CN102550799B

CN102550799B - 一种从发酵液中快速提取食用抗菌肽的方法

Info

Publication number: CN102550799B
Application number: CN 201210019936
Authority: CN
Inventors: 贾英民; 李兴峰; 王志新; 董新颖; 段世佳; 田丰伟; 陈卫
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-21
Filing date: 2012-01-21
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-01-21
Also published as: CN102550799A

Abstract

本发明提供了一种从发酵液中快速分离制备食用防腐剂的方法，采用杀菌释放抗菌肽、活性炭吸附、乙醇解吸附、减压浓缩、喷雾干燥以及吸附剂再生和解吸附剂重复利用的技术手段，从微生物的发酵液中快速提取抗菌肽，获得食用生物防腐剂。本发明分别利用廉价的活性炭和乙醇作为吸附剂和解吸附剂，从微生物的发酵液中快速提取抗菌肽，在获得高回收率、高纯度抗菌肽产品的同时实现吸附剂和解吸剂的循环利用，该方法工艺简单、成本低廉、快速省时、环境友好，制备出安全、稳定的抗菌肽产品，可用于食品保藏和饲料防腐，为实现微生物抗菌肽的大规模制备提供了一种新方法。

Description

一种从发酵液中快速提取食用抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及微生物抗菌肽的快速分离制备方法，尤其是涉及一种利用活性炭和乙醇分别作为吸附剂和解吸附剂从微生物的发酵液中提取抗菌肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多数具有安全性高、抗菌谱广、热稳定性高的特点。近年来，微生物来源的抗菌肽受到人们的极大关注，特别是乳酸菌、芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌肽对食源性的致病菌和腐败菌有高效的抗菌活性，可以被人体消化道蛋白酶分解，是对人体无毒的天然生物防腐剂，已广泛应用于食品和饲料工业。

低成本的大规模提取方法是实现抗菌肽工业化生产的关键，也是目前制约抗菌肽市场竞争力的主要因素。从发酵液中提取抗菌肽的传统方法有硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀和真空浓缩等手段，如细菌素提取的第一步普遍使用硫酸铵沉淀，但是这些传统方法通常存在回收率低、时间长、污染大等缺点，很难实现大规模制备。因此，自1944年在乳酸乳球菌的发酵液中发现乳酸链菌肽(Nisin)以来，人们一直努力寻找从微生物发酵液中提取抗菌肽的可行方法。

近年来，国内外的研究者们积极探索用吸附剂吸附提取抗菌肽的方法进行抗菌肽的大规模制备。1992年，美国怀俄明大学Yang等人报道了一种简便的细菌素分离纯化方法，该方法先将发酵液pH调至5.5，部分抗菌肽吸附到菌体细胞上，然后降低pH使抗菌肽从菌体细胞上解离。然而，研究者陆续报道仅仅使用菌体本身来进行吸附和解吸，吸附和解吸效率都很低，如乳酸链球菌肽总收率只有10％。1996年，Coventry等人用商品名“Micro-Cel”的硅酸钙抗粘剂从乳酸菌的发酵液中吸附抗菌肽，但是该方法得到的抗菌肽-吸附复合物解吸附非常困难，即使在pH1.0-12.0的范围内都不能将抗菌肽解离下来，只有1％的十二烷基磺酸钠(SDS)可以解吸附。然而，SDS是一种去垢剂，用此法制备的抗菌肽不宜在食品中使用。1998年，Janes等人用硅酸和稻壳灰作为吸附剂从乳酸菌的发酵液中提取并浓缩抗菌肽，同样，使用硅酸作为吸附剂得到的吸附复合物解吸附也非常困难，实际他们采用的技术路线是，浓缩这一步骤是通过冷冻干燥达到的。而冷冻干燥步骤之前是采用了22100g的低温高速离心除菌，其解吸附过程又必须在4℃以下搅拌过夜，该方法的主要缺陷在于：技术要求苛刻，成本较高，不适宜用于大规模的生产。

国内关于抗菌肽的后提取研究工作中，还连栋等人2003年专利报道先将乳酸链球菌肽发酵液高温灭活菌体后用硅藻土等吸附剂进行吸附，然后用聚乙二醇和氯化钠水溶液进行解吸，但该专利没有报道解吸附后如何去除表面活性剂聚乙二醇的方法。庄绪亮等人2006年专利报道了一种解吸并回收乳酸链球菌肽的新方法，它将表面活性剂解吸和纳滤方法相结合，即先调节吸附混合液的pH、装解吸柱、表面活性剂解吸附、然后采用纳滤的方法将溶液中的表面活性剂SDS去除，在去除SDS的同时将含有Nisin的溶液浓缩，浓缩液再采用喷雾干燥方法制成干粉，最终回收生物防腐剂乳酸链球菌肽。

