CN102559785B - 溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法，该方法包括固定化酶载体的制备、脂肪酶的固定和共轭亚油酸乙酯的合成三个步骤。固定化褶皱假丝酵母脂肪酶以戊二醛为交联剂通过吸附交联的方法制备，共轭亚油酸乙酯的合成采用共轭亚油酸(CLA)和乙醇为原料，在无水介质的庚烷或异辛烷溶剂中在固定化CRL的作用下发生酯化反应，得到共轭亚油酸乙酯，在实验条件下，CLA酯化率可达50～90％，其中9c，11t-CLA酯化率可达85～99％，10t，12c-CLA酯化率为30～80％。该方法工艺简单，反应条件温和，产物分离方便，产品质量好，无污染。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法，是属于以共轭亚油酸和乙醇制备共轭亚油酸乙酯的技术。
(二)背景技术
共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是含有共轭双键的一系列十八碳二烯酸的混合物，含有多种异构体。其中，两种具有重要生理活性的异构体9-顺，11-反-共轭亚油酸(9c，11t-CLA)具有抗癌和抗氧化作用，10-反，12-顺-共轭亚油酸(10t，12c-CLA)具有调控脂肪代谢的作用，用于减肥和预防心血管疾病。目前国内外市场上出现的CLA产品主要是以游离脂肪酸形式存在，但是游离脂肪酸易氧化变质且味道差，因此在使用中受到了很大的限制。
共轭亚油酸乙酯(Conjugated Linoleic Acid Ethyl Ester，CLAEE)是游离共轭亚油酸的极好的替代品，它具有优异的亲脂性，性质稳定，易于吸收，是防治心脑血栓、动脉硬化等疾病的药物原料；在化妆品行业，CLAEE作为营养助剂，可加速皮肤细胞更新，具有保湿、抗过敏、调理等多种作用；在食品添加剂行业，有望作为抗氧化剂、营养强化剂等。因此，CLAEE在食品、药品、化妆品及饲料添加剂等工业中具有潜在应用价值，可提高产品的附加值。
目前已公开的报道中，CLAEE的合成主要使用浓硫酸或碱等作催化剂，通过CLA和醇的酯化反应制备。张亚刚等(张亚刚，吾满江·艾力，文彬，马莉，高军军.精细化工，2003，20(1)：38-39.)采用浓硫酸为催化剂催化CLA和醇的反应。蒋帅等(蒋帅，张务勤，沈琳.中国发明专利，公开号：CN101565373，2009-10-28.)采用氢氧化钾为催化剂，无水乙醇和油脂反应制备CLAEE。姜伟等(姜伟，万梓龙，衣丹，石红旗，刘发义.中国粮油学报，2007，22(3)：77-79.)以乙醇钾为催化剂催化共轭化反应合成CLAEE。乙醇钾具有活性高，选择性好等优点，但容易失活。使用浓硫酸或强碱等作催化剂，存在反应温度过高，副反应多，产品色泽差，需要水洗、中和、干燥等后处理工序，产物分离难度大，并且设备腐蚀严重，废水排放量大等缺点。浓硫酸的强氧化性还会使CLA分子中的不饱和键在酯化反应过程中遭到破坏，产生有害物质，使产品质量下降。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种非水溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法，该方法工艺简单，反应条件温和，产物分离方便，产品质量好，固定化脂肪酶制备简单，稳定性好，可重复利用。
本发明采用的技术方案是：
一种溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法，所述方法按照如下步骤进行：
(1)固定化脂肪酶的载体的制备：在室温和强力搅拌下，将水玻璃滴加入到非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和去离子水的混合液中，同时用醋酸调节反应液的pH为5～7；水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1～5h，在30～90℃温度下(优选40～70℃温度下)搅拌晶化20～24h后，反应液过滤或离心分离出固相，经洗涤、室温干燥8～24h，再于80～100℃干燥8～24h，得到所述的固定化脂肪酶的载体；所述水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物EO20PO70EO20与去离子水的物质的量之比为1∶0.008～0.018∶110～230；所述去离子水是指与非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20混合用的去离子水，并不包含水玻璃中所含的溶剂水。
(2)固定化脂肪酶的制备：取褶皱假丝酵母脂肪酶以pH值6.0～7.5磷酸缓冲溶液为溶剂，配制得到浓度为0.4～1.6mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液，将所述步骤(1)中制得的固定化脂肪酶的载体加入到所述褶皱假丝酵母脂肪酶溶液中，在30～60℃温度下，振荡6～12h后，加入浓度为0.25～7.5wt.％的戊二醛溶液交联2～4h后，离心，沉淀用pH值6.0～7.5磷酸缓冲溶液洗涤、干燥得到所述的固定化脂肪酶；所述褶皱假丝酵母脂肪酶与固定化脂肪酶的载体的质量比为200～1000mg/g；
(3)共轭亚油酸乙酯的合成：共轭亚油酸、无水乙醇、有机溶剂和步骤(2)制得的固定化脂肪酶在30～60℃温度下以120～200r/min的速度振荡反应6～20h后，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯；所述共轭亚油酸和无水乙醇的物质的量之比为1∶1～3；所述固定化脂肪酶与共轭亚油酸的质量之比为1∶2～33(优选1∶4.4～13.2)；所述有机溶剂为异辛烷或庚烷。
本发明所述磷酸缓冲液通常为pH值6.0～7.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，缓冲液的浓度通常为0.02～0.2mol/L，最优选pH值为7.0。
本发明所述褶皱假丝酵母脂肪酶可由市售购买得到，活力通常在5000U/g以上。
本发明所述褶皱假丝酵母脂肪酶经固定化制得固定化脂肪酶后，活力较游离酶有所降低，从实施例来看，固定化脂肪酶的活力通常为792～1362U/g，与游离酶相比，固定化酶的活力回收率可达11.3～19.3％。
进一步，本发明所述步骤(2)中戊二醛溶液中溶质戊二醛与褶皱假丝酵母脂肪酶的质量之比为0.03～3.32∶1，优选0.06～1.8∶1。
本发明所述步骤(3)中有机溶剂与共轭亚油酸的物质的量之比为5～13∶1。
本发明优选的有机溶剂为为LogP4～4.5的有机溶剂，如异辛烷(LogP4.5)、庚烷(LogP4.0)。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所用的脂肪酶为固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(CandidaRugosa Lipase)。固定化酶的载体制备方法简单，成本低，具有稳定性好以及重复利用的特点，更重要的是制备的固定化脂肪酶对底物共轭亚油酸(CLA)具有乳化作用，可防止酶分子在有机溶剂中聚集，有效增加底物与酶分子的接触面积，提高酶的催化活性，而且，该发明对CLA中具有重要生理活性的两种异构体9c，11t-CLA和10t，12c-CLA的分离率高，固定化脂肪酶对CLA酯化率可达50～90％，其中9c，11t-CLA酯化率可达85～99％，10t，12c-CLA酯化率可达30～80％。本方法工艺简单，反应条件温和，产物分离方便，产品质量好，无污染。
