CN101426922A - 包括用碱性溶液处理固体木质纤维素材料以便除去木质素的步骤由固体木质纤维素材料发酵生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使用由木质纤维素和特别是甘蔗渣组成的农业和工农业废物材料，获得燃料乙醇的方法。这些残渣具有可对其进行化学和酶工艺水解的显著大量的多糖(纤维素和半纤维素)形式的碳水化合物含量。采用硫酸对半纤维素部分进行温和水解，和对来自这一水解的固体材料进行糖化(酶水解)工艺，同时在允许醇的产率显著增加的条件下在大大地缩短的时间内快速醇发酵。

Description

包括用碱性溶液处理固体木质纤维素材料以便除去木质素的步骤由固体木质纤维素材料发酵生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及通过使用木质纤维素农业和工农业废物，和特别是甘蔗渣获得燃料乙醇的方法。这些残渣具有显著大含量的多糖(纤维素和半纤维素)形式的碳水化合物，所述碳水化合物可通过化学和酶法水解。采用硫酸，对半纤维素部分进行温和水解，和将来自这一水解的固体材料进行糖化工艺(酶解)，且在大大地缩短的时间内，在允许乙醇转化率显著增加的条件下同时快速醇发酵。
背景技术
来自工业和工农业活动中的具有木质纤维素组合物的废物是主要的环境问题；然而，它们可以是低成本的可再生的起始材料的有价值的资源用以生产各种化学品和燃料，例如乙醇。
为了利用多糖部分生产乙醇，这些部分需要有效地水解。
借助预处理分级这些多糖类，所述预处理由称为酸水解的反应所组成，其目的是水解半纤维素部分。来自这一步骤的固体产物富含纤维素，仍然需要在碱性条件下处理，以便除去可溶的木质素，保证酶接近纤维素纤维。
纤维素转化成乙醇牵涉两个基本的步骤：纤维素分子的长链水解，得到糖类(己糖)，和这些糖类发酵，得到乙醇。在本质上，在发酵糖类为乙醇的情况下，通过将释放能水解纤维素的酶(纤维素酶)的真菌和细菌，和原则上通过酵母进行这些工艺。本发明的概念与自然过程一致。
这一策略不存在通过化学水解纤维素产生的毒素，且通过水解产物本身(葡萄糖和纤维素二糖)最小化酶抑制纤维素络合物。这一技术被称为SSF工艺(“同时糖化和发酵”)且牵涉酶水解和同时乙醇发酵。
相关现有技术
目前对保护环境的关注与日俱增。关于这一点，使用农业和工农业废物和寻找对自然界不那么有害的替代品和/或备选产品是全世界重要的主题。在牢记这一理念的情况下，寻找替代能源，并使用可产生经济可行产品和/或导致污染较少产品的农业和工农业废物。在替代资源的领域中，进行了许多尝试，以生产比较清洁的燃料，例如乙醇。
在巴西，鉴于合理利用这一木质纤维素材料的需求，糖乙醇工业的增长和因此生产大量的过量甘蔗渣产生非常有前景的情况。
由于环境和经济的兴趣，使用乙醇作为加入到汽油中的燃料或者作为生物柴油制造的起始材料令人眼花缭乱地增长，其中巴西是世界上最大的生产商之一。结果，巴西产生了巨大量的甘蔗渣，以及甘蔗杆，二者用于生物技术的乙醇生产具有显著大的潜力。
通过酶和发酵路线，由甘蔗渣生产乙醇使得能使用利用不足的材料生产具有巨大工业利益和经济与环境收益的产品。
在专业文献中描述了涉及使用纤维素部分的同时糖化和发酵技术(SSF工艺)且应用于各种目的以供生产化学品和燃料。然而，尚未以工业规模实施。
需要克服的主要难题涉及需要抗操作条件，特别是关于在反应介质内生成的抑制剂浓度，例如糠醛、羟甲基糠醛、重金属、萜烯类、单宁类和酚化合物等的微生物，所述抑制剂来自于预处理木质纤维素材料，它将抑制酵母的生长。
生物试剂固有的另一难题是利用来自于水解工艺(戊糖和己糖)的碳水化合物方面的局限性。这两个因素的结合导致长的发酵工艺，从而导致低的体积生产速度，而所述的体积生产速度是转移到工业规模上的基本的重要参数。
最近的大多数报道描述了使用针对特定应用开发、为避免这些问题而设计的基因修饰的微生物。
通过微生物技术生产乙醇进行了长期研究；然而，近年来显著增加。如前所述，待克服的较大障碍涉及生产速度，亦即实现经济可行的工艺，该工艺将使用可容易获得的起始材料来得到良好的产率。
