CN102549163A - 从含木质纤维素的材料制备发酵产物的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于从木质纤维素材料制备发酵产物的工艺，其包括下述步骤：a)任选地预处理；b)任选地洗涤；c)酶促水解；d)发酵；和e)任选地回收发酵产物；其中，在步骤c)中，使用了具有55℃或更高的最适温度的酶组合物，水解时间是40小时或更多并且温度是50℃或更高。

Description

从含木质纤维素的材料制备发酵产物的工艺

技术领域

本发明涉及酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的工艺。

背景技术

木质纤维素植物材料，本文中也称为原料，是糖形式的可再生能源来源，其可被转化为有价值的产物，例如生物燃料(例如生物乙醇)。该工艺期间，通过(半)纤维素分解酶，原料(麦秸、玉米秆、稻壳等)中存在的(木质或半)纤维素被转化为还原糖，接着通过微生物(比如酵母、细菌和真菌)，所述还原糖被转化为有价值的产物例如乙醇。

鉴于(半)纤维素是结晶的并包埋在木质素网中，向还原糖的转化通常是慢的且不完全的。典型地，酶促水解未处理原料产生少于理论量的20％的糖。通过应用化学和热物理预处理，(半)纤维素对(半)-纤维素分解酶而言是更可接近的，因而转化更快并在较高产率下转化。

来自源自预处理的玉米秆的纤维素的典型的乙醇产率是40加仑乙醇/1000kg干玉米秆[1]，或0.3g乙醇/g原料。基于纤维素基的乙醇的最大产率是大约90％。

纤维素分解酶(它们中的大多由下述物种产生：比如Trichoderma、Humicola和Aspergillus)在商业上被用来将预处理的原料转化为含有不可溶的(半)纤维素、其制得的还原糖以及木质素的糊状物(mash)。然后该糊状物被用在发酵中，发酵期间还原糖被转化为酵母生物质(biomass)(细胞)、二氧化碳和乙醇。以这种方式产生的乙醇被称为生物乙醇。

从预处理的木质纤维素原料生产糖的一般工艺中，水解(还被称为液化、预糖化或糖化)典型地在45-50℃的升高的温度下[2]和非灭菌条件下在持续6-168小时[2][4]的工艺期间发生。在该水解期间，存在的纤维素被部分(典型地30-95％，取决于酶活性和水解条件)转化为还原糖。在酶被预处理原料中存在的化合物和被释放的糖抑制的情况下，为最小化热失活，该升温期尽可能地减到最小。

水解后的发酵在单独的厌氧工艺步骤中发生，该工艺步骤在相同或不同容器中，其中温度被调至30-33℃(嗜温工艺)以适应生长和通过微生物生物质(通常为酵母)生产乙醇。在该发酵工艺期间，通过来自水解步骤的仍存在的酶，剩余的(半)纤维素材料被转化为还原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。这种类型的发酵因而通常被称为同时糖化和发酵(SSF)。一旦(半)纤维素材料被转化为可发酵糖并且所有可发酵糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物细胞，发酵完成。这可耗费长达6天。水解和发酵的总工艺时间因而可共达7天。

这样获得发酵糊状物由非可发酵糖、非可水解(半)纤维素材料、木质素、微生物细胞(大多通常为酵母细胞)、水、乙醇、溶解的二氧化碳组成。在连续步骤期间，从糊状物中蒸馏并进一步纯化乙醇。剩余的固体悬浮液被干燥并被用作例如燃烧燃料、肥料和牛饲料。

就每批次的原料而言，添加酶，以在给定的工艺时间期间使从预处理的木质素纤维素原料释放的可发酵糖的产率和速率最大化。通常，生产酶的成本、原料到乙醇的产率和投资是总生产成本中的主要成本因素[2]。就此而言，通过应用来自单种微生物来源或来自多种微生物来源[7]的具有更宽和/或更高(特异性)水解活性的酶产物来实现酶使用成本降低，使用所述酶目的在于更低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率和因而更低的总生物乙醇生产成本。这需要在研究和开发这些酶产物中的大笔投资。在由来自多种微生物来源的酶组成的酶产物情况下，需要针对每种单个酶化合物的大的资本投资。

因此期望改进包括水解和发酵的上述工艺。

源自Talaromyces的热稳定纤维素分解酶已被用于降解木质纤维素原料并且这些酶就它们的热稳定性而言在WO2007091231中已知[3]。但没有给出怎样优化水解和发酵工艺的公开。

发明内容

因此，本发明的目的是提供这样的工艺，其中水解步骤和发酵步骤在最佳温度条件下进行。本发明的另一方面是提供包括具有减少工艺时间的水解和发酵的工艺。本发明的其他目的是提供这样的工艺，其中酶的剂量可被减少并且同时有用的发酵产物的输出被保持在相同水平。另一目的是提供这样的工艺，其中被污染微生物污染的风险被降低。另一目的是提供这样的工艺，其中干物质含量增加。另一目的是提供包括水解和发酵的工艺，其中发酵的工艺条件被优化。根据本发明达到这些目的的一个或多个。本发明提供了从木质纤维素制备发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

a)任选地预处理；

b)任选地洗涤；

c)酶促水解；

d)发酵；和

e)任选地回收发酵产物；

其中，在步骤c)中，使用了具有55℃或更高的最适温度的酶组合物，水解时间是40小时或更长和水解温度是50℃或更高。

令人吃惊地，根据本发明，通过提供稳定的并具有55℃或更高的最适温度的酶组合物用于酶促水解步骤c)，达到许多工艺优势是可能的，包括最佳温度条件、减少工艺时间、降低酶剂量、降低污染风险、更高干物质浓度、酶的再利用和导致成本降低的其他工艺优化。

在该工艺的一种实施方式中，发酵时间是18-120小时，在一种实施方式中，使用的稳定酶组合物保留活性30小时或更久。

根据另外的实施方式，水解在55℃或更高的温度下进行。在优选的实施方式中，酶组合物源自Talaromyces属(踝节菌属)的微生物。以下将更详细地阐释本发明的工艺。

附图简述

图1：使用稳定的纤维素分解踝节菌属酶，从原料的10％干物质悬浮液中葡萄糖随时间释放。上面的点线表示基于原料中的纤维素组成可释放的葡萄糖的理论最大值。下面的点线表示90％转化水平。A表示实现90％水平的时刻。

图2：在不同的踝节菌属酶剂量(表示为体积酶溶液/原料干物质的量)在预处理的木质纤维素原料水解期间释放的还原糖葡萄糖。点线表示可从原料产生的葡萄糖的90％最大理论量(90％转化)。A表示用0.175mL酶溶液/g原料干物质的剂量实现90％水解的时刻；B表示用0.075mL酶溶液/g原料干物质的剂量实现90％水解的时刻。