固定化脂肪酶的活力定义：1g固定化脂肪酶在37℃，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸所需的酶量为1个酶活单位，用单位U表示。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入2.33g分子量为5800的非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和103ml去离子水的混合液中，同时用醋酸调节反应液的pH为5.6。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.0081∶115。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在40℃恒温水浴中搅拌晶化20h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.82g。
取0.4g上述载体，加入到40ml用0.025mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为4mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为160mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase TypeVII，活力自测为7030U/g)中，在30℃水浴中振荡6h进行物理吸附后，加入3ml，5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量159.3mg)交联3h，经12000r/min离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.36g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.11g(2.35mmol)无水乙醇加入装有2ml庚烷和50mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(39.6U，固定化酶的活力为39.6U/50mg＝792U/g，游离酶活力为7030U/g，经计算可得固定化酶的活力回收率为792/7030＝11.3％)的反应器中，在恒温30℃水浴，120r/min振荡，反应6h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.31g。GC-MS分析CLA酯化率为50％，其中9c，11t-CLA酯化率为90.8％，10t，12c-CLA酯化率31.2％。
实施例2：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入2.33g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和134ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为5.8。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.0081∶150。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在50℃恒温水浴中搅拌晶化24h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.81g。
取0.4g上述载体，加入到30ml用0.02mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为6mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为180mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase Type VII，活力自测为7030U/g)中，在35℃水浴中振荡8h进行物理吸附后，加入6ml，5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量318.6mg)交联2h，经12000r/min离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.35g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.32g(7.05mmol)无水乙醇加入装有2ml异辛烷和50mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(45.8U)的反应器中，在恒温35℃水浴，150r/min振荡，反应8h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.34g。GC-MS分析CLA酯化率55.7％，其中9c，11t-CLA酯化率94.1％，10t，12c-CLA酯化率38.3％。
实施例3：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入3.45g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和103ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.2。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.012∶115。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在50℃恒温水浴中搅拌晶化20h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.75g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.05mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为8mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为200mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase Type VII，活力自测为7030U/g)中，在40℃水浴中振荡8h进行物理吸附后，加入5ml，2.5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量132.8mg)交联2h，经12000r/min离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.38g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.11g(2.35mmol)无水乙醇加入装有2ml庚烷和50mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(47.3U)的反应器中，在恒温40℃水浴，180r/min振荡，反应8h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.36g。GC-MS分析CLA酯化率59.6％，其中9c，11t-CLA酯化率96.3％，10t，12c-CLA酯化率42.1％。