Grohmann等人(US5125977)公开了其中两步预处理生物物质(农业、林业、植物和食品加工废物)，回收木糖的工艺。在第一步中，用稀酸(硫酸9％v/v)预水解基本上含xylane的半纤维素，和对残渣进行第二步酶水解，从而留下生物量反应足够长的时间以供纤维素缓慢水解。该方法的目的是回收xylane，以便约90％可水解，从而避免常规的生产木糖的工艺的局限性。该方法的缺点是，当使用苛刻的温度条件(160℃-220℃)时，形成许多物质，这些物质将抑制在发酵工艺中所使用的大多数微生物的新陈代谢。
专利文献GB2253633(对应于1992年1月15日的巴西专利PI9200100)公开了由生物量生产乙醇的方法，其中底物包括纤维素、半纤维素和淀粉的水解物，其目的是生产可发酵的6碳糖类。发酵使用基因修饰的酵母菌株(Brettanomyces custersil CBS 5512)，该菌株将产生酶β-葡糖苷酶(glucosidade)，从而使得这一酵母能发酵葡萄糖和纤维素二糖二者。然而，发酵戊糖的问题仍然没有解决。
美国专利US5231017公开了使用具有高固体含量的起始材料，例如玉米芯、谷物、谷类及其混合物，生产乙醇的方法。在这些起始材料内存在的淀粉与获自Bacillus lickenformis的商业α-淀粉酶(TAKA-THERM II
Figure A200780014315D0006135522QIETU
)接触，得到可发酵的液体介质，其中在由Aspergillus niger衍生的商业葡糖淀粉酶(DISTILLASE
Figure A200780014315D0006135522QIETU
)存在下糖化所述可发酵的液体介质，获得水解的淀粉和糖类，通过酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)发酵所述水解的淀粉和糖类，获得乙醇。尽管它使用同时糖化和发酵的技术，但这一方法不可能应用到甘蔗渣上。
Torget等人(US5705369)公开了预水解木质纤维素材料的通用方法，其中研究了温度和反应时间范围的不同结合，其目的在于获得从纤维素中较好百分数地分离半纤维素和木质素。在体系中测试了不同的温度(在120℃-240℃范围内)和pH(在1-7范围内)，其中在所述体系内，流体(预水解的可溶产物)流动通过固相(“径流过(flow-through)”体系)，并测定从该材料中提取的xylane和木质素含量。不那么苛刻的条件的结合得到木质素除去率5％的增加。
2006年2月8日的巴西专利申请PI0600409-1公开了由废物材料(硬木和谷类稻草)生产纤维素和半纤维素酶的方法。在采用基因修饰和重组木霉(Trichoderma reesei)菌株的情况下，这些废物材料用作碳源，以诱导这些酶。在诱导底物(例如纤维素)存在下，这一微生物的野生菌株可释放认为最容易纤维素水解的络合物。因此它是生产通过特定菌株产生的纤维素和/或半纤维素酶的方法。第一预处理步骤包括在酸性条件下蒸汽膨胀(150℃-250℃)数分钟，以便转化半纤维素成单体，其中木糖是主要的糖类。通过用水相洗涤，提取糖类，并将其用作碳源以供生产酶；来自提取的固体残渣含有纤维素和木质素，它们可通过所产生的纤维素酶水解。
以下将详细地描述的本申请的发明目的也涉及木质纤维素废物的用途，和更特别地涉及以在同一申请人于2005年11月11日的巴西专利申请PI0505299-8中通过酸水解半纤维素的方法预处理的固体甘蔗渣的用途。
发明内容
本发明涉及通过使用木质纤维素材料，通过在特定条件下快速同时糖化和发酵技术，获得燃料乙醇的方法，该方法较好地利用了纤维素部分并有效地生产乙醇。
更具体地，本发明的方法包括在酸水解甘蔗渣之后处理固体残渣。根据这一方法，通过用稀硫酸温和水解得到富含木糖的甘蔗渣中半纤维素部分的水解物，并使用合适地适应于水解物(木糖)内主要底物的酵母具柄毕赤氏酵母(Pichia stipitis)菌株发酵。仍在反应器内处理来自该酸水解的固体残渣(纤维木质素)，以便借助一系列的碱漂洗，除去木质素，而制备纤维素纤维，以接受合适的商业酶制剂。在天然存在的物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母菌株存在下，对部分去木质素化的材料进行快速糖化和发酵，以制备乙醇。