图3：使用回收踝节菌属酶的情况下，60℃水解原料72小时期间释放的糖的量。图表显示回收酶的5次循环(实验2-6)。在每个循环中，从先前循环回收的酶量被用来水解新批次的预处理原料。没有添加新酶。回收通过使用离心和超滤完成。将每个循环释放的糖量与其中使用了不是回收踝节菌属酶的实验1中释放的量相比较。

图4：在不同的踝节菌属酶剂量(表示为体积酶溶液/原料干物质的量)下对预处理的木质纤维素原料水解期间释放的还原糖葡萄糖。显示了10％w/w原料干物质和15％w.w原料干物质的结果。

图5：在若干酶剂量下，对10％干物质原料悬浮液水解、发酵和真空蒸馏之前(对照样品)和之后每底物单位表示的酶活性总量。一个底物单位酶活性释放1mmol还原糖。

图6：用0.20(●)和0.09(■)g酶组合物/g原料干物质，在水解期间释放葡萄糖(实施例2)。

图7：在酒糟水中的不同酶剂量下，从原料释放的葡萄糖的相对量(实施例4)。

图8展示了菌株BIE252在13.8％d.m.下的经水解的玉米纤维中的性能。显示了CO2生产速率、乙醇生产和糖转化。

图9展示了菌株BIE252在10％d.m.下的经水解的玉米秆中的性能。显示了CO2生产速率、乙醇生产和糖转化。

图10展示了菌株BIE252在10％d.m.下的经水解的麦秸中的性能。显示了CO2生产速率、乙醇生产和糖转化。

发明详述

现在以其所有实施方式形式更详细地描述本发明。

稳定酶组合物

根据本发明，在水解步骤中，使用了稳定的酶组合物，其具有55℃或更高，优选地60℃或更高，或65度或更高的最适温度。通过在不同的温度下测量酶组合物的活性并绘制活性对温度图，然后确定最适温度(即发现最高活性下的温度)。

本文中稳定酶组合物表示，酶组合物在30小时水解反应时间后保留活性，优选地，在30小时水解反应时间后保留其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时的水解反应时间后保留活性。

酶组合物可源自微生物。用在本发明工艺中的组合物包含典型地源自Penicillium纲的腐生物真菌微生物和源自Talaromyces属(例如Talaromyces emersonii)的酶促活性。Talaromyces emersonii还被称为Geosmithia emersonii或Penicillium emersonii。Talaromyces emersonii还被称为Talaromyces duponti和Penicillium duponti。

可用微生物(例如Talaromyces emersonii)通过发酵合适的底物制备酶组合物，其中酶组合物通过微生物生产。任选地，使用了诱导酶组合物中的酶表达的底物。

酶组合物被用来从包含多糖的木质纤维素中释放糖。主要的多糖有纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的原料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(actingin concert)的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

纤维素是由通过β-1，4键连接的葡萄糖残基组成的线性多糖。纤维素纤维的线性本质以及化学计量的β-连接的葡萄糖(相对于α)产生比淀粉的高度枝化的α-连接的结构更倾向于链间(interstrand)氢键结合的结构。因此，纤维素聚合物与淀粉中存在的纤维相比通常溶解度更小，并且形成更紧密结合的纤维。

现详细描述可被包括在用于本发明的稳定酶组合物中的酶：

内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成为纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。

半纤维素是复合聚合物，并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1，4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子处被枝化，并且可以被与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的键取代，或者被乙酸酯化的酯键(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化的酯键)取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(如先前提到的β-(1，3)(1，4)葡聚糖和杂葡聚糖)和额外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。

木聚糖酶与其他附属酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶一起，催化半纤维素的水解。

果胶物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们沿着一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1，4)-连接的D-半乳糖醛酸单元核心链周围构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。

结构单元的主要类型是：聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1，4)-连接的半乳聚糖和(1，5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密结合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。

在本发明方法中使用的组合物包含至少两种活性，但是典型地组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多。典型地，本发明的组合物可包含至少一种纤维素酶和至少一种半纤维素酶。然而，本发明的组合物可包含纤维素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本发明的组合物可包含辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外的活性。此类辅助活性的例子在本文中有提到。

因此，在本发明中使用的组合物可含有内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本发明中使用的组合物可包含一个或多个这些种类中的多于一种的酶活性。例如，在本发明中使用的组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1，3(1，4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1，4-葡聚糖酶活性。此类组合物也可包含一种或多种木聚糖酶活性。此类组合物可包含辅助酶活性。

在本发明中使用的组合物可源自Talaromyces emersonii。在本发明中，预期核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可源自Talaromycesemersonii。Talaromyces emersonii能够提供本文中证明对木质纤维素生物质的水解而言高度有效的活性组。随后可对所述活性补充来自其他来源的额外的酶活性。此类额外的活性可源自经典来源和/或由经遗传改造的生物生产。

本发明中使用的组合物中的活性可以是热稳定的。本文中这表示该活性具有40℃或更高，例如约50℃或更高，例如约60℃或更高，例如约70℃或更高，例如约75℃或更高，例如约80℃或更高，例如85℃或更高的最适温度。本发明中使用的组合物中的活性一般不具有相同的最适温度，但是优选地应是热稳定的。

另外，本发明中使用的组合物中的酶活性可以能够在低pH下工作。就本发明的目的而言，低pH表示约5.5或更低，约5或更低，约4.9或更低，约4.8或更低，约4.7或更低，约4.6或更低，约4.5或更低，约4.4或更低，约4.3或更低，约4.2或更低，约4.1或更低，约4.0或更低，约3.9或更低，或约3.8或更低，约3.7或更低，约3.6或更低，或约3.5或更低的pH。

本发明中使用的组合物中的活性可以通过任何上述最适温度和pH值的组合来限定。除了源自Talaromyces的活性以外，本发明方法中使用的组合物还可包含纤维素酶(例如源自除Talaromyces之外其他来源的纤维素酶)和/或半纤维素酶(例如源自除Talaromyces之外其他来源的半纤维素酶)和/或果胶酶。

本发明中使用的组合物可包含一类、两类、三类、四类或更多类纤维素酶，例如内切葡聚糖酶(EG)的一种、两种、三种或四种或所有，外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)的一种或两种。本发明中使用的组合物可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。