综上所述，当前使用的吸附-解吸附制备方法存在吸附率低或解吸附困难的情况，且没有涉及吸附剂的再生和解吸附的无残留问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用吸附剂和解吸附剂从微生物发酵液中快速分离提取抗菌肽的方法。

针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明人经过长期的研究和实验，创造出本发明的技术方案。

本发明的技术方案为：采用杀菌释放抗菌肽、活性炭吸附、乙醇解吸附、减压浓缩、喷雾干燥以及吸附剂再生和解吸附剂回收的技术路线，从微生物发酵液中快速提取抗菌肽，获得生物防腐剂抗菌肽产品。

本发明提供的一种从微生物发酵液中快速制备食用抗菌肽的方法，包含以下步骤：

1)对发酵液进行处理，使抗菌肽从菌体中释放出来；

2)食品级活性炭吸附；

3)乙醇解吸附，过滤，收集滤液和活性炭滤饼；

4)滤液浓缩；

5)干燥，得到食用抗菌肽。

本发明方法还包括将解吸附后的活性炭滤饼微波辐照下再生，除去活性炭上残留的抗菌肽及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭可循环利用。

所述微波强度为500-700W，辐照时间为10-20min。

其中步骤1)所述的发酵液处理是将发酵液用酸调pH至3-6，121℃加热10-30min，加入2％-3％NaCl，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

步骤2)所述的活性炭吸附是在30-45℃加入发酵液体积1％-5％的食品级活性炭，100-200r/min搅拌5-10min，过滤，弃上清，获得活性炭-抗菌肽的复合物。

所述食品级活性炭粒径为0.05～0.01mm。

所述的过滤是用滤纸进行过滤。

步骤3)所述的乙醇解吸附是将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后用发酵液体积20％-100％的乙醇(浓度为95％-100％)进行解吸附，解吸附条件为30-55℃，搅拌5-10min，过滤收集滤液，并收集活性炭滤饼。

所述步骤4)为将解吸附后过滤的滤液进行浓缩，采用旋转蒸发仪，在40-50℃、浓缩10min。

所述步骤5)为用喷雾干燥的方法将浓缩的解吸附液干燥，喷雾干燥热风进口温度120-180℃，出口温度为70-90℃，干燥前用1-5倍的脱脂乳稀释；或80℃热风干燥30min，得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品。

本发明提供了上述方法制得的抗菌肽。

本发明提供了制得的抗菌肽在制备生物防腐剂中的应用。

在本发明的实施例中，利用本发明的提取抗菌肽的方法从侧芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)发酵液中提取到食用级的抗菌肽。

本发明提供的方法所得到的抗菌肽能够用于制备生物防腐剂。

本发明提供的方法所得到的抗菌肽能够用于制备食品防腐剂。

本发明提供的从发酵液中快速提取抗菌肽的方法克服了现有技术的弊端，达到利用廉价的吸附剂从微生物发酵液中制备抗菌肽，本发明方法活性炭的吸附率达90-100％，用乙醇替代现有技术中不宜在食品中使用的聚乙二醇与有机酸盐或无机酸盐、或者十二烷基磺酸钠，使从吸附剂-抗菌肽复合物中解离抗菌肽，其解吸附率为90-100％；同时浓缩抗菌肽溶液，使得后一步喷雾干燥的收率达90-100％，在获得抗菌肽高回收率的同时实现吸附剂和解吸剂的循环利用，工艺简单、成本低廉、快速省时、绿色环保，制备出安全、稳定的抗菌肽产品，可广泛应用于食品和饲料工业，为抗菌肽的大规模制备提供了一种新方法。

附图说明

图1是本发明制备使用抗菌肽的工艺流程示意图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各原料除特别说明外，均为市售。

实施例1

从侧孢短芽孢杆菌AS1.2739的发酵液中提取抗菌肽，获得食品级抗菌肽产品，步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将侧孢短芽孢杆菌发酵产生的抗菌肽发酵液用酸调pH至3，121℃加热15min，加入质量百分比为2％的NaCl，杀死细菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白，并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中；

(2)活性炭吸附：30℃加入发酵液体积1％的活性炭进行吸附，100r/min搅拌10min，制成活性炭-抗菌肽的复合物；

(3)乙醇解吸附：将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀洗涤蒸馏水两次，然后用发酵液体积20％的无水乙醇作为解吸附剂进行解吸，在30℃保温搅拌10min；使用滤纸进行抽滤，弃上清，获得活性炭-抗菌肽的复合物；

