CN102558330B

CN102558330B - 一种人中期因子抑制肽及其应用

Info

Publication number: CN102558330B
Application number: CN201010620365.6A
Authority: CN
Inventors: 戴利成; 姚行; 黄惠莲
Original assignee: Huzhou Central Hospital
Current assignee: Huzhou Central Hospital
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102558330A

Abstract

本发明提供一种具有抗血管新生作用的，其氨基酸序列为：GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQ。本发明申请提供了特异性抑制细胞内中期因子和颗粒蛋白前体相互作用的抑制肽，以及该肽在治疗和预防肿瘤血管新生中的作用，为制备特异性抑制由中期因子引起的肿瘤血管新生药物提供了基础。

Description

一种人中期因子抑制肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术的分子生物学和生物化学领域，具体涉及一种具有抗血管新生作用的人中期因子的抑制肽以及该抑制肽在治疗和预防肿瘤方面的应用。

背景技术

中期因子(midkine，MK)是1988年由日本学者在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系中发现的肝素亲和生长因子，分子量约为13kD，是一个低分子量的蛋白质。中期因子大量表达于妊娠中期并在妊娠发展中起着重要的作用。在成人，中期因子被限制在一定的组织中表达。然而，在肿瘤发生，炎症和组织细胞修复的过程中，中期因子的表达明显增强。中期因子能促进细胞存活和细胞迁移，并与肿瘤的侵袭、炎症疾病的发生及受损细胞的保护和修复密切相关，中期因子也被期待成为一种阻止细胞凋亡的治疗手段。与此同时，中期因子已成为恶性肿瘤和炎性疾病治疗中颇具前景的分子靶点并已成为一种新的肿瘤标记物。

中期因子能调节细胞生长、存活和分化，在许多不同类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肺癌、甲状腺、乳腺、膀胱、子宫、卵巢、前列腺和肝癌、神经细胞瘤、恶性胶质瘤，阳性表达率介于45％-90％之间，中期因子在正常组织中不表达或低表达。中期因子在肿瘤早期、潜伏期和癌前病变阶段也呈高水平表达。这表明，中期因子在许多类型的肿瘤发生和生物学行为中起重要作用，已经有研究证实中期因子在肿瘤发生中的作用，在体内中期因子促进肿瘤细胞的生长，这种生长与肿瘤血管密度的增加有关，同时证实了中期因子有促进肿瘤血管生成的作用。另外有研究证实人口腔癌中中期因子的表达与肿瘤血管生成也相关。

血管生成(angiogenesis)是指在原有血管的基础上，内皮细胞以发芽的模式形成新血管的过程。血管生成时在促血管生成因子的作用下，血管内皮细胞从静止状态变成具有迁移能力的顶细胞，同时激活间质金属蛋白酶降解血管外基质，帮助顶细胞向周围扩增和迁移形成柱状丝状伪足，并逐步形成血管腔。最后，周细胞和血管平滑肌细胞等支持细胞环绕在内皮细胞周围形成完整的新生血管。血管新生是一个复杂的过程，主要包括内皮细胞增殖、迁移、侵袭、成管等几个关键步骤。

1971年，哈佛大学医学院JudahFolkman首次提出“肿瘤的生长和转移依赖于血管生成”的假说，并于1973年提出肿瘤血管生成因子(TAF)概念，此后，陆续发现了多种血管生成因子。研究发现，与肿瘤血管生成相关的因子有30余种。肿瘤生长具有明确的血管依赖性，肿瘤通过新生血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力。Hanahan等提出的“血管生成的开关假设”认为，肿瘤血管形成过程受到开关的调节，当血管形成因子的浓度上升或抑制因子浓度下降，血管生成开关处于开放状态，新生血管大量形成，肿瘤则持续生长。肿瘤在没有养分的供应下，只能长到2-3立方毫米。如果没有新生血管长入，肿瘤就将保持休眠状态甚至退化。足够的血管形成以提供充足的营养及氧供是肿瘤生长的必要条件，因此，肿瘤的生长与转移依赖于血管新生。