已知Talaromyces原产的β-葡糖苷酶非常有活性，Talaromyces β-葡糖苷酶Cel3a的Vmax值是512 IU/mg，可观地高于针对来自其他真菌来源的β-葡糖苷酶所报道的数值(P.Murray et al./Protein Expression andPuriWcation 38(2004)248-257)。尽管根据本发明的组合物中β-葡糖苷酶有高活性并且达到了高葡萄糖水平，但是不发生葡萄糖抑制。这是有利的，因为使用根据本发明的组合物可以将高活性和高葡萄糖水平组合在一起。

本发明的组合物可包含下述活性，所述活性与本发明方法中使用的组合物所提供的活性具有不同种类的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，本发明的组合物可包含一类由本文所述的组合物提供的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。

在本文中，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，例如部分地降解成纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可得到纤维素糊精与葡萄糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，半纤维素是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可能能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

因此，本发明的组合物可包含任何纤维素酶，例如纤维二糖水解酶，内切-β-1，4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶。

本文中，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。所述酶也可以被称作纤维素酶1，4-β-纤维二糖苷酶(1，4-β-cellobiosidase)，1，4-β-纤维二糖水解酶，1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1，4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。

本文中，内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1，4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解还含有1，3-键的β-D-葡聚糖中的1，4-键。所述酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1，4-内切葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。

本文中，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。

本文中，β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1，3-和1，4-键的β-D-葡聚糖中1，4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1，3-或1，4-键的β-D-葡聚糖。所述酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1，3-1，4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这类酶的替代方案是被描述为内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当下述葡萄糖残基在C-3处被自身取代时，这类酶水解β-D-葡聚糖酶中的1，3-键或1，4-键，所述葡萄糖残基的还原基团涉及要水解的键。替代性的名称包括内切-1，3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1，3-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。

本发明的组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。

本文中，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。所述酶也可以被称作内切-1，4-β-木聚糖酶或1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。一种替代方案是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1，4木糖苷键的酶。

本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1，4-β-D-木聚糖的水解、从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这类酶也可以水解木二糖。所述酶也可以被称作木聚糖1，4-β-木糖苷酶、1，4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4-β-木糖苷酶或木二糖酶。

本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酯。所述酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。替代方式是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1，2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1，2-(4-O-甲基)葡糖醛酰基连接的水解。

本文中，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。此类多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。此类多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。

本文中，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸-糖+H(2)O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素附属酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。

本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。所述酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。

本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。

本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这样的多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。所述酶也可以被称作外切-(1-＞4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。

本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1，4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖内切-1，4-β-甘露糖苷酶或内切-1，4-甘露聚糖酶。

本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。

本发明的组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。

本文中，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中1，4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。

在本文中，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+n H₂O＝n甲醇+果胶酸。所述酶也已知为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果酰基水解酶(pectinpectylhydrolase)。

在本文中，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。所述酶也已知为阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷键酶，内切-1，4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。

本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰基作用的乙酰基酯酶活性。

本文中，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。酶也可已知为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶酶(pectolyase)，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。酶也可以已知为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1，4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1，4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以已知为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸、释放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n+H₂O＝(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n-1+D-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知为半乳糖醛1，4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1，4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。

本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱脂化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖结构由二糖[(1，2-α-L-鼠李糖基-(1，4)-α-半乳糖醛酸]组成。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替出现的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式、从严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。

本文中，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。

本文中，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被称作α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1，5-阿拉伯聚糖中1，5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。所述酶也已知为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1，5-α-L-阿拉伯聚糖1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。

本发明的组合物将一般包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶和/或至少一种果胶酶(其中之一是根据本发明的多肽)。本发明的组合物可包含纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。此类组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。

另外，本发明的组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶葡糖醛酸糖苷酶或扩展蛋白或纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。

“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多肽酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明中使用并且通过引用并入本文。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。

“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。

“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其他方式分解木质素聚合物的描述的其他酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。

“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可以能够催化(1，3)(1，4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。

“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)。

本发明中使用的组合物可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.，Eur.J.Biohem.269，4202-4211，2002)或膨胀因子样蛋白质。

扩展蛋白涉及植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质——膨胀因子，含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。就本发明的目的而言，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含此类结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。

本发明中使用的组合物可以是纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman et al.，J.Biol.Chem.278(34)，31988-31997，2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将分解纤维素的亚基组合进多酶复合物中。这通过两类互补的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesion domain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。就本发明的目的而言，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一种或两种。

本发明方法中使用的组合物可由上文提到的每种酶的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的这些蛋白质)的任何组合组成。

在本发明的方法中使用的组合物可以由来自以下来源的酶组成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)复合培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中不同的酶可得自不同的来源。

酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并可将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆或麦秸)等等加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)原料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。

在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以共同(即本身作为单一组合物)或单独或先后提供。

本发明因此涉及其中使用上述组合物的方法，和所述组合物在工业工艺中的用途。

木质纤维素材料

本文中木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用作本发明原料的木质纤维素材料包括下述生物质，所述生物质例如原生生物质(virgin biomass)和/或非原生生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corn cobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是，但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheat midlings)，燕麦壳，和硬木材或软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，特定地包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。

预处理

任选地，原料可通过本领域中已知的任何方式用热、机械和/或化学改性或此类方法的任何组合预处理，以便增强底物对酶促水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，通过用蒸汽喷发、热水处理或用稀酸或稀碱处理木质纤维素进行预处理。

洗涤步骤

任选地，根据本发明的工艺包括洗涤步骤。任选的洗涤步骤可被用来去除可能作为发酵步骤的抑制剂的水可溶化合物。洗涤步骤可以已知的方式进行。

酶促水解

根据本发明的工艺包括酶促水解步骤。酶促水解包括但不限于液化原料的目的的水解和从原料或发酵液释放糖的目的的水解。在该步骤中，任选地预处理的和任选地洗涤的木质纤维素材料开始与根据本发明的酶组合物接触。取决于木质纤维素材料和预处理，不同的反应条件例如温度、酶剂量、水解反应时间和干物质浓度可由技术人员调节，以实现木质纤维素向糖的期望转化。一些指标在下文给出。

在本发明的一个方面中，水解在50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的温度下进行。水解期间的高温具有许多优势，所述优势包括在酶组合物的最适温度下工作、(细菌)污染风险降低、降低的粘性、需要更少量的冷却水、使用具有更高温度的冷却水、酶的再利用和更多的优势。