(4)活性炭再生：将解吸附后的滤饼在微波辐照下再生，微波功率为500W，20min，除去活性炭上残留的细菌素及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭再利用；

(5)减压浓缩并回收乙醇：将解吸附后的上清解吸附液，使用旋转蒸发仪，50℃浓缩10min，一方面进一步浓缩抗菌肽，另一方面去除解吸附液中残留的乙醇并回收再利用；

(6)干燥：将解吸附后的上清解吸附液，喷雾干燥方法进行干燥，喷雾干燥前用1倍体积的脱脂乳稀释。热风进口温度120℃，出口温度为70℃，即得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，整个流程中活性炭吸附抗菌肽的吸附率为99％，解吸附剂的解吸附率为95％，喷雾干燥的收率为92％。

实施例2

从侧孢短芽孢杆菌AS1.2738的发酵液中提取抗菌肽，获得食品级抗菌肽产品，具体步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将侧孢短芽孢杆菌发酵产生的抗菌肽发酵液用酸调pH至6，121℃加热30min，加入3％的NaCl，杀死细菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白，并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中；

(2)活性炭吸附：45℃加入发酵液体积5％的活性炭进行吸附，200r/min搅拌5min，制成活性炭-抗菌肽的复合物；

(3)乙醇解吸附：将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀洗涤两次，然后用发酵液体积100％的乙醇(乙醇浓度为95％)作为解吸附剂进行解吸，在55℃保温搅拌5min；

(4)活性炭再生：将解吸附后的滤饼热风干燥，微波辐照下再生，微波功率为700W，10min除去活性炭上残留的细菌素及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭再利用；

(5)减压浓缩并回收乙醇：将解吸附后的上清解吸附液，进行减压浓缩，使用旋转蒸发仪，40℃浓缩10min，一方面进一步浓缩抗菌肽，另一方面去除解吸附液中残留的乙醇并回收再利用；

(6)干燥：将解吸附后的上清解吸附液，在喷雾干燥或热风干燥上进行干燥，喷雾干燥前用5倍的脱脂乳稀释。热风进口温度180℃，出口温度为90℃，即得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，整个流程中活性炭吸附抗菌肽的吸附率为100％，解吸附剂的解吸附率为90％，喷雾干燥的收率为95％。

实施例3

从侧孢短芽孢杆菌AS1.864的发酵液中提取抗菌肽，获得食品级抗菌肽产品，步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将侧孢短芽孢杆菌发酵产生的抗菌肽发酵液用酸调pH至5，121℃加热20min，加入2.5％的NaCl，杀死细菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白，并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中；

(2)活性炭吸附：40℃加入发酵液体积2.5％的活性炭进行吸附，150r/min搅拌8min，制成活性炭-抗菌肽的复合物；

(3)乙醇解吸附：将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀洗涤两次，然后用发酵液体积60％的乙醇(乙醇浓度为95％乙醇)作为解吸附剂进行解吸，在45℃保温搅拌8min；

(4)活性炭再生：将解吸附后的滤饼热风干燥，微波辐照下再生，微波功率600W，15min，除去活性炭上残留的细菌素及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭再利用；

(5)减压浓缩并回收乙醇：将解吸附后的上清解吸附液，进行减压浓缩，使用旋转蒸发仪，45℃浓缩10min，一方面进一步浓缩抗菌肽，另一方面去除解吸附液中残留的乙醇并回收再利用；

(6)干燥：将解吸附后的上清解吸附液，在喷雾干燥或热风干燥上进行干燥，喷雾干燥前用3倍的脱脂乳稀释。热风进口温度150℃，出口温度为80℃，即得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，整个流程中活性炭吸附抗菌肽的吸附率为98％，解吸附剂的解吸附率为100％，喷雾干燥的收率为100％。

实施例4

抗菌肽的确定采用国际公认的“蛋白酶敏感法”，将实施例1-3获得的发酵液按分别进行如下处理：1、10000rpm离心15min去除菌体得到上清液，然后经0.22μm滤膜过滤除确保去除菌体；2、将上清液pH调至6.5以排除有机酸的作用；3、取等量样液，分别与10mg/mL的蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K)溶液1∶1体积混合，在37℃恒温水浴锅中反应2h，反应结束后100℃沸水浴中煮沸5min灭酶；4、分别取蛋白酶处理前后的样品，用琼脂扩散法测定抑菌圈直径，并进行比较。结果表明：发酵液对蛋白酶E和胃蛋白酶敏感，抑菌圈直径分别减小至8.0和14.0mm，特别是经蛋白酶E处理后抑菌活性完全损失，这表明实施例1-3制得的物质为抗菌肽。

