MX2012004072A - Proceso para la hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) pretratamiento opcional, b) lavado opcional, c) hidrólisis enzimática, d) fermentación y e) recuperación opcional de un producto de fermentación; en donde en la etapa c) se utiliza una composición de enzima que tiene una temperatura óptima de 55°C o más, el tiempo de hidrólisis es 40 horas o más y la temperatura es de 50°C o más.

Description

PROCESO PARA LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO Y FERMENTACIÓN DE AZÚCARES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un proceso para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El material de planta lignocelulósico, también aquí llamado materia prima, es una fuente renovable de energía en la forma de azúcares que se pueden convertir en productos valiosos por ejemplo bio-combustible , tal como bio-etanol. Durante este proceso, la (ligno o hemi) -celulosa presente en la materia prima, tal como paja de trigo, rastrojo de maíz, cascarilla de arroz, etc., se convierte en azúcares reductores mediante las enzimas (hemi) -celulolíticas , que luego se convierten en productos valiosos tales como etanol mediante microorganismos como levadura, bacterias y hongos.

Debido a que la (hemi) -celulosa es cristalina y se encuentra atrapada en una red de lignina, la conversión en la reducción de azúcares es de manera general lenta e incompleta. Típicamente, la hidrólisis enzimática de la materia prima no tratada produce azúcares de < 20% de cantidad teórica. Al aplicar un pretratamiento químico y termo-físico, la (hemi)- celulosa es más accesible para las enzimas (hemi) -celulolíticas, y así las conversiones van más rápido y en mayor producción.

Una producción de etanol típica de glucosa, derivada de rastrojo de maíz pretratado, es 40 galones de etanol por 1000 kg de rastrojo de maíz seco [1] , o 0.3 g de etanol por g de materia prima. La producción máxima de etanol en base de celulosa base es aproximadamente 90%.

La mayor parte de las enzimas celulolíticas se producen mediante especies como Trichoderma, Humicola y Aspergillus-se utilizan comercialmente para convertir la materia prima pretratada en (hemi) celulosa insoluble que contiene masa insoluble, azúcares reductores hechos de esta, y lignina. Esta masa luego se utiliza en una fermentación durante lo cual los azúcares reductores se convierten en biomasa de levadura (células), dióxido de carbono y etanol. El etanol producido en esta forma es llamado bio-etanol.

La producción común de azúcares de materia prima lignocelulósica pretratada, la hidrólisis también llamada licuefacción, pre-sacarificación o sacarificación, típicamente tiene lugar durante un proceso final de 6 - 168 horas [2] [4] bajo temperaturas elevadas de 45-50°C [2] y condiciones no estériles. Durante esta hidrólisis, la celulosa presente en parte (típicamente 30-95%, dependiente de la actividad de enzima y condiciones de hidrólisis) se convierte en azúcares reductores. En el caso de la inhibición de las enzimas mediante los compuestos presentes en la materia prima pretratada y al liberar los azúcares; y para minimizar la inactivación térmica, este periodo de temperatura elevada se minimiza tanto como sea posible.

La fermentación luego de la hidrólisis tiene lugar en una etapa de proceso anaeróbico separado, en el mismo recipiente o en un recipiente diferente, en el que la temperatura se ajusta a 30-33 °C (proceso mesófilo) para acomodar el crecimiento y la producción de etanol mediante biomasa microbiana, comúnmente levaduras. Durante este proceso de fermentación, el material (hemi ) celulósico restante se convierte en azúcares reductores mediante las enzimas ya presentes de la etapa de hidrólisis, mientras se producen la biomasa microbiana y etanol. Este tipo de fermentación por lo tanto se denomina frecuentemente Sacarificación y Fermentación Simultánea, SSF. La fermentación se finaliza una vez el material (hemi) celulósico se convierte en azúcares fermentables y todos los azúcares fermentables se convierten en etanol, dióxido de carbono y células microbianas. Esto puede tomar hasta 6 días. Asi el tiempo de proceso general de hidrólisis y fermentación puede tardar hasta 7 días.