在本发明的另一个方面中，添加的酶组合物的量(本文中也称为酶剂量或酶负载量)低。在一种实施方式中，酶量是6mg蛋白/g干物质重量或更低，5mg蛋白/g干物质或更低，4mg蛋白/g干物质或更低，3mg蛋白/g干物质或更低，2mg蛋白/g干物质或更低或1mg蛋白/g干物质或更低(表示为mg蛋白/g干物质形式的蛋白)。在一种实施方式中，酶量是0.5mg酶/g干物质重量或更低，0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低，0.3mg酶/g干物质重量或更低，0.25mg酶/g干物质重量或更低，0.20mg酶/g干物质重量或更低，0.18mg酶/g干物质重量或更低，0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为以mg酶/g干物质形式的总纤维素酶)。低酶剂量是可能的，由于酶的活性和稳定性，增加水解反应时间是可能的。

在本发明的另一个方面中，水解反应时间是40小时或更多，50小时或更多，60小时或更多，70小时或更多，80小时或更多，90小时或更多，100小时或更多，120小时或更多，130小时或更多。在另一方面中，水解反应时间是40-130小时，50-120小时，60-120小时，60-110小时，60-100小时，70-100小时，70-90小时或70-80小时。由于酶组合物的稳定性，更长水解反应时间是可能的，这对应更高的糖产率。

水解期间的pH可由技术人员选择。在本发明的另一个方面中，水解期间的pH可以是3.0-6.4。本发明的稳定酶可具有高至2个pH单位，高至3个pH单位，高至5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0至8.0，3.0-8.0，3.5-7.0，3.5-6.0，3.5-5.0，3.5-4.5，4.0-4.5的界限内或大约4.2。

在本发明的另一个方面中，进行水解步骤c)直到木质纤维素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被释放出。

显著地，本发明的工艺可在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质进行。因而，本发明可用大约5％或更高，大约8％或更高，大约10％或更高，大约11％或更高，大约12％或更高，大约13％或更高，大约14％或更高，大约15％或更高，大约20％或更高，大约25％或更高，大约30％或更高，大约35％或更高或大约40％或更高的干物质含量进行。在另外的实施方式中，在水解步骤c)中的干物质含量是14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％(w/dmw)或更多或14-33％。缩写词dmw在本文中表示“干物质重量”，重量以g(克)表示。

发酵

根据本发明的工艺包含发酵步骤d)。在另一个方面中，本发明因而包括步骤d)发酵工艺，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。就从此类碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元而言，可将适宜糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或其可通过经改造的宿主细胞生产。在后者的情况下，经改造的宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌此类糖酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的其他优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的糖酶的量来实现。这反过来会防止对需要非葡萄糖的糖(例如木糖)的代谢和运送的体系抑制。在优选的工艺中，所述经改造的的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基还会包含对经改造的宿主细胞生长而言需要的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成是本领域中已知的。

在相同条件下发酵时间可比在常规发酵中更短，其中部分酶促水解在发酵期间仍必定参与。在一种实施方式中，就50g/l葡萄糖和来自木质纤维素原料的相应的其他糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖组合而言，发酵时间是100小时或更短，90小时或更短，80小或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合，发酵时间可相应地被减少。

发酵工艺可以是需氧或厌氧发酵工艺。厌氧发酵工艺在本文中被定义为下述发酵工艺，所述发酵工艺在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此产生NAD⁺。因而，在优选的厌氧发酵工艺中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺类抗生素和头孢菌素。在优选的实施方式中，发酵工艺是厌氧的。厌氧工艺是有利的，因为其比需氧工艺更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧工艺给出比需氧工艺更高的产率。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。

在另一实施方式中，发酵工艺在限氧条件下。更优选地，发酵工艺是需氧的并在限氧条件下。限氧发酵工艺是这样的工艺，其中氧消耗被氧从气体至液体的转移所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的工艺中，氧消耗的速率为至少5.5mmol/L，更优选地至少6mmol/L和甚至更优选地至少7mmol/L。

发酵工艺优选地在就经改造的细胞而言最佳的温度下运行。因而，就大多数酵母或真菌细胞而言，发酵工艺在小于42℃，优选地小于38℃下的温度下进行。就酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵工艺优选地在低于35、33、30或28℃的温度下并在高于20、22或25℃的温度下进行。

在本发明的一个实施方式中，在步骤d)中，用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行发酵。在一种实施方式中，工艺是用于乙醇生产的工艺，其中，工艺包括步骤d)，步骤d)包括用能发酵至少一种C5糖的微生物发酵含糖培养基，其中宿主细胞能将葡萄糖、L-阿拉伯糖和木糖发酵为乙醇。在一种实施方式中，能发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一种实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选地是Saccharomycescerevisiae种，其中已制得下述遗传改造：

a)由在强启动子控制下的PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的簇，

b)由都在组成型启动子控制下的xylA-基因和XKS1-基因组成的簇，

c)由基因araA、araB和araD组成的簇和/或xylA-基因和XKS1-基因的簇；

d)缺失醛糖还原酶基因；

和产生的经改造的微生物的适应性进化。此类微生物及其制备被详细地描述在WO 2008/041840和于2010年4月21日提交的欧洲专利申请EP10160622.6中。在一个实施方式中，用于生产乙醇的发酵工艺是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵工艺是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵工艺在限氧条件下，更优选地所述工艺是需氧的并在限氧条件下。限氧条件已在本文上文定义过。

在此类工艺中，乙醇体积生产力优选地至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。在工艺中在L-阿拉伯糖和任选地木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率优选地至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任选地木糖，乙醇理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。

在一个方面中，导致乙醇生产的发酵工艺具有与已知乙醇发酵工艺相比的若干优势：

-厌氧工艺是可能的；

-限氧条件也是可能的；

-可获得较高的乙醇产率和乙醇生产速率；

-使用的菌株可能够使用L-阿拉伯糖和任选地木糖。

备选地，针对上述的发酵工艺，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该工艺是共发酵工艺。如上所述的发酵工艺的所有优选实施方式也是该共发酵工艺的优选实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、工艺进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。

可进行发酵工艺而无任何调整发酵期间pH的需要。也就是说，所述工艺是不用添加任何酸或碱而可进行的工艺。不管怎样，这排除了可添加酸的预处理步骤。要点是本发明的组合物能在低pH下起作用并因而不需要为了糖化可发生而调整酸预处理原料的酸的pH。因此，本发明的方法是仅使用有机产物不需要无机化学输入物的零废物方法。

总反应时间

根据本发明，可减少总反应时间(即水解步骤c)和发酵步骤d)的合起来的反应时间)。在一种实施方式中，在90％葡萄糖产率下总反应时间为150小时或更少，140小时或更少，130小时或更少，120小时或更少，110小时或更少，100小时或更少，90小时或更少，80小时或更少，75小时或更少，或大约72小时。相应地，可在较低的葡萄糖产率下达到较少反应时间。这取决于其中工艺在SHF或SSF模式中进行的模式。