实施例5 活性炭重复利用对抗菌肽提取的影响

将实施例3中解吸附后的滤饼在微波辐照微波功率600W，15min下再生，除去活性炭上残留的细菌素及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭再利用。

测定了活性炭重复利用次数对活性炭吸附的影响，结果见表1所示。经过5次重复利用后，采用琼脂扩散法测定抗菌肽的效价。以吸附前发酵液的抗菌肽的效价为100％，减去吸附后发酵液的效价即为吸附率，抗菌肽的吸附率仍然达到80％-98％，这说明本发明方法中，吸附剂活性炭再生，重复利用提取抗菌肽是有效的，至少可以重复利用5次。

表1 活性炭重复利用对抗菌肽提取的影响

实施例6 乙醇重复利用对抗菌肽提取的影响

将实施例3中解吸附后的上清解吸附液，即滤液，进行减压浓缩，一方面进一步浓缩抗菌肽，另一方面对乙醇进行回收再利用(采用旋转蒸发时酒精已自动蒸发至收集瓶中)。测定了乙醇重复利用次数对抗菌肽解吸附的影响，结果见表2所示。经过5次重复利用后，采用琼脂扩散法测定抗菌肽的效价。以解吸附前发酵液抗菌肽的效价为100％，减去解吸附后发酵液的效价百分比即为解吸咐率，乙醇重复利用对抗菌肽的解吸附率仍然达到85％-98％，这说明解吸附剂乙醇回收，充分利用提取抗菌肽是有效的，至少可以重复利用5次。

表2 乙醇重复利用对抗菌肽提取的影响

乙醇重复次数	1	2	3	4	5
						解吸附率(％)	98	95	90	85	85

实施例7

按照说明书所述的工艺流程，本发明获得的食用抗菌肽产品具有较高的抗菌活性，对多种食源性腐败菌和致病菌有显著的抑菌效果。采用琼脂扩散法测定抗菌肽产品的抑菌圈直径，结果如表3所示：通过本发明制备的食用抗菌肽产品具有较高的抗菌活性，不仅能抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌等，而且对革兰氏阴性菌如沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。

表3 食用抗菌肽对食源性微生物的抑菌效果

Claims

1.一种从微生物发酵液中快速提取抗菌肽的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）对发酵液进行处理，使抗菌肽从菌体中释放出来；发酵液处理是将发酵液用酸调pH至3-6，121℃加热15-30min，加入2%-3%NaCl，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中；

2）食品级活性炭吸附；活性炭吸附是在30-45℃加入发酵液体积1％-2.5％的食品级活性炭，100-200r/min搅拌5-10min，过滤，弃上清，制成活性炭-抗菌肽的复合物；

3）乙醇解吸附，过滤，收集滤液和活性炭滤饼；其中，所述的乙醇解吸附是将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后用初始发酵液体积的20%-100%的乙醇进行解吸附，乙醇浓度为95%-100%，解吸附条件为30-55℃，搅拌5-10min，过滤收集滤液，并收集活性炭滤饼；

4）滤液浓缩；

5）干燥，得到食用抗菌肽；干燥为用喷雾干燥的方法将浓缩的解吸附液干燥，喷雾干燥热风进口温度120-180℃，出口温度为70-90℃，干燥前用1-5倍的脱脂乳稀释；得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品；将解吸附后的活性炭滤饼微波辐照下再生，除去活性炭上残留的抗菌肽及杂蛋白、色素等杂质，收集活性炭，并循环利用；微波辐照的微波功率为500-700W，辐照时间为10-20min。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的发酵液处理是将发酵液用酸调pH至3，121℃加热15min，加入2%NaCl，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的发酵液处理是将发酵液用酸调pH至6，121℃加热30min，加入3%NaCl，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的发酵液处理是将发酵液用酸调pH至5，121℃加热20min，加入2.5%NaCl，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤是用滤纸进行抽滤。

6.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤3）的乙醇解吸附是将活性炭-抗菌肽复合物的沉淀用蒸馏水洗涤2次，然后用初始发酵液体积的20%的无水乙醇进行解吸附，解吸附条件为30℃，搅拌10min，过滤收集滤液，并收集活性炭滤饼。

7.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤5）为用喷雾干燥的方法将浓缩的解吸附液干燥，喷雾干燥热风进口温度120℃，出口温度为70℃，干燥前用1倍体积的脱脂乳稀释，得到粉末状的食品或饲料级抗菌肽产品。

8.权利要求1-7任一方法制得的抗菌肽。

9.权利要求8所述的抗菌肽在制备生物防腐剂中的应用。