CN102559546B - 复合微生物发酵剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合微生物发酵剂，所述复合微生物发酵剂由黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌CGMCC No.4430和植物乳杆菌组成。通过向青储原料中加入此发酵剂，在好氧、厌氧条件下，微生物快速生长，分泌大量的纤维素酶来分解纤维素，蛋白酶分解蛋白产生游离氨基酸，同时产生大量代谢产物乳酸等。处理后的青储饲料pH值降低，基本无杂菌生长，是一种营养价值高、易消化的家畜用青储饲料。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料添加剂领域中的菌种及其混合菌发酵剂。
背景技术：
我国的秸秆资源十分丰富，年产量可达到5.79亿吨。其中，玉米、小麦、和稻草秸秆三大作物秸秆产量达到了4.39亿吨，占整个秸秆产量的75.88％。目前，随着畜牧业的快速发展，加剧了畜牧业对粮食的依赖性，但秸秆用作饲料数量较少，即使用作饲料也因加工利用不当，使得秸秆的利用率及饲料报酬率低。农作物秸秆营养价值低、适口性差、消化率低。如果对其进行合理的加工调剂，可用于饲喂家畜。据报道，秸秆经青贮、氨化等方法调治后，每6kg青贮秸秆或4kg氨化秸秆相当于1kg玉米饲料的营养价值。因此，采用科学的方法对秸秆进行加工调剂，广泛用于畜牧业，具有良好的生态效益社会效益和经济效益。
近年来在我国推广的氨化饲料，不仅成本高、能耗高，并且存在与农业争肥、污染环境，有些方法对于牲畜还有毒副作用。而饲料清楚技术的研究与应用已有上百年的历史，目前关键的技术在于微生物优良菌株的选育、复合菌种的有效复配和发酵工艺的优化。
在这些方面，国内外学者均进行了大量的研究工作，但对于综合解决清楚饲料发酵过程中抑制腐败菌、防治二次发酵，有效控制有机酸和降解木质纤维素，降低成本，便于使用等方面仍然存在问题。
发明内容：
针对目前存在的问题，本发明的目的在于提供一种青储饲料用微生物发酵剂。
本发明生产用复合微生物发酵剂黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌CGMCC4430和植物乳杆菌组成。
复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下：鼠李糖乳杆菌为(0.1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～50)*108个/克。
将发酵制得黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌粉、植物乳杆菌粉以质量比例为1∶(0.5-2)∶(0.5-2)混合，以干重计。
1)黑曲霉孢子的制备工艺为：
A.斜面培养方法
试管，121℃，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
B.K式培养瓶孢子
取10°Brix麦芽汁加入2％琼脂，装入500mL K式培养瓶，121℃，20min灭菌后，铺斜面冷却。接入孢子悬浮液1mL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱，30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
C.固态放大培养
将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1.0×108个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10°Brix麦芽汁60L)，充分混匀后放入浅盘，在121℃下灭菌1小时。待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30℃，湿度80-90％，每隔10小时翻料一次，培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养
干燥粉碎：发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60℃，待物料水分含量将低于10％以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。
2)鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌菌粉的制备工艺为：
植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌粉状菌粉生产步骤如下：将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。最终菌粉产品中各菌种活细胞数量范围如下：鼠李糖乳杆菌为(0.1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～50)*108个/克。
鼠李糖乳杆菌所用培养基如下：斜面培养基(g/L)：20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10牛肉膏，5NaCl，10乙酸钠，2柠檬酸铵，0.2MgSO4·7H2O，0.05MnSO4·7H2O，15琼脂，pH 6.5。
发酵培养基(g/L)：40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0.01NaCl，0.5乙酸钠，0.2柠檬酸铵，0.2KH2PO4，0.2MgSO4·7H2O，0.05MnSO4·7H2O)，pH 6.5。
本发明中各种菌种组成比例也是经过精心试验研究得到，上述菌种的选择和配比保障了产品的良好质量。
复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。
复合菌粉中各菌种活细胞数量较好范围如下：鼠李糖乳杆菌为(1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.1～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～30)*108个/克。
鼠李糖乳杆菌菌粉的具体生产方法已有较多报道，报道文章有黄良昌的硕士学位论文“真空冷冻干燥法生产干酸奶发酵剂工艺的研究”(2002年)，刘宇峰等在中国乳品工业杂志发表的“直接使用型酸奶发酵剂的研制”发表于1995年第5期。
本发明采用的菌种如下：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.4430菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为杆状，宽度小于1μm，2到3个杆菌易于连成连接在一起；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。出发菌株鼠李糖乳杆菌CGMCC No.1.2134购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育：原始出发菌种→试管活化→高温驯化→硫酸二乙酯(DES)诱变→高糖平板筛选→亚硝基胍(NTG)诱变筛选→高温菌筛选→摇瓶复筛→传代稳定性试验→5L发酵罐试验。将目的菌株CGMCC No.4430做5L乳酸发酵罐实验，结果表明：与出发菌株相比，CGMCC No.4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了95％；发酵结束后，乳酸含量为60g/L，与原始菌相比提高了158％。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.4430保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.3.5269、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumCGMCC.No.1.2158)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏日期2010年12月8日。
