其中 1株大肠杆菌 E. C0li、被命名为 KT-q5366。 它经基因测序， 找到被命名为 pqrK2的基因，其序列如 Seq ID No: 1所示。 PqrK2所编码的蛋白如 Seq ID No:
2所示。 实施例 2、 植物表达载体的构建
抽提 KT-q5366的基因组 DNA作为模板， 利用分别引入 Nco I 、 Bstp I酶切位点的引 物 pqrK2- Fa ( 5'- CATGCCATGGCAATGAACCCTTATATTTATC -3' ) 、 pqrK2-Ra2 ( 5'-
GGGTcACCCTTAATGTGGTGTGCTTCGT -3' ) 进行 PCR扩增 ， 于 55°C退火， 扩增得到的 333bp 的 PCR片段 pqrK2_333。 然后用 Ncol、 Bstp I双酶切 pqrK2_333， 回收产物作为连接片段， 同时以 Ncol 、 Bstp I双酶切 pCAMBIA1303 (可购自 Invitrogen公司）作为载体， T4 DNA连接 酶连接片段和载体。 最后筛选得到具有卡那霉素抗性的克隆， 经验证正确后命名为质粒 pCAMBIA1303-pqrK2o 实施例 3、 植物转化以及苗期筛选
使用常规农杆菌转化法转化烟草、 棉花、 水稻、 玉米以及大豆。 具体而言， 将构建好的 植物表达载体 pCAMBIA1303- pqrK2转化农杆菌， 然后分别转化上述植 （作）物。 转化后， 用 潮霉素 （50mg/L) 抗性和一定浓度 (25— 50mg/L)的百草枯筛选出 TQ代 （转化进行的当代） 转 基因植 （作） 物苗， 然后从筛选得到的转基因植株 TQ代叶片中提取基因组 DNA， 以 PCR法 测定 pqrKl基因阳性。 然后， TQ代植株自交， 分别得到 1 代植株： 烟草 30株， 水稻 23株， 玉米 19株、 棉花 21株和大豆 22株。 将1 代种子按每个株系 50— 100粒分别种植， 待植株 长到 4-5叶期时， 取植株叶片做叶片耐百草枯能力实验和 /或对植株做喷洒实验。其中， 叶片 耐百草枯能力实验的过程如下： 每个单株取新叶中段 2cm长左右， 浸泡于 lml ( 5μΜ百草枯， 0. 025% Tween)百草枯溶液 24小时观察叶片；喷洒实验的过程如下：用浓度为 5mg/L、 15mg/L、 100mg/L, 150mg/L.、 200mg/L、和 300mg/L的百草枯分别喷洒幼苗，加野生型作为阴性对照， 观察并统计能正常生长的抗性苗。 具体结果如下：
1， 烟草
共筛选出百草枯抗性阳性的烟草 TQ代植株 26株。 图 2显示了 TQ代转基因烟草植株和 野生型植株在百草枯浓度为 50mg/L 的培养基上的表现， 表明阳性转基因烟草苗对百草枯的 一定抗性， 这些 TQ代阳性转基因烟草植株的叶片中所提取的基因组 DNA都能扩增出大小为 约 330bp的 pqrK2基因片段 （参见图 3 )。
自交后， 获得 代植株 26株， 命名为 K2-1 26, 每个 1 代植株分别种植种子 100粒， 以野生型烟草为对照进行喷洒实验。 结果发现 800mg/L百草枯的条件下处理 5天后野生型全 部枯死， 阳性转基因烟草植株均未见明显损伤； 而 1600mg/L百草枯的条件下， 野生型处理 2 天后就已全部枯死， 而大部分阳性转基因烟草植株生长良好。 即使在 3200mg/L 百草枯浓度 喷洒下， 如表 2所示， 大量 1 代植株的种苗也生长良好， 表现出很好的百草枯抗性。
表 2 T1代转基因烟草种苗筛选情况
K2-1 46 K2-14 49
Κ2-2 38 K2-15 34
Κ2-3 43 K2-16 48
Κ2-4 51 K2-17 30
Κ2-5 54 K2-18 43
Κ2-6 34 K2-19 49
Κ2-7 42 Κ2-20 34
Κ2-8 46 K2-21 34
Κ2-9 33 Κ2-22 42
K2-10 45 Κ2-23 38
K2-11 30 Κ2-24 45
K2-12 25 Κ2-25 55
K2-13 51 Κ2-26 52 2， 棉花
将筛选出的百草枯抗性阳性的棉花 TQ代植株自交后， 获得 1 代植株 23株， 每个 1 代植 株分别种植种子 50粒， 以野生型棉花为对照进行喷洒实验。 当百草枯浓度为 800mg/L时， 野生型棉花枯萎， 转基因棉花生长良好。 当百草枯浓度达到 3200mg/L时， 仍有 8株棉花植 株的种苗表现出很好的抗百草枯能力， 其生长状况如图 5所示。
3， 水稻
将筛选出的百草枯抗性阳性的水稻 TQ代植株自交后， 获得 1 代植株 21 株， 命名为 ΚΤ00493-Γ21,每个 1 代植株分别种植种子 100粒， 以野生型水稻为对照进行叶片耐百草枯 能力实验和喷洒实验。