既然恶性肿瘤的生长转移均依赖于肿瘤的血管生成，以肿瘤血管为靶点、抑制其生成或破坏其存在，从而阻断了肿瘤的生长或转移的营养通道的抗血管生成治疗正逐渐成为探索肿瘤治疗的又一亮点。而中期因子在肿瘤组织中的过度表达促进了肿瘤血管的形成，促进了肿瘤的生长和浸润。因此，中期因子有望成为一种新的肿瘤标志物及肿瘤生物治疗的新靶点，而且可能成为判断患者预后的新指标，对复发性肿瘤中中期因子的表达目前尚未见报道，可能将是今后研究的方向之一。

颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)是近年来发现的一个独立的生长因子，具有广泛的生理功能。大部分上皮组织来源的肿瘤细胞(如卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、肾上腺皮质瘤细胞和前列腺癌细胞等)都高表达颗粒蛋白前体蛋白。在对卵巢癌的研究中，已经发现通过激光捕获显微切割技术，在侵袭性卵巢癌组织中，肿瘤细胞和基质细胞都表达颗粒蛋白前体，而在非侵袭性的卵巢癌组织中，只有基质细胞表达颗粒蛋白前体。一部分其他来源的肿瘤细胞也高表达颗粒蛋白前体蛋白，如神经胶质细胞瘤，多发性骨髓瘤和子宫平滑肌肉瘤等。最近又研究表明，子宫平滑肌肉瘤细胞高表达颗粒蛋白前体蛋白，表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。因此，颗粒蛋白前体在调节肿瘤细胞生长、增强细胞侵袭能力和促进肿瘤组织血管新生等方面均发挥重要作用，提示颗粒蛋白前体可能是肿瘤治疗的良好靶标。

我们的研究发现，在肝癌组织中，中期因子和颗粒蛋白能够相互作用，并对内皮细胞的增殖，迁移和管腔形成具有显著促进的作用，在体外血管形成的实验中，我们发现，中期因子和颗粒蛋白相互作用可以促进血管新生。因此，中期因子和颗粒蛋白的相互作用位点，可能成为抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤生长的良好靶点，可能成为一个新的抗肿瘤血管新生的良好药物。

发明内容

本发明申请的目的在于提供有效种抑制肿瘤的抑制肽及其活性片段，特别是生长中期因子与颗粒蛋白相互作用引起的肿瘤血管新生。

为实现上述发明目的，采用如下技术方案：

一种人中期因子抑制肽，该抑制肽以中期因子基因与颗粒蛋白相互作用位点为靶标，特征在于所述抑制肽的氨基酸序列为：GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQ。该抑制肽是人颗粒蛋白前体基因(Pgrn)来源的含有56个氨基酸的肽片段，分子量约为10kD，命名为GrnG(GranulinG)。该抑制肽片段是采用常规的人工合成纯化的方法制备得到的。

本发明的第二个方面，提供编码这些抑制肽的多核苷酸片段，序列为：3’-GGCCCCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACTTCCAGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCACGGGGCTTCCACTGCA-GTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAA-5’。

本发明的第四个方面，本发明的抑制肽可以治疗和/或预防肿瘤血管新生。

如本发明所用，“新的抗血管新生抑制肽”是指抗血管新生抑制肽中基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。

本发明提供了一种新的抑制肽——抗血管新生抑制肽。本发明的抑制肽是使用重组技术从原核宿主中产生。

附图说明

图1为GrnG合成纯化SDS-PAGE电泳结果。第1泳道为蛋白Marker，第2泳道为纯化后的GrnG蛋白。

图2为GrnG抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖。

图3为GrnG抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移。A为0小时倒置显微镜下观察细胞生长状态；B-H为12小时细胞划痕状态，其中B为空白对照，C为VEGF10ng/ml，D为MK+PGRN各100ng/ml，E为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，F为GrnG100ng/ml，G为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，H为GrnG200ng/ml。统计分析柱状图为各组定量分析后，与空白对照组相比得出的细胞迁移率，其中将对照设为100％的迁移率来计算。