微生物青储混合菌发酵剂制作青储饲料的工艺：
3)原料准备：精选无腐烂的稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物，铡至2～5cm长。
4)菌种活化：将复合微生物发酵剂倒入1～2°Brix麦芽汁中，混合均匀，25℃～35℃下经2～3小时即活化好。原料(稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物)的水含量应控制在70％～80％，复合微生物发酵剂用量为青储饲料原料的0.1-5％；
5)接种装料：原料分层堆积，堆积20～30cm厚时，喷洒一遍菌液。堆积总高不应超过2米。
6)好氧培养：空气中放置5～30天，春、秋两季应适当延长时间为20～30天；夏天放置5～10天。
7)厌氧培养：用塑料薄膜密封，20～90天后可以供牲畜食用，春、秋两季时间为60～90天。夏天20～30天。
复合微生物发酵剂用量为青储饲料原料的0.1-1％；
有益效果：
黑曲霉、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌组成高活性复合微生物发酵剂。复合微生物发酵剂使用时，将青储饲料发酵分为好氧和厌氧两个阶段。这样在好氧阶段促进了菌体的快速生长，厌氧阶段利于代谢物的快速积累，本发明有效的解决了青储饲料发酵中的技术难题，使用简单，便于农民大规模使用。
具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中利用复合微生物发酵剂。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
1)黑曲霉孢子的制备工艺为：
A.斜面培养方法
试管，121℃，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
B.K式培养瓶孢子
取1O°Brix麦芽汁加入2％琼脂，装入500mL K式培养瓶，121℃，20min灭菌后，铺斜面冷却。接入孢子悬浮液1mL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱，30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
C.固态放大培养
将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1.0×108个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10°Brix麦芽汁60L)，充分混匀后放入浅盘，在121℃下灭菌1小时。待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30℃，湿度80-90％，每隔10小时翻料一次，培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养
干燥粉碎：发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60℃，待物料水分含量将低于10％以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。
鼠李糖乳杆菌CGMCC4430和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CGMCC.No.1.2158)菌粉的制备工艺为：植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌粉状菌粉生产步骤如下：将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，上述方法制得鼠李糖乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～6.0)*(1010)个/克，植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～6.0)109个/克，复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。最终菌粉产品中各菌种活细胞数量范围如下：鼠李糖乳杆菌为(0.1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～50)*108个/克。
鼠李糖乳杆菌所用培养基如下：斜面培养基(g/L)：20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10牛肉膏，5NaCl，10乙酸钠，2柠檬酸铵，0.2MgSO4·7H2O，0.05MnSO4·7H2O，15琼脂，pH 6.5。
发酵培养基(g/L)：40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0.01NaCl，0.5乙酸钠，0.2柠檬酸铵，0.2KH2PO4，0.2MgSO4·7H2O，0.05MnSO4·7H2O)，pH 6.5。
实施例1：
将发酵制的100g黑曲霉孢子、100g鼠李糖乳杆菌和100g植物乳杆菌混合组成，鼠李糖乳杆菌为30.0*109个/克，植物乳杆菌数量为5*109个/克，黑曲霉孢子数量为20*108个/克。
Claims (4)
1.一种复合微生物发酵剂，所述复合微生物发酵剂由黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌CGMCCNO.4430和植物乳杆菌组成。
2.如权利要求1所述的一种复合微生物发酵剂，其特征在于所述复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下：鼠李糖乳杆菌为(0.1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～50)*108个/克。
3.如权利要求2所述的一种复合微生物发酵剂，其特征在于所述复合微生物发酵剂中鼠李糖乳杆菌为(1～60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.1～6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～30)*108个/克。
4.如权利要求3所述的一种复合微生物发酵剂，其特征在于所述复合微生物发酵剂中鼠李糖乳杆菌为30.0*109个/克，植物乳杆菌数量为5*109个/克，黑曲霉孢子数量为20*108个/克。
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