这一方法的主要优点是可由甘蔗渣获得乙醇，从而实现范围为1-3g/L.h的高体积的生产速度，在不需要基因修饰的情况下，实现天然存在酵母的所有新陈代谢潜力。
附图说明
图1是本发明方法的原则步骤的简化流程图。
图2是阐述采用本发明方法获得的结果的图表。
具体实施方式
本发明的目的是甘蔗渣的多糖部分的应用，所述甘蔗渣可在没有使用高的酶浓度情况下，用于生产乙醇作为燃料或汽油添加剂，或者作为化学起始材料，并在短的时间段内实施糖化和醇发酵。
为了更好地理解本发明，参考图1的流程图描述本发明，其中图1示出了本发明的优选实施方案。如图1所示，将含有木质纤维素材料的生物量(1)最初进行用稀酸(2)水解的工艺，该工艺将得到富含戊糖的半纤维素水解物(3)，它将发酵(4)产生乙醇和富含纤维素和木质素-纤维木质素的固体残渣(6)，随后蒸馏(5)乙醇。通过用碱溶液洗涤(7)，对这一残渣(6)进行预处理，随后进行酶水解工艺(糖化)(8)，释放葡萄糖，并同时采用酵母进行发酵工艺(9)，使葡萄糖发酵为乙醇，从发酵过的介质中分离所述乙醇并蒸馏(5)。
该工艺的第一阶段包括用1％硫酸温和水解甘蔗渣，以便优选获得戊糖，和特别是木糖(甘蔗渣中半纤维素部分的主要成分)。
在本发明申请人提交的巴西专利申请PI 0505299-8中详细地描述了第一阶段。均化纤维素材料并在专门的压力反应器内进行温和酸水解，其中所述反应器内主要的容器在1atm的压力下(相应于121℃的温度)，其持续时间合适地决定固体：液体之比，和通常在30-50分钟范围内。通过在反应器内挤压，从固体残渣中分离液相(水解物)，并在适用且适合于发酵介质的具柄毕赤氏(Pichia stipitis)酵母存在下进行发酵工艺，以获得乙醇。
然而，固体残渣仍然含有高含量的纤维素，需要水解所述纤维素为糖类，通过酿酒酵母菌株发酵，以产生乙醇。作为本发明目的的该方法相当于总工艺的第二阶段，以下由这一点起进行描述。
该工艺的第二阶段基本上包括处理固体残渣，亦即：
a)在碱性介质内预处理纤维素木质素，接着用水洗涤；
b)转移该残渣到生物反应器内以供该残渣在适中的温度下，在商业酶负载存在下酶水解(糖化)优选8-12小时的时间段；
c)通过添加适合于生产乙醇的酵母，同时发酵在前一步骤中水解的材料中的纤维素部分，维持酶的浓度最大32小时的时间段；
d)分离并蒸馏所产生的乙醇。
本发明工艺的主要优点是，它实现在显著大体积的生产速度下，在减少的时间内生产乙醇，这归因于所测试和优化的条件，从而导致经济收益，使得其商业实施可行。
现有技术的已知工艺尽管使用了通常修饰的微生物，但没有实现在这样短的时间内向乙醇的转化，且要求约3-5天。采用本发明的方法，在仅仅8小时的糖化和额外32小时发酵之后发现已经最大地产生乙醇。
该工艺的效率归因于苛刻地控制在其内牵涉的关键变量并测定最佳的操作条件。
为了更好地评价本发明的工艺，将描述本发明方法的优选实施方案，然而，仅仅通过阐述列出实施例。
实施本发明的优选模式
如前所述，该工艺的第一步牵涉酸水解木质纤维素材料，以便获得半纤维素水解物和固体部分。在以下的实施例1中概述了所采用的方法。
实施例1
该工艺的第一步是采用硫酸(1％v/v)水解，获得半纤维素水解物和固体部分，和使用最佳的固体：液体比值，酸水解半纤维素部分约40分钟。通过在针对PI 0502599-8中的工艺而专门开发的加压反应器内挤压，除去固体材料。用氢氧化钙中和水解物并过滤，并通过在生物反应器内在10g/L的浓度下使用的驯化(acclinzatized)生物量，在约30℃的温度下对所除去的液体水解物进行戊糖的发酵20-30小时。在水解物含量逐渐增加的情况下，通过按序细胞扩增，使生物量适应。在发酵最后，分离乙醇并蒸馏。
所得体积生产率的数量级为1.0g/L.h。
实施例2
根据本发明的方法处理在前一实施例中所述的反应器内分离的固体。来自这一步骤的固体富含纤维素，对其进行一系列的碱洗涤，同时仍然在该加压反应器内，以便部分除去可溶的木质素，一种抑制发酵工艺的芳族成分。这一步骤的根本重要之处在于它使得纤维素纤维接近酶的可能性达到尽量大的增加。