实施例4：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入3.45g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和160ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.5。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.012∶180。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在60℃恒温水浴中搅拌晶化24h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.68g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.1mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为10mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为250mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase TypeVII，活力自测为7030U/g)中，在45℃水浴中振荡10h进行物理吸附后，加入10ml，2.5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量265.5mg)交联2h，经12000r/min离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.35g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.22g(4.70mmol)无水乙醇加入装有2ml异辛烷和50mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(50.2U)的反应器中，在恒温45℃水浴，150r/min振荡，反应10h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.41g。GC-MS分析CLA酯化率66.5％，其中9c，11t-CLA酯化率98.7％，10t，12c-CLA酯化率50.6％。
实施例5：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入4.65g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和103ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.8。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.0162∶115。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在50℃恒温水浴中搅拌晶化20h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.86g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.025mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为12mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为300mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase TypeVII，活力自测为7030U/g)中，在40℃水浴中振荡8h进行物理吸附后，加入5ml，1.25wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量66.4mg)交联3h，经离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.34g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.27g(5.88mmol)无水乙醇加入装有2ml异辛烷和50mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(56.4U)的反应器中，在恒温40℃水浴，120r/min振荡，反应8h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.44g。GC-MS分析CLA酯化率72.3％，其中9c，11t-CLA酯化率97.4％，10t，12c-CLA酯化率56.3％。
实施例6：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入4.65g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和205ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.5。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.0162∶230。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在60℃恒温水浴中搅拌晶化24h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.48g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.12mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为14mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量为350mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase TypeVII，活力自测为7030U/g)中，在45℃水浴中振荡10h进行物理吸附后，加入8ml，1.25wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量106.2mg)交联2h，经12000r/min离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.37g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.22g(4.70mmol)无水乙醇加入装有2ml庚烷和100mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(116.0U)的反应器中，在恒温45℃水浴，150r/min振荡，反应10h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.43g。GC-MS分析CLA酯化率78.5％，其中9c，11t-CLA酯化率93.6％，10t，12c-CLA酯化率67.1％。