发酵产物

可根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(术语“乙醇”被理解为包括乙醇(ethylalcohol)或乙醇和水的混合物)。

可通过本发明的方法生产的具体的价值增加产物包括但不限于，生物燃料(包括乙醇和丁醇)；乳酸；3-羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸和马来酸；溶剂；动物饲料补充物；药物例如β-内酰胺类抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶；化学原料；或动物饲料补充物。

发酵产物分离

根据本发明的工艺任选地包括回收发酵产物。发酵产物可以任何已知的方式从发酵液中分离出。对于每种发酵产物，技术人员因此能选择合适的分离技术。例如，可以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。

以下将更详细地描述本发明的某些实施方式，但绝不是限制本发明的范围。

在最佳温度条件下使用热稳定酶

在一种实施方式中，本发明涉及在水解和发酵分离工艺(SHF)和SSF工艺中使用热稳定酶(Talaromyces的纤维素分解酶)，用于在乙醇生产(但不限于乙醇生产)中从预处理的木质纤维素原料生产还原糖。应用于预处理的木质纤维素原料的Talaromyces的纤维素分解酶显示了在50-70℃范围内的温度下的最大转化速率。酶在这些环境下保留活性达14天及更久，而没有完全停止活性。

通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在可能的最短的水解时间内从原料(完全水解)释放出。以这种方式，使用0.175mL(6mg蛋白)/g原料干物质的酶剂量，在SHF工艺中，在不到5天(120h，见图1)实现了以葡萄糖形式的纤维素的100％转化。在SSF条件下在33℃下，在木质纤维素原料中的纤维素的总转化将持续近168h[2]并且因此这些嗜温条件决定从原料中最大乙醇生产所需要的工艺时间。

在热稳定纤维素分解酶(例如来自Talaromyces)被用于有嗜热的生产乙醇的微生物的SSF工艺的情况下，发酵时间会更短，因为Talaromyces的纤维素分解酶在更高的温度下比在嗜温温度下更快地释放还原糖。

在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且产物浓度可以通过与理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps max)相乘而与基础的葡萄糖浓度相关。

发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps max)可得自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据酵母中正常的糖酵解发酵通路产生2摩尔乙醇(＝2×46＝92 gr 乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511 gr 乙醇/gr葡萄糖。

对丁醇(MW 74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps max＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。

对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Ypsmax＝1gr乳酸/gr葡萄糖。

对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。

应用Talaromyces的纤维素分解酶实现的成本降低是总工艺时间减少的结果。

用热稳定酶减少工艺时间

鉴于稳定酶允许延长水解时间而没有显著活性损失，可应用例如72小时的水解时间，导致仅用0.175mL酶/g原料干物质(见图1，点A)获得还原糖的理论最大值的近似90％转化。因此获得的糊状物可被用作为连续发酵步骤中的底物，用于例如但不限于乙醇生产。仍未被转化为还原糖的剩余的近似10％的纤维素会在发酵期间(SSF)被转化为还原糖并被直接转化为乙醇。鉴于此类发酵用在发酵起始下可利用的糖的最大量的90％开始，还原糖的释放速率不会如其在常规SSF期间那样决定生产乙醇的微生物的生长速率。以这种方式，乙醇生产可在更高的生产速率下发生，允许在不到48h，不到45h，不到40h，不到35h，不到30h，不到25h，例如24h中完成乙醇生产。总工艺时间可因此被从7天减至不到5天，不到4天，不到3天，不到2天(48小时)。由于更短的发酵时间，使用了用于维持生产乙醇的微生物的更少底物。较之常规的预糖化和SSF，延长水解时间并缩短发酵时间的该方法的总产率可导致基于底物的5-15％更高的乙醇产率。

应用稳定的纤维素分解酶(如Talaromyces的那些)实现成本降低，这起因于总工艺时间减少。

使用Talaromyces酶，用延长水解时间补偿减少的酶剂量

由于稳定酶的高稳定性，活性不会及时停止，而较少的还原糖在水解期间被释出。通过延长水解时间来减少酶剂量并来延长酶的使用以获得释放的还原糖的类似水平是可能的。例如，0.175mL酶/g原料干物质导致在72小时内从预处理的原料中释放还原糖的理论最大值的近似90％(图2中的点A)。当使用0.075mL酶/g原料干物质时，在120h内实现理论最大值的近似90％转化(图2中的点B)。结果显示，由于酶活性的稳定性，减少的酶剂量可通过延长水解时间补偿，以获得相同量的还原糖。对在高于10％干物质含量下的预处理原料水解的相同保持显示了在15％干物质原料下延长水解时间的补偿作用。

通过使用稳定的(例如Talaromyces的)纤维素分解酶实现成本降低，这起因于需要较少的酶剂量，导致相似的水解转化产率。

用稳定酶优化发酵工艺

如果水解导致还原糖水平在来自预处理原料的还原糖的理论最大值下或接近来自预处理原料的还原糖的理论最大值，还原糖溶液可被调整并被处理，目的在于获得用于发酵步骤的最佳底物溶液组合。该调整和处理包括但不限于，浓缩、纯化、pH调整、额外营养素的补充等等。可通过将还原糖溶液转移至发酵容器或通过将必要营养素和接种物添加至含有还原糖溶液的容器开始发酵。

另外，针对最大发酵效率，可优化将还原糖溶液添加至发酵容器的模式，在分批、补料分批和连续模式中在例如限制碳的条件下添加。

由于酶的稳定性，活性会在发酵期保留存在并会继续将剩余的纤维素和部分经水解的纤维素转化为还原糖。以这种方式，稳定酶允许发酵步骤优化而没有总转化产率损失。

应用稳定的纤维素分解酶(如Talaromyces的那些)实现成本降低，这起因于使工艺效率最大化。

用稳定酶降低污染风险

在将木质纤维素材料转化为乙醇的常见工艺中，工艺步骤优选地在感染性条件下进行，以减少操作成本。污染微生物的污染和生长可因而发生并导致不期望的副作用，此类乳酸、甲酸和乙酸生产，基于底物的乙醇的产率损失，毒素和细胞外多糖的产生可显著影响生产成本。高工艺温度和/或短工艺时间会限制水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶(比如Talaromyces的那些)能在高于60℃的温度下水解木质纤维素原料。在这些温度下，污染微生物引起不期望副作用的风险会减小至几乎为零。