图4为GrnG抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Transwell小室中的迁移。A-G为24小时后倒置显微镜下观察细胞迁移的状态，其中A为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，B为GrnG100ng/ml，C为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，D为GrnG200ng/ml，E为VEGF10ng/ml，F为MK+PGRN各100ng/ml，G为空白对照。统计分析柱状图为各组定量分析后，与空白对照组相比得出的细胞迁移率，其中将对照设为l00％的迁移率来计算。

图5为GrnG抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成。A-G为24小时后在倒置显微镜下观察的细胞管腔形成状态，其中A为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，B为GrnG100ng/ml，C为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，D为GrnG200ng/ml，E为VEGF10ng/ml，F为MK+PGRN各100ng/ml，G为空白对照。

图6为GrnG抑制鸡胚绒毛膜血管新生。A-G为24小时后在倒置显微镜下观察的鸡胚绒毛膜新生血管状态，其中A为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，B为GrnG100ng/ml，C为MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，D为GrnG200ng/ml，E为VEGF10ng/ml，F为MK+PGRN各100ng/ml，G为空白对照。

图中，均以p＜0.05表示有显著差异，*，p＜0.05，**，p＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：GrnG人工合成及纯化

目的和原理：大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生成的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚，培养操作简单，转化和转导效率高，生长繁殖快，成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统。pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统，它是最初由Studier等利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，可以从各种基因(包括原核、真核细胞)生长大量的目的蛋白。

方法：将人颗粒蛋白前体基因的第174-339个核苷酸序列克隆入pET28a+表达体系，构建好GrnG-pET28a+载体，将该载体转化入大肠杆菌BL21中，挑选出阳性克隆，将一个阳性克隆接种到1000mlLB培养基中，37℃，200rpm振摇培养至OD0.6，加入0.5mM的IPTG诱导剂诱导表达，37℃，200rpm振摇继续培养8小时。1000rpm离心5分钟收集菌体。用10ml细菌裂解液裂解菌体，超声条件为：功率400W，工作时间3S，间隙时间6S，工作次数200次。电泳鉴定：SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白主要表达于包涵体。用WashingBuffer洗涤包涵体，将BindingBuffer平衡镍柱至基线平稳；再用BindingBuffer稀释的样品上柱，继续平衡至基线平稳；然后加入ElutingBuffer洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测浓度和纯度。最后，将上柱纯化后的包涵体用复性缓冲液复性，将复性后的蛋白用PBS透析并浓缩，BCA定量。

结果评价：通过大肠杆菌表达体系，表达、纯化得到了纯度＞95％的GrnG蛋白。

实施例2：GrnG抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖

目的和原理：人脐静脉内皮细胞增殖实验采用MTTAssay。MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的多少可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。

方法：用0.025％的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，用含2％胎牛血清及各种生长因子的M200培养液配成单个细胞悬液，以每孔5x10³个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100ul。将培养板放入CO2细胞培养箱，在37度、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜后，换成无血清培养液饥饿培养24小时。24小时后，对细胞进行分别进行处理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，GrnG100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGF10ng/ml以及无血清培养液的空白处理对照组。每个处理组做三个复孔，在CO2培养箱中孵育48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10ul，在37度细胞培养箱中继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。

结果与评价：与MK+PGRN实验处理组和实验空白对照组相比，GrnG处理以后，人脐静脉内皮细胞增殖能力受到抑制，说明GrnG不仅可以抑制MK+PGRN对人脐静脉内皮细胞的增殖作用，而且对人脐静脉内皮细胞本身的增殖作用也具有抑制作用。