La masa fermentada así obtenida de azúcares no ferraentables , material (hemi) celulósico no hidrolizable , lignina, células microbianas (células de levadura más comunes) , agua, etanol, dióxido de carbono disuelto. Durante las etapas sucesivas, se destila etanol de la masa y se purifica adicionalmente . La suspensión sólida restante se seca y se utiliza como, por ejemplo, combustible quemado, fertilizante o piensos para el ganado. Con cada lote de materia prima, se agregan enzimas para maximizar el índice y producción de azúcares fermentables liberados de la materia prima ligno-celulósica pretratada durante el tiempo de proceso dado. En general, los costes para la producción de enzimas, la producción e inversiones de materia prima a etanol son factores de coste mayores en los costes de producción generales [2] . Hasta ahora, la reducción del coste de utilizar enzimas se logra al aplicar los productos de enzimas de una fuente microbiana única o de múltiples fuentes microbianas [7] con actividad hidrolítica más amplia y/o mayor (específica) que tiene como objetivo el uso de una enzima inferior necesaria, índices de conversión más rápidos y/o una mayor producción de conversión, y resulta así en menores costes generales de producción de bio-etanol.

Esto requiere grandes inversiones en investigación y desarrollo de productos enzimáticos. En el caso de un producto enzimático compuesto de múltiples enzimas de fuentes microbianas, se necesitan grandes inversiones de capital para la producción de cada compuesto enzimático único.

Por lo tanto es deseable mejorar el proceso anterior que implica hidrólisis y fermentación.

Se han utilizado enzimas celulolíticas termoestables derivadas de Talaromyces para degradar la materia prima ligno-celulósica y estas enzimas se conocen por su termoestabilidad en el documento de patente WO 2007091231 [3] . Sin embargo, no se da descripción de cómo optimizar el proceso de hidrólisis y fermentación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto un objeto de la invención es proporcionar un proceso en el que la etapa de hidrólisis y la etapa de fermentación se realizan a condiciones óptimas de temperatura. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso que implica hidrólisis y fermentación que tiene un tiempo de proceso reducido. El objeto adicional de la invención es proporcionar un proceso, en donde se puede reducir la dosificación de la enzima y al mismo tiempo la salida del producto de fermentación útil se mantiene al mismo nivel. Otro objeto es proporcionar un proceso en donde se reduce el riesgo de contaminación al contaminar los microorganismos. Otro objeto es proporcionar un proceso en donde se aumenta el contenido de materia seca. Otro objeto es proporcionar un proceso que implica hidrólisis y fermentación, en donde se optimizan las condiciones de proceso de la fermentación. Uno o más de estos objetos se logran de acuerdo con la invención. La presente invención proporciona un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) pretratamiento opcional b) lavado opcional; c) hidrólisis enzimática; d) fermentación; y e) recuperación opcional de un producto de fermentación; en donde en la etapa c) una composición de enzima se utiliza que tiene una temperatura óptima de 55°C o más, el tiempo de hidrólisis es 40 horas o más y la temperatura de hidrólisis es 50°C o más.

De forma sorprendente, de acuerdo con la invención, mediante la provisión de una composición de enzima que es estable y tiene una temperatura óptima de 55°C o más para la etapa de hidrólisis enzimática c) , es posible lograr cualesquier ventajas de proceso, que incluyen condiciones de temperatura óptimas, tiempo reducido de proceso, dosificación reducida de la enzima, riesgo reducido de contaminación, concentraciones mayores de materia seca, reutilización de las enzimas y otras optimizaciones de proceso, que resultan en costes reducidos.

En una realización de este proceso, el tiempo de fermentación es 18-120 horas. En una realización la composición estable de enzima utilizada retiene la actividad durante 30 horas o más. De acuerdo con una realización adicional la hidrólisis se conduce a una temperatura de 55°C o más. En una realización preferida, la composición de enzimas se deriva de un microorganismo del género Talaromyces. El proceso de la invención se ilustrará en más detalle adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la liberación en el tiempo de glucosa de 10% de suspensión de materia seca de la materia prima utilizando enzimas Talaro yces celulolíticas estables. La línea punteada superior indica el máximo teórico de glucosa que se puede liberar, con base en la composición de celulosa de la materia prima. La línea punteada inferior indica el nivel de 90% de conversión. A indica el momento que se logra el nivel de 90%.

La figura 2 muestra la liberación de la glucosa de azúcar reductor durante la hidrólisis de la materia prima ligno-celulósica pretratada en diferentes dosificaciones de enzimas Talaromyces (expresado como el volumen de la solución de enzima por cantidad de materia seca de materia prima) . La línea punteada indica el 90% de la cantidad teórica máxima de glucosa que se puede producir de la materia prima (90% de conversión) . A indica el momento que se logra 90% de hidrólisis con 0.175 mL de solución de enzima/g de materia prima de dosificación de materia seca; B indica el momento que se logra 90% de conversión con 0.075 mL de solución de enzima/g materia prima de dosificación de materia seca.