在发酵步骤期间，其中乙醇被生产，温度典型地在30-37℃之间并且由于产量损失而优选地不会被升高。通过应用尽可能短的发酵工艺时间，污染的风险和作用和/或污染物的生长会尽可能大的被减小。使用稳定酶(比如Talaromyces的那些)，可应用尽可能短的发酵时间(见说明书上文)，并且因而污染风险和/或污染物生长可被尽可能大的降低。应用Talaromyces的热稳定纤维素分解酶实现成本降低，这起因于降低了由于污染导致工艺失败的风险。

稳定酶减少冷却成本并增加乙醇植物(ethanol plants)的生产力

热预处理后的第一个步骤是将预处理的原料冷却至酶为最佳活性的温度。大规模时，这典型地通过添加(冷却)水完成，这除了降低温度外，会减少干物质含量。通过使用热稳定酶(比如Talaromyces的那些)，可通过下述事实实现成本降低：i)更少需要对预处理原料冷却，因为在水解期间允许更高温度，和ii)添加更少的水，这会增加水解和发酵期间的干物质含量并因而增加乙醇植物的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。同样，通过使用根据本发明的热稳定酶(比如Talaromyces的那些)，成本降低也可通过使用比用在有非热稳定酶的工艺中的水具有更高温度的冷却水实现。

利用稳定酶水解后回收酶

水解结束时，酶活性看起来是低的，因为一旦几乎所有纤维素被转化，几乎没有还原糖被释放出。但是，存在的酶促活性的量仅减少少许，假设这主要是由于酶对底物的吸收。通过在水解后应用固液分离，例如离心、过滤、沉淀等等，溶液中的酶活性的60％或更多，例如70％可被回收并被重新使用用于在下一水解期间水解新的预处理的木质纤维素原料(见图3)。

而且，固液分离后，溶液中的酶可从含有还原糖和来自酶促作用的其他水解产物的溶液中分离出。可借助或不借助首先将酶吸附到任何类型的载体，通过但不限于(超或微)过滤、离心、沉淀、沉降进行该分离。

例如，用0.175mL/g原料干物质的酶量对预处理的原料水解20h后，还原糖的理论最大量的50％被释出，并且相同水解72h后，还原糖的理论最大量的90％被释出。通过离心和超滤，在渗余物中回收60-70％的酶活性，而滤液含有超过80％的释出的还原糖。通过再利用渗余物或被进一步纯化和/或浓缩后的渗余物，在下一水解步骤期间的酶剂量可被减少60-70％。通过使用稳定纤维素分解酶(例如Talaromyces的那些)实现成本降低，这起因于需要更少的酶剂量。

利用稳定酶的水解后回收酶与酶生产和回收酵母细胞

包括如上文所述的水解后回收的酶的工艺可与发酵后回收生产乙醇的微生物的工艺组合，并与在酶生产发酵中使用含还原糖的滤液作为底物(纯化的和/或浓缩的或稀释的)和使用含还原糖的滤液作为底物用于培养生产乙醇的微生物组合。

利用稳定酶的真空蒸馏后回收酶

酶(比如来自Talaromyces的那些)的热稳定性导致在酒糟水中的水解、发酵和真空蒸馏后剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的工艺步骤期间降低10-15个底物单位(Substrate units)/g干物质原料，这不依赖于初始酶剂量(见图5)。真空蒸馏后获得的酒糟水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理麦秸转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏工艺循环。酒糟水可被以浓缩形式或(未)稀释形式使用和/或被纯化并有或没有额外的酶补充物。

用于纤维素材料、玉米粗粉(corn grid)和乳糖的水解的酒糟水的再利用被描述用于多级SSF反应器[2]，目标在于挥发性发酵产物的连续生产和分离。在该系统中，气-液接触柱被用来从糊状物中连续分离乙醇。但是，该复杂系统需要大量酶以实现从木质纤维素原料足够快地释放还原糖，因为工艺条件对使用的酶而言是次优的。通过使用热稳定纤维素分解酶(比如Talaromyces的那些)实现成本降低，这起因于再利用酶活性的能力。

利用热稳定酶的真空蒸馏后回收酶与酶补充的组合

在最佳工艺中，酶在新工艺循环中再利用之前，补充到酒糟水中的酶量等于在先前的工艺循环的三个连续工艺步骤期间损失的活性量。以这种方式，避免超剂量的酶，并因此获得酶的最有效使用。

而且，通过在第一个工艺循环中提供高酶剂量并补充等于在随后的工艺循环中的三个连续工艺步骤期间损失的活性量，可在每个工艺循环中获得最高可能的水解速率，导致少于48h的短的水解时间和酶的最有效使用。

在混合系统中使用稳定酶

通过在水解期间应用混合，酶开始更经常地与底物接触，这导致催化活性更有效使用。这会导致酶剂量更低并因而导致成本更低，除非混合对酶具有负面作用。稳定酶(比如得自Talaromyces的热稳定酶)，是稳健的并可抵抗(局部)高剪切和高温环境，所述高剪切和高温环境是浆体充分混合期间的情况。在混合物系统中使用稳定酶因而是有益的并会导致剂量减少并因此导致成本降低。

本发明通过下述实施例进一步描述，其不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

在升温下通过使用保留活性超过30小时的酶组合物来减少工艺时间

在其中水解被延长至72小时的工艺和其中水解时间被限制至20小时的工艺之间做比较，以表明在延长的水解中使用保留活性的酶组合物的益处。

材料和方法

水解和发酵方法被描述在专利申请WO2010018105(PCT/EP2009/060098)中。预处理麦秸被用作原料并在70℃的自来水中洗涤直到pH高于3，优选地在6.0和6.5之间。制备经洗涤的预处理原料的10％ w/w浆体并在56℃下预孵育。酶组合物以0.20g酶组合物/g原料干物质的浓度添加。混合物被分为两个相等部分A和B并在56℃下在孵育器中孵育同时平稳地摇动。在该水解期间，每日取样以测定从纤维素释放的存在于浆体中的葡萄糖量。部分A表示其中使用20小时水解时间的工艺；部分B表示其中在延长的72小时水解中使用保留活性的工艺。20小时后，从孵育器中取出部分A并冷却至33℃。根据WO2010018105(PCT/EP2009/060098)，通过添加酵母细胞和盐并在33℃下孵育另外6天来进行发酵。部分A的工艺时间由此等于约7天(20小时水解和6天发酵)。

72小时后，从孵育器中取出部分B并冷却至33℃。以如部分A的相同的方式在33℃下进行发酵，但在48小时后停止。部分B的工艺时间由此等于约5天(3天水解和2天发酵)。