实施例3：GrnG抑制人脐静脉内皮细胞的迁移

目的和原理：在细胞生长因子MK和PGRN的作用下，人脐静脉内皮细胞可以向没有细胞的划痕区域迁移，通过观察迁入划痕区的内皮细胞量，来评价GrnG是否有具有抑制人脐静脉内皮细胞迁移的能力。

方法：用0.025％的胰蛋白酶消化单层培养的人脐静脉内皮细胞，用含2％胎牛血清及各种生长因子的M200培养液配成单个细胞悬液，以每孔1x10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100ul。将培养板放入CO2细胞培养箱，在37度、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜后，换成无血清培养液饥饿培养24小时。24小时后，用Tip头划一个一字形划痕，用PBS洗净划下的细胞，对细胞分别进行处理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，GrnG100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGF10ng/ml以及无血清培养液的空白处理对照组。每个处理组做六个复孔，在CO2培养箱中孵育6小时后，每隔3个小时在Leica倒置显微镜下观察细胞迁移情况，拍照后用软件对细胞进行统计分析。

结果评价：通过统计分析，结果显示与MK+PGRN实验处理组和实验空白对照组相比，GrnG处理以后，人脐静脉内皮细胞迁移能力受到抑制，说明GrnG不仅可以抑制MK+PGRN对人脐静脉内皮细胞的迁移作用，而且对人脐静脉内皮细胞本身的迁移作用也具有抑制作用。

实施例4：GrnG抑制肽抑制人脐静脉内皮细胞Transwell小室迁移

目的和原理：QCM^TM24-WellColorimetricCellMigrationAssayKit(CHEMICON)是一个快速高效的检测细胞迁移的试剂盒，该试剂盒利用8um孔径的膜，可以使几乎所有的细胞通过，细胞穿过膜以后，将这部分迁移到膜底面的细胞染色观察，并通过裂解后检测吸光值来分析和比较迁移能力。

方法：人脐静脉内皮细胞培养于用含2％胎牛血清及各种生长因子的M200培养液中，按照QCM^TM24-WellColorimetricCellMigrationAssayKit(CHEMICON)试剂盒的说明书要求进行操作。首先将细胞用0.025％胰蛋白酶消化单层人脐静脉内皮细胞，用无血清培养液配成单个细胞悬液，按5x10⁴个细胞/ml接种于小室中，对细胞分别进行处理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，GrnG100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGF10ng/ml以及无血清培养液的空白处理对照组。24小时后，对细胞进行染色，在普通Leica倒置显微镜下观察细胞迁移情况。并通过裂解穿过小室的细胞，在560nm下测定吸光值，对其进行定量。

结果与评价：通过统计分析，结果显示与MK+PGRN实验处理组和实验空白对照组相比，GrnG处理以后，人脐静脉内皮细胞迁移能力受到抑制，说明GrnG不仅可以抑制MK+PGRN对人脐静脉内皮细胞的迁移作用，而且对人脐静脉内皮细胞本身的迁移作用也具有抑制作用。

实施例5：GrnG抑制人脐静脉内皮细胞成管

目的和原理：FibrinGelInVitroAngiogenesisAssayKit(CHEMICON)是一个在96孔板中检测内皮细胞管腔形成的操作方便的试剂盒。该试剂盒将细胞培养于Fibrin胶上，内皮细胞可以在胶内迅速的排列形成网状结构。Fibrin胶是通过酶解Fibrinogen而形成的，酶解后的Fibrin可以形成半透明的，规则的，高分子矩阵，该试剂盒提供了一个合适的条件来利于内皮细胞的成管。