实施例7：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入5.17g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和103ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.3。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.018∶115。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在60℃恒温水浴中搅拌晶化20h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.84g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为15mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量375mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase Type VII，活力自测为7030U/g)中，在45℃水浴中振荡10h进行物理吸附后，加入10ml，0.5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量51.3mg)交联2h，经离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.36g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.27g(5.88mmol)无水乙醇加入装有4ml异辛烷和100mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(136.2U)的反应器中，在恒温45℃水浴，150r/min振荡，反应10h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.48g。GC-MS分析CLA酯化率84.5％，其中9c，11t-CLA酯化率90.5％，10t，12c-CLA酯化率74.3％。
实施例8：
在室温和强力搅拌下，将11g水玻璃(27wt.％SiO2，14wt.％NaOH)逐滴加入5.17g非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和205ml去离子水的混合液中，用醋酸调节反应液的pH为6.8。水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物与去离子水的物质的量之比为1∶0.018∶230。水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1h，在70℃恒温水浴中搅拌晶化24h后，离心、固相经去离子水洗涤、室温干燥24h，100℃烘箱干燥12h，即得到固定化脂肪酶的载体2.64g。
取0.4g上述载体，加入到25ml用0.025mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液配制的浓度为16mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液(含酶质量400mg，褶皱假丝酵母脂肪酶购于Sigma-Aldrich公司，Candida rugosa lipase TypeVII，活力自测为7030U/g)中，在50℃水浴中振荡12h进行物理吸附后，加入5ml，0.5wt.％的戊二醛溶液(含戊二醛质量26.6mg)交联3h，经离心分离，沉淀用上述同样的磷酸缓冲液洗涤三次，于30℃烘干，即得到固定化褶皱假丝酵母脂肪酶0.36g。
将0.66g(2.35mmol)共轭亚油酸、0.22g(4.70mmol)无水乙醇加入装有5ml异辛烷和150mg固定化褶皱假丝酵母脂肪酶(196.5U)的反应器中，在恒温50℃水浴，130r/min振荡，反应12h，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯0.52g。GC-MS分析CLA酯化率89.5％，其中9c，11t-CLA酯化率83.7％，10t，12c-CLA酯化率83.1％。
Claims (5)
1.一种溶剂相中固定化脂肪酶催化合成共轭亚油酸乙酯的方法，其特征在于所述的方法按照如下步骤进行：
(1)固定化脂肪酶的载体的制备：在室温和强力搅拌下，将水玻璃滴加入到非离子型三嵌段共聚物EO20PO70EO20和去离子水的混合液中，同时用醋酸调节反应液的pH为5～7；水玻璃滴加完后，密封，室温继续搅拌1～5h，在30～90℃温度下搅拌晶化20～24h后，反应液过滤或离心分离出固相，经洗涤、室温干燥8～24h，再于80～100℃干燥8～24h，即得所述的固定化脂肪酶的载体；所述水玻璃中二氧化硅、三嵌段共聚物EO20PO70EO20与去离子水的物质的量之比为1∶0.008～0.018∶110～230；
(2)固定化脂肪酶的制备：取褶皱假丝酵母脂肪酶，以pH值6.0～7.5的磷酸缓冲溶液为溶剂，配制得到浓度为0.4～16mg/ml的褶皱假丝酵母脂肪酶溶液，将所述步骤(1)中制得的固定化脂肪酶的载体加入到所述褶皱假丝酵母脂肪酶溶液中，在30～60℃温度下，振荡6～12h后，加入浓度为0.25～7.5wt.％的戊二醛溶液交联2～4h后，离心，沉淀用pH值为6.0～7.5的磷酸缓冲溶液洗涤、干燥得到所述的固定化脂肪酶；所述褶皱假丝酵母脂肪酶与固定化脂肪酶的载体的质量比为200～1000mg/g；
(3)共轭亚油酸乙酯的合成：共轭亚油酸、无水乙醇、有机溶剂和步骤(2)制得的固定化脂肪酶在30～60℃温度下以120～200r/min的速度振荡反应6～20h后，反应液过滤，滤液经减压蒸馏得到共轭亚油酸乙酯；所述共轭亚油酸和无水乙醇的物质的量之比为1∶1～3；所述固定化脂肪酶与共轭亚油酸的质量之比为1∶2～33；所述有机溶剂为异辛烷或庚烷。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中戊二醛溶液中溶质戊二醛与褶皱假丝酵母脂肪酶的质量之比为0.03～3.32∶1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中有机溶剂与共轭亚油酸的物质的量之比为5～13∶1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，pH值6.0～7.5的磷酸缓冲溶液的浓度为0.02～0.2mol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)所述的褶皱假丝酵母脂肪酶的活力在5000U/g以上。
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