La figura 3 muestra la cantidad de azúcares que se libera durante 72 horas 60 °C de hidrólisis de materia prima si se utilizan enzimas Talaromyces recicladas. La gráfica muestra 5 ciclos de la enzima de reciclaje (experimento 2-6) . En cada ciclo la cantidad de enzimas recuperada del ciclo previo se utiliza para hidrolizar un nuevo lote de materia prima pretratada. No se agregan nuevas enzimas. La recuperación se hace al utilizar centrifugación y ultra filtración. La cantidad de azúcares liberados por ciclo se compara con la cantidad liberada en el experimento 1 en donde se utilizan las enzimas Talaromyces que no se reciclan.

La figura 4 muestra la liberación del azúcar de glucosa de reducción durante la hidrólisis de la materia prima ligno-celulósica pretratada en diferentes dosificaciones de la enzima Talaromyces (expresado como el volumen de la solución de enzima por cantidad de materia seca de materia prima) . Se muestran los resultados de 10% de p/p de materia seca de materia prima y 15% p.p de materia seca de materia prima.

La figura 5 muestra la cantidad total de la actividad de enzima, expresada por unidades de Sustrato, antes (muestras de referencia) y después de hidrólisis, fermentación y destilación por vacío de 10% de suspensión de la materia prima de materia seca en diversas dosificaciones de enzimas. Una enzima individual de sustrato libera un mmol del azúcar reductor.

La figura 6 muestra la liberación de glucosa durante hidrólisis con 0.20 (·) y 0.09 (¦) g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima (ejemplo 2) .

La figura 7 muestra la cantidad relativa de glucosa liberada de materia prima en diferentes dosificaciones de enzimas en vinaza delgada (ejemplo 4) .

La figura 8 establece el desempeño de la cepa BIE252 en fibra de maíz hidrolizada a 13.8% d.m. Se muestran el índice de producción de C02 , producción de etanol y conversión de azúcar .

La figura 9 establece el desempeño de la cepa BIE252 en rastrojo de maíz hidrolizado a 10% d.m. Se muestran el índice de producción de C02, producción de etanol y conversión de azúcar .

La figura 10 establece el desempeño de la cepa BIE252 en paja de trigo hidrolizada a 10% d.m. Se muestran el índice de producción de C02 , producción de etanol y conversión de azúcar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención ahora se describe en todas sus realizaciones, en más detalle.

Composición estable de enzima De acuerdo con la invención, en la etapa de hidrólisis, se utiliza una composición estable de enzimas, que tiene una temperatura óptima de 55 °C o más, preferiblemente de 60 °C o más, o de 65° o más. La temperatura óptima se determina al medir la actividad de la composición de enzimas en diferentes temperaturas y graficar la actividad contra la temperatura, y luego determinar la temperatura óptima es decir la temperatura en la que se encuentra la actividad principal.

La composición estable de enzima aquí significa que la composición de enzimas retiene la actividad después de 30 horas del tiempo de reacción de hidrólisis, preferiblemente por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de su actividad inicial después de 30 horas del tiempo de reacción de hidrólisis. Preferiblemente la composición de enzimas retiene la actividad después de 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas del tiempo de reacción de hidrólisis .

La composición de enzimas se puede derivar de un microorganismo. Una composición para uso en un proceso de la invención comprenderá actividades enzimáticas típicamente derivadas de un microorganismo fúngico saprofito de la clase Penicillium y del género Talaromyces, por ejemplo Talaromyces emersonii. Talaromyces emersonii también se puede denominar como Geosmithia emersonii o Penicillium emersonii. Talaromyces emersonii también se puede denominar como Talaromyces duponti y Penicillium duponti.

La composición de enzimas se puede preparar mediante la fermentación de un sustrato adecuado con el microorganismo, por ejemplo Talaromyces emersonii , en donde la composición de enzimas se produce por el microorganismo. Opcionalmente se utiliza un sustrato que induce la expresión de las enzimas en la composición de enzima.

La composición de enzimas se utiliza para liberar azúcares de lignocelulosa, que comprende polisacáridos . Los polisacáridos principales son celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ) . Adicionalmente, puede estar presente alguna hemicelulosa como glucomananos , por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, que incluyen monómeros y multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, rhamnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y ocurren otras hexosas y pentosas bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Adicionalmente , las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden hacer considerablemente proporción de la masa seca de paredes típicamente celulares de tejidos de planta sin madera (cerca de un cuarto de la mitad de la masa seca puede ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de residuos de glucosa ligados por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como también la estequiometría de la glucosa ligada a ß (con relación a a) genera estructuras más propensas a la unión de hidrógeno interhebras que las estructuras de almidón ligadas a altamente ramificadas. Así, los polímeros de celulosa son de manera general menos solubles, y forman fibras unidas más fuertemente que las fibras encontradas en el almidón.