结果和讨论

发酵期间，释放的糖被转化为酵母细胞、CO₂和乙醇。一旦酵母细胞生产停止，产生的乙醇量与产生的二氧化碳量成比例。鉴于二氧化碳可在线测量，其产量反映了产生的乙醇的量。表1给出了在部分A和B中释放的葡萄糖的量、产生的二氧化碳的量和乙醇的最终产率。

表1：部分A和B的葡萄糖、二氧化碳和乙醇分析的结果

结果显示，20小时水解期随后6天发酵期产生了与72小时水解期随后48小时发酵的相同量的乙醇。因而，用5天工艺时间，实现了如用7天工艺时间的类似乙醇生产水平。

这些的原因是在部分A中的20小时水解期间释放了少于理论最大量的60％的糖。尽管由于温度较低处于欠佳条件下，剩余的量在发酵期间被释放出。

部分B中，酶组合物在更佳条件下在72小时水解期期间保留活性。该水解期间，释放了葡萄糖的理论最大量的95％，而剩余的5％在48小时发酵期期间被释放出。由此表明，保留的酶组合物的活性可用来缩短工艺时间并因而降低操作成本。

实施例2

在升温下，用保留活性超过30小时的酶组合物，通过增长工艺时间来减少酶剂量

在另一实施方式中，通过延长水解，保留酶组合物活性的特性可被用来补偿低的酶剂量。

材料和方法

使用了如在实施例1中提及的水解和发酵方法。

制备经洗涤的预处理原料的10％w/w浆体并在56℃下预孵育。浆体被分为两个相等部分A和B。酶组合物被以0.20g酶组合物/g原料干物质的浓度添加至部分A，并以0.09g酶组合物/g原料干物质的浓度被添加至部分B。部分A和B在56℃下在孵育器中孵育220小时同时平稳地摇动。在该水解期间，每日取样以测定从纤维素释放的存在于浆体中的葡萄糖量。将测量的葡萄糖对水解时间绘图(见图5)。

在单独的实验中，用0.20g酶组合物/g原料干物质的部分A以及用0.09g酶组合物/g原料干物质的部分B在56℃下孵育。72小时(部分A)和120小时(部分B)后，从孵育器中取出两个部分并冷却至33℃。根据WO2010018105(PCT/EP2009/060098)，通过添加酵母细胞和盐并在33℃下孵育另外48小时来进行发酵。

结果和讨论

图6显示在0.20g酶组合物/g原料干物质重量和0.09g酶组合物/g原料干物质重量的剂量下，从在酸预处理的原料的10％w/w干物质悬浮液中的纤维素释放葡萄糖。其显示，当酶剂量减少时，若水解时间延长可实现相似水平的葡萄糖。令人吃惊地，尽管酶量被减少多于一半，需要延长60％的水解时间以对减少的酶量补偿。当使用0.20g酶组合物/g原料干物质重量的剂量时，在72小时内实现52g/L水平，而当使用0.09g酶组合物/g原料干物质重量时，在120小时内实现相同水平。

在单独的实验中，两部分在72小时(部分A)和120小时(部分B，见表2)后被发酵。但就部分B而言水解时间长60％，发酵后获得相似的乙醇水平。这样，表明保留的酶组合物活性可被用来减少酶剂量并因而相应地减少操作成本。

表2：部分A和B的水解、发酵和比较结果

实施例3

有保留活性的酶组合物的使用允许水解后再利用活性

进行实验，来证明水解后原料酶浆体的液体部分用作下一工艺循环中水解的活性来源。

材料和方法

使用了如在实施例1中提及的水解方法。

制备预处理原料的10％w/w浆体并在60℃下预孵育。酶组合物被以0.20g酶组合物/g原料干物质的浓度添加并在56℃下在孵育器中孵育120小时同时平稳地摇动。然后从孵育器中取出浆体并在4500g下离心。小团粒被洗涤一次，离心并且洗涤的上清液与第一次固液分离的上清液组合。使用Z200过滤器(Pall的大约0.2um厚的滤纸)过滤组合的上清液并在10℃下使用10kD PES的螺旋卷式超滤单元浓缩组合的上清液。因此获得的浓缩物被用做使用在如上述条件下预处理的新原料的第二次水解中的酶来源。针对葡萄糖和酶活性分析所有的工艺液流。

结果和讨论

对液流的分析表明，通过使用固液分离，随后通过过滤和超滤，葡萄糖可与酶分开。如图4所示的，水解后UF浓缩物的酶活性保留在初始活性的70％水平上。这表示，使用有保留活性的酶组合物并用本文描述的回收步骤，酶可被再利用，用于在连续工艺循环中对原料水解。大约86％的纤维素被回收并可在发酵中用作清洁工艺液流。

通过在水解后回收酶活性，使得允许再利用该酶活性并因而削减关于酶的成本。而且，因为在发酵和蒸馏期间没有固体，含有葡萄糖的清洁工艺液流会导致较低的维护和能源成本。

实施例4

具有保留活性的酶组合物的使用允许在蒸馏后再利用活性

进行实验，来表明用具有保留活性的酶组合物水解、发酵和蒸馏后获得的酒糟水用做水解的活性来源。

材料和方法

使用了如在实施例1中提及的水解和发酵方法。

制备经洗涤的预处理原料的10％w/w浆体并在56℃下预孵育。酶组合物被以0.20g酶组合物/g原料干物质的浓度添加并在56℃下在孵育器中孵育20小时同时平稳地摇动。然后从孵育器中取出浆体并冷却至33℃。根据PCT/EP2009/060098，通过添加酵母细胞和盐并在33℃下孵育另外148小时来进行发酵。

在100mbar和60±1℃下，使用真空蒸馏，蒸馏浆体20分钟直到所有乙醇被去除。含有不可溶残留物、酵母细胞和酶的浆体被离心，以去除不可溶残留物和酵母细胞；并收集上清液。上清液还被称为酒糟水。

将预处理的原料以10％干物质重量的浓度添加至酒糟水。因此获得的浆体被分为若干相等部分，每一部分被添加0g酶/g原料干物质至0.58g酶/g原料干物质的范围内的酶量。然后在56℃下孵育浆体并释放葡萄糖量。

结果和讨论

为在高酶活性和低酶活性之间区分，直到所有纤维素被水解前，水解应持续。因而，这里使用了20小时的水解时间。在这些20小时内释放的葡萄糖的量取决于在水解期间存在的酶量。最大葡萄糖量是如在图6中所示的水平并且这里被设为100％。