叶片耐百草枯能力实验的结果如图 6所示， 其中 A区为百草枯抗性阳性的水稻苗的植株 叶片， 明显优于 B区中常规种植 （未添加百草枯） 的野生型植株的叶片。
喷洒实验后， 当百草枯浓度为 800mg/L时， 野生型水稻枯萎， 转基因水稻生长良好。 即 使在 200mg/L百草枯浓度喷洒下， 如表 3所示， 大量 1 代植株的种苗也生长良好， 表现出很 好的百草枯抗性。 表 3 T1代转基因水稻种苗筛选情况
植株编号 抗性苗数量 ： 植株编号 抗性苗数
KT00493-1 35 KT00493- 12 55
KT00493-2 43 KT00493-13 35
KT00493-3 43 KT00493-14 43
KT00493-4 37 KT00493-15 43
KT00493-5 51 KT00493-16 49
KT00493-6 34 KT00493-17 34
KT00493-7 37 KT00493-18 34
KT00493-8 33 KT00493-19 32
KT00493-9 29 KT00493-20 51
KT00493-10 39 KT00493- 21 37
KT00493-11 47 4， 玉米
将筛选出的百草枯抗性阳性的玉米 TQ代植株自交后， 获得 1 代植株 28株， 每个 1 代植 株分别种植种子 50粒， 以野生型玉米为对照进行喷洒实验。 当百草枯浓度为 800mg/L时， 野生型棉花枯萎， 转基因玉米生长良好。 当百草枯浓度达到 3200mg/L时， 仍有 11株玉米植 株的种苗表现出很好的抗百草枯能力， 其生长状况如图 7所示。
5， 大豆
将筛选出的百草枯抗性阳性的大豆 TQ代植株自交后， 获得 1 代植株 30株， 每个 1 代植 株分别种植种子 50粒， 以野生型玉米为对照进行喷洒实验。 当百草枯浓度为 800mg/L时， 野生型棉花枯萎， 转基因大豆生长良好。 当百草枯浓度达到 3200mg/L时， 仍有 13株大豆植 株的种苗表现出很好的抗百草枯能力， 其生长状况如图 8所示。

Claims (5)

  1. 权利 要求 书
    1， 种植植物的方法， 其包括种植高百草枯抗性的转基因植物和施用高浓度的百草枯的步骤， 其中所述转基因植物被导入编码 PqrK2蛋白的基因。
  2. 2， 权利要求 1 所述的种植植物的方法， 其中百草枯的浓度为 100(T3200mg/L， 优选为 1600〜3200mg/L， 如 1600mg/L或 3200mg/L。
  3. 3， 权利要求 1或 2所述的种植植物的方法， 其中所述转基因植物被导入编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因， 优选其中编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因序列如 SEQ ID NO:
    1所示。
  4. 4， 权利要求 1或 2所述的种植植物的方法， 其中编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因是 通过植物转化载体导入转基因植物的， 优选所述植物转化载体是 pCAMBIA1303-pqrK2， 也优 选编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因来自于高百草枯抗性的细菌细胞。
    5， 权利要求 1所述的种植植物的方法， 其中施用的开始时间是在植株开始生长后 3至 60天。 6， 权利要求 1或 2所述的种植植物的方法， 其中所述植物是烟草、 玉米、 水稻、 棉花、 油菜 或大豆。
  5. 7， 筛选高百草枯抗性的细菌的方法， 其包括，
    1 ) 取受百草枯污染过的土壤接种到含百草枯的液体选择性培养基中， 于 35°C振荡培养 一周；
    2 ) 将液体培养获得的培养液涂布到固体选择性培养基上， 于 35°C恒温培养， 直至长出 明显可见的菌落； 以及
    3 ) 取固体培养的单菌落， 接种于液体选择性培养基中， 于 35°C振荡培养， 直至细胞浓 度达到 107〜108cfu/mL; 任选地， 重复步骤 2 ) -3)；