用碱溶液(NaOH4％w/v)洗涤通过在反应器内挤压分离的固体残渣，然后采用轻微酸化(HCl)的水进行连续洗涤，直到达到pH6-7，并返回到生物反应器内以供酶预处理。在生物反应器内，以1:10-20的比值，混合固体残渣与含微量营养素的水，同时维持温度在30℃-50℃范围内，和优选47℃，并在20-30FPU/g的浓度下，添加商业纤维素分解酶(GENENCOR
Figure A200780014315D0006135522QIETU
 GC 220)到这一混合物中，并允许反应进行8-12小时。紧跟着同时发酵该发酵介质，并在没有基因修饰的情况下，添加活性适合于乙醇生产的微生物-酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)。反应器内的温度维持在30℃-39℃范围内，和优选接近于37℃，且酵母细胞的浓度维持在2-6g/L范围内最大30-32小时的时间段。
纤维素转化成乙醇牵涉两个基本的步骤：纤维素分子的长链水解成糖类(己糖)，和发酵这些糖类成乙醇。
消除通过化学水解纤维素生成的有毒物质将使因其自身的水解产物(葡萄糖和纤维素二糖)导致的对纤维素酶络合物的酶活性的抑制最小化。本发明的工艺还使用本领域中称为SSF工艺的同时糖化和发酵技术。
获得50至55g/L的乙醇浓度，且所实现的生产率范围为1.5-2.0g/L.h。
在图2所示的浓度对时间所作的图表中列出了结果。
当采用该工艺的两个阶段时，转化成乙醇的转化率达到182L/吨甘蔗渣，这使得该工艺总体上显著经济可行，因为可降低第二阶段内转化的时间从4-5天降低到32小时。
然而应当强调，此处所列出的实施例在性质上仅仅是阐述，而不是限制本发明，且对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，可在本发明的范围内使用其他酶的制剂、用于商业或其他情况以及使用不同的酵母。

Claims (11)

1.由木质纤维素材料，例如甘蔗渣酶促生产乙醇的方法，该方法包括下述步骤：
a)对含纤维素和木质素的固体材料进行用碱溶液一次或更多次洗涤，从所述固体材料中至少部分除去该木质素，用水，优选用酸化水洗涤，和优选产生pH6-7，并优选借助过滤和优选在专门或其他加压反应器内使残留的固体材料与水相分离；然后
b)优选仍然在反应器内的同时，水解该固体材料，该步骤包括使固体材料与微量营养素和纤维素酶，优选添加的商业纤维素分解酶制剂的溶液反应，其中固体:液体之比为1:10到1:20，温度为30℃-50℃，酶的浓度为20-30FPU/g，和允许该反应进行8-32，优选8-30，更优选8-12小时；和
c)优选通过同时发酵进行来自于酶水解的介质的发酵，该步骤包括添加产生乙醇的酵母，其中该酵母具有2-6g/L的细胞浓度，和维持温度为30℃-39℃不超过32小时，优选30-32小时的时间段；然后
d)通过蒸馏分离乙醇。
2.权利要求1的方法，其中该酵母是非基因修饰的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)酵母。
3.权利要求1或2的方法，其中该工艺的生产率在1.0-3.0g/L.h范围内。
4.前述任何一项权利要求的方法，其中该工艺总的时间段为不大于32小时。
5.前述任何一项权利要求的方法，其中在45℃-49℃的温度下进行水解。
6.前述任何一项权利要求的方法，其中在35℃-39℃的温度下进行发酵。
7.前述任何一项权利要求的方法，其中步骤c)中酵母的生物量的浓度维持在2-6g/L范围内。
8.前述任何一项权利要求的方法，其中通过添加商业纤维素酶制剂，提供步骤b)中所提到的酶。
9.前述任何一项权利要求的方法，其中木质纤维素材料包括甘蔗渣。
10.前述任何一项权利要求的方法，其中进行同时糖化和发酵(SSF)。
11.由木质纤维素材料酶促生产乙醇的方法，该方法包括下述步骤：
i)水解和发酵木质纤维素材料，优选甘蔗渣，并保留固体材料；和
ii)在所述固体材料上进行前述任何一项权利要求的工艺。
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