如可在图7中看出，没有添加酶的酒糟水含有水解活性，这起因于在先前工艺循环中使用具有保留活性的酶组合物。因而，较之悬浮在水中的酶组合物，使用悬浮在酒糟水中的酶组合物增强了葡萄糖释放。这种增强在更低的酶剂量下是更显著，这可通过下述事实解释：也如在图7中所示的，随着酶活性增加，葡萄糖释放速率早期及时增加。高酶剂量曲线比低酶剂量曲线更早地弯曲。

通过在水解中再利用酒糟水，酶剂量可被减少并且因而可获得成本降低。

实施例5

木质纤维素材料的酶促水解和用转化C5的酵母发酵

水解

通过使用实验性广谱纤维素酶制备物，在60℃下，酶促水解玉米秆和麦秸的稀酸预处理的样品3天(72小时)。水解开始时的pH为5.0。水解开始时的干物质含量为10％w/w。

除了水解温度为50℃并且水解开始时干物质含量为13.8％之外，预处理的玉米纤维样品的水解条件基本上相同。

水解(72小时)后，允许样品冷却至室温。使用10％NaOH将pH调至5.5。随后，添加1毫升200克/升的(NH4)2S04和1毫升100克/升的KH2P04。

发酵

然后，以相当于每千克水解产物1克酵母的酵母干物质含量添加酵母样品。使用AFM(乙醇发酵监测器：HaloteC Instruments BV，Veenendaal，the Netherlands)及时监视CO2发展。在33℃下至少一式三份进行实验72小时。在固定间隔下对这些中的一份取样，以能够分析乙醇形成和剩余的糖浓度。这些数据被用来计算发酵产率。其他两个实验的发酵液不被取样。相反，在发酵结束时，在45％蒸汽下使用Buchi K-355蒸馏装置，发酵液被蒸馏15分钟。使用Anton Paar DMA 5000密度计(Anton PaarBenelux BVBA，Dongen，荷兰)测定产生的乙醇。

用于发酵的菌株是BIE252，其制备被描述在于2010年4月21日提交的欧洲专利申请EP10160622.6中。该菌株是酵母菌属酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)菌株，其已被遗传工程改造，以允许代谢C5糖，即木糖和阿拉伯糖。

BIE252在含有补充有2％葡萄糖的YEP培养基的摇瓶中过夜培养。通过离心收获细胞，以50克干物质/升的浓度再悬浮。

测试的原料由多批次的玉米纤维、玉米秆和麦秸组成。如材料和方法部分描述的进行水解和发酵。

结果在图17(玉米纤维)、18(玉米秆)和19(麦秸)中列出。在玉米秆和麦秸的情况下，原料具有相对低量的半乳糖和阿拉伯糖而主要由葡萄糖和木糖组成，所有的糖在72小时内被转化为CO2和乙醇。在玉米纤维(图17)的情况下，有剩余的低残留量阿拉伯糖、半乳糖和木糖。

在下表中，以水解结束时释出的糖和发酵结束时产生的乙醇的量为基础，计算发酵产率。

表3：针对不同的木质纤维素原料，释放的总糖(g/l)、BIE252发酵产生的乙醇(g/l)和乙醇产率(g乙醇/g糖)，

*(释放的，开始发酵时的单体糖)

以如通过Anton Paar DMA 5000密度计测量测定的发酵结束时产生的乙醇量和使用的预处理原料的量为基础，一式二份计算总水解和发酵的产率。这些数字在表4中示出。

表4：针对不同的木质纤维素原料，BIE252发酵的总水解和发酵产率(每吨干物质的乙醇的加仑)

文献

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Claims (21)

1.从木质纤维素材料制备发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

a)任选地预处理；

b)任选地洗涤；

c)酶促水解；

d)发酵；和

e)任选地回收发酵产物；

其中在步骤c)中，使用了具有55℃或更高的最适温度的酶组合物，水解时间是40小时或更多并且水解温度是55℃或更高。

2.根据权利要求1的工艺，其中在90％葡萄糖释放下，步骤c)和d)的反应时间合起来为150小时或更短或在更低的百分比葡萄糖释放下，所述反应时间为相应地更短时间。

3.根据权利要求1或2的工艺，其中所述发酵时间是18-120小时。

4.根据权利要求1至4的任一项权利要求的工艺，其中使用的所述酶组合物保留活性30小时或更长。

5.根据权利要求1至4的任一项权利要求的工艺，其中所述水解在55℃或更高的温度下进行。

6.根据权利要求1至5的任一项的工艺，其中所述酶组合物得自Talaromyces属的微生物。

7.根据权利要求1至6的任一项的工艺，其中使用的所述酶组合物在30-500小时的时段内保留活性。

8.根据权利要求1至7的任一项权利要求的工艺，其中进行步骤c)直到木质纤维素材料中的70％或更多的可得到糖被释放出。

9.根据权利要求8的工艺，其中进行步骤c)直到木质纤维素材料中的90％或更多的可得到糖被释放出。

10.根据权利要求1至9的任一项的工艺，其中所述酶组合物的剂量是6mg蛋白/g干物质重量或更低。

11.根据权利要求1至10的任一项的工艺，其中在步骤d)中，用能发酵至少一种C5糖的微生物进行所述发酵。

12.根据权利要求1至11的任一项的工艺，其中在水解步骤c)中的干物质含量是14％(w/dmw)或更高。

13.根据权利要求12的工艺，其中在水解步骤c)中的干物质含量是14-33％(w/dmw)或更高。

14.根据权利要求1至13的任一项的工艺，其中在步骤e)中，在所述发酵产物回收后，产生的含酶浆体被回收至步骤c)。

15.根据权利要求1至14的任一项的工艺，其中所述水解步骤c)的产物经受固液分离并且(一部分)液体部分被进料至发酵步骤d)。

16.根据权利要求1至15的任一项的工艺，其中所述水解步骤c)的产物经受固液分离并且(一部分)液体部分被回收至步骤c)。

17.根据权利要求1至16的任一项的工艺，其中所述水解步骤c)的产物经受固液分离并且所述液体部分被进料至超滤装置，其中滤液被进料至发酵步骤d)并且渗余物被回收至步骤c)。

18.根据权利要求17的工艺，其中部分滤液被用来进料生产发酵罐，用于生产在所述工艺中使用的微生物。

19.根据权利要求17或18的工艺，其中所述部分滤液被用来进料生产发酵罐，用于生产酶。

20.根据权利要求18或19的工艺，其中所述部分滤液被用来进料生产发酵罐，用于生产发酵产物。

21.根据权利要求17至20的任一项的工艺，其中所述滤液被用来以分批、补料分批和/或连续培养模式进料生产发酵罐。

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