方法：人脐静脉内皮细胞培养于用含2％胎牛血清及各种生长因子的M200培养液中，按照FibrinGelInVitroAngiogenesisAssayKit(CHEMICON)试剂盒的说明书要求进行操作。首先，将Thrombin液和Fibrinogen液溶解，将30ulFibrinogen液加到96孔板中，轻轻地晃动使溶液完全覆盖底面。然后，将20ulThrombin液加到96孔板中，马上轻轻晃动，是两者充分混匀，在37度孵育60分钟。培养的人脐静脉内皮细胞用0.025％的胰酶消化，用无血清培养液配成终浓度为5x10⁴个细胞/ml的细胞悬液。将细胞加到经Fibrinogen处理后的96孔板中，并对细胞进行处理，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，GrnG100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGF10ng/ml以及无血清培养液的空白处理对照组。24小时后，在普通Leica倒置显微镜下观察细胞成管情况。

结果与评价：内皮细胞在Fibringel中生长12-18h后，单个细胞在Fibringel中延伸，形成三维网状结构。结果显示与MK+PGRN实验处理组和实验空白对照组相比，GrnG处理以后，内皮成管过程受到影响，三维网络结构受到破坏，说明GrnG不仅可以抑制MK+PGRN对人脐静脉内皮细胞的人微血管内皮细胞微管形成，而且对人脐静脉内皮细胞本身的人微血管内皮细胞微管形成也具有抑制作用。

实施例6：GrnG抑制鸡胚绒毛膜新生血管形成

目的和原理：鸡胚绒毛膜模型是一个理想的血管发生模型，在鸡胚培养的第5天，由于小血管尚未完全发育，便于定性或半定量的检测样品对新生血管生长的影响。

方法：将受精的鸡胚置于孵化箱中孵化5天，在超净工作台中，用酒精擦拭表面，在鸡胚卵壳钝端用镊子开一个小口，通过开出的小孔观察胚胎所在的位置，在血管稀疏的地方撕开气室膜，用灭菌透明胶带封口，放入孵育箱中继续孵育。孵育24小时后，将各处理组加到无菌明胶海绵上，包括MK+PGRN各100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG100ng/ml，GrnG100ng/ml，MK+PGRN各100ng/ml+GrnG200ng/ml，GrnG200ng/ml，VEGF10ng/ml以及无血清培养液的空白处理对照组。将明胶海绵加在绒毛膜上无血管区，用灭菌透明胶带封口，放入孵育箱中继续孵育。两天后，揭去透明胶带，在OLYMPUS体式显微镜下拍照，观察各处理组的血管新生情况。

结果与评价：通过观察分析，结果显示与MK+PGRN实验处理组和实验空白对照组相比，GrnG处理以后，鸡胚绒毛膜的新生血管受到抑制，说明GrnG不仅可以抑制MK+PGRN对鸡胚绒毛膜的新生血管具有抑制作用，而且对鸡胚绒毛膜本身的新生血管也具有抑制作用。

SEQUENCELISTING

<110>湖州中心医院

湖州市中心医院

<120>一种人中期因子抑制肽及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>56

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

GlyProCysGlnValAspAlaHisCysSerAlaGlyHisSerCysIle

151015

PheThrValSerGlyThrSerSerCysCysProPheProGluAlaVal

202530

AlaCysGlyAspGlyHisHisCysCysProArgGlyPheHisCysSer

354045

AlaAspGlyArgSerCysPheGln

5055

<210>2

<211>168

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggcccctgccaggttgatgcccactgctctgccggccactcctgcatctttaccgtctca60

gggacttccagttgctgccccttcccagaggccgtggcatgcggggatggccatcactgc120

tgcccacggggcttccactgcagtgcagacgggcgatcctgcttccaa168

Claims

1.一种人中期因子抑制肽，该抑制肽以中期因子基因与颗粒蛋白的相互作用位点为靶标，其特征在于所述抑制肽的氨基酸序列为：GPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQ。

2.一种人中期因子抑制肽，其特征在于编码这些抑制肽的多核苷酸片段序列为：3’-GGCCCCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACTTCCAGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCACGGGGCTTCCACTGCAGTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAA-5’。