    其中， 所述液体选择性培养基为含有百草枯的液体 BS无机盐培养基， 优选百草枯的含 量为 200mg/L; 固体选择性培养基为含有百草枯的固体 BS无机盐培养基， 优选百草枯的含量 为 200mg/L; 液体 BS无机盐培养基的配方为： 每 lOOOmL培养基中含： Ν¾ΗΡ04 · 2¾0 7. 0g， KH2P04 3. 0g, NaCl 0· 25g， MgS04 · 7H20 0· 3g， CaCl2 · 2H20 0· 02g， FeCl3 · 6H20 0. 045g, MnS04 ·4Η20 0. 01g， ZnS04 ·7Η20 0. 01g， CuS04 ·5Η20 0. 002g, CoCl2 ·6Η20 0. 003g, NiCl2 ·6Η20 0. 003g， 和 N¾Mo04 · 2H20 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水； 固体 BS无机盐培养基的配方为配方 中进一步含有 13. 5g琼脂粉的液体 BS无机盐培养基的配方。
    8， 用于筛选高百草枯抗性的细菌的选择性培养基， 其为含有百草枯的 BS无机盐培养基， 其 中所述 BS无机盐培养基含有的配方为： 每 lOOOmL培养基中含： Na2HP04 · 2¾0 7. 0g， KH2P04
    3. 0g， NaCl 0. 25g， MgS04 ·7Η20 0. 3g， CaCl2 ·2Η20 0. 02g， FeCl3 ·6Η20 0. 045g， MnS04 ·4Η20 0. 01g， ZnS04 ·7Η20 0. 01g， CuS04 ·5Η20 0. 002g， CoCl2 ·6Η20 0. 003g， NiCl2 ·6Η20 0. 003g， 和 Na2Mo04 · 2H20 0. 002g, pH 7. 5, 其余为水， 并任选所述 BS无机盐培养基含有的配方中进 一步含有 13. 5g琼脂粉。
    9， 鉴定导入了编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因的高百草枯抗性的转基因植物或其后 代、 种子的方法， 其包括从所述转基因植物或其后代、 种子中进行编码如 SEQ ID No: 2所 示的蛋白的基因序列的扩增， 对扩增出的序列进行序列分析并与编码如 SEQ ID No: 2所示 的蛋白的基因相比较。
    10， 编码如 SEQ ID No: 2所示的蛋白的基因在培育高百草枯抗性的转基因植物中的应用， 优选所述植物是小麦、 玉米、 水稻、 棉花、 油菜或大豆。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451543B1 (en) * 1998-08-31 2002-09-17 Gryphon Sciences Lipid matrix-assisted chemical ligation and synthesis of membrane polypeptides

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482425B2 (en) * 1999-08-26 2009-01-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions for lipid matrix-assisted chemical ligation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451543B1 (en) * 1998-08-31 2002-09-17 Gryphon Sciences Lipid matrix-assisted chemical ligation and synthesis of membrane polypeptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YELIN Y ET.AL.,: "EmrE,a small Escherichia coli multidrug transporter, protects saccharomyces cerevisiae from toxins gy sequestration in the vacuole", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
YERUSHALMI, H. ET AL.: "EmrE, an Escherichia coli 12-kDa Multidrug Tr创lsporter， Exchange Toxic Cations and H+ and Is Soluble in Organic Solvents", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

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