Las enzimas que se pueden incluir en la composición de enzimas estable utilizad en la invención ahora se describen en más detalle: Las endoglucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de la celulosa insoluble a celooligosacáridos (celobiosa como un producto principal) , mientras que las ß- glucosidasas (BG) se convierten en oligosacáridos , principalmente celobiosa y celotriosa a glucosa.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición frecuentemente varía de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de hemicelulosa es xilosa ligada a ß-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa frecuentemente se ramifica a 0-3 y/o 0-2 átomos de xilosa, y se puede sustituir con enlaces a arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o mediante esterificación a ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico a arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para los seis azúcares de carbono ligados a ß (tales como los ß-(1,3) (1,4) glucanos y heteroglucanos mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que la glucosa y mañosa están presentes en la estructura principal lineal, ligadas entre sí por enlaces ß) .

Las xilanasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo OÍ-L- arabinofuranosidasas , feruloil y acetilxilan esterasas, glucuronidasas , y ß- xilosidasas) catalizan la hidrólisis de las hemicelulosas .

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular de la planta.

Estos se construyen alrededor de una cadena núcleo de unidades de D-ácido galacturónico ligadas a OÍ ( 1 , ) a algún grado con L-rhamnosa. En una pared celular existe un número de unidades estructurales que ajustan esta descripción y se ha considerado de manera general que en la molécula péctica única, las cadenas de núcleo de diferentes unidades estructurales son continuas entre sí.

Los tipos principales de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano) , que se puede sustituir con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2 y 0-3; rhamnogalacturonano I (RGI) , en el que las unidades de ácido galacturónico alternan con unidades de rhamnosa que llevan las cadenas laterales de galactano ligado a (1,4) y arabinano ligado a (1,5) . Las cadenas laterales arabinano se pueden unir directamente a rhamnosa o indirectamente a través de las cadenas galactano; xilogalacturonano, con unidades xilosilo únicas 0-3 de ácido galacturónico (cercanamente asociado con RGI) ; y rhamnogalacturonano II (RGII) , una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos residuos apiosilo que, bajo condiciones iónicas adecuadas, pueden formar reversiblemente de ésteres con borato.

Una composición para uso en un método de la invención comprende por lo menos dos actividades, aunque típicamente una composición comprenderá más de dos actividades, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más.

Típicamente, una composición de la invención puede comprender por lo menos una celulosa y por lo menos una hemicelulosa . Sin embargo, una composición de la invención puede comprender celulosas, pero no xilanasas.

Adicionalmente , una composición de la invención puede comprender la actividad de enzima auxiliar, es decir la actividad adicional que, directamente o indirectamente conduce a la degradación de lignocelulosa . Se mencionan aquí ejemplos de tales actividades auxiliares.

Así, una composición para uso en la invención puede comprender actividad endoglucanasa y/o actividad celobiohidrolasa y/o actividad ß-glucosidasa . Una composición para uso en la invención puede comprender más de una actividad de enzima en una o más de aquellas clases. Por ejemplo, una composición para uso en la invención puede comprender dos actividades endoglucanasa, por ejemplo, actividad endo- 1 , 3 ( 1 , 4 ) - ß glucanasa y actividad endo-p-l,4-glucanasa. Tal composición también puede comprender una o más actividades xilanasa. Tal composición puede comprender una actividad de enzima auxiliar.

Una composición para uso en la invención se puede derivar de Talaromyces emersonii. En la invención, se anticipa que un conjunto núcleo de (degradación de lignocelulosa) actividades de enzimas se puede derivar de Talaromyces emersonii . Talaromyces emersonii puede proporcionar un conjunto altamente efectivo de actividades como se demuestra aquí para la hidrólisis de biomasa Ügnocelulósica . Esta actividad luego se puede complementar con actividades adicionales de enzima de otras fuentes. Tales actividades adicionales se pueden derivar de fuentes clásicas y/o se producen por un organismo genéticamente modificado.

Las actividades en una composición para uso en la invención pueden ser termostables . Aquí, esto significa que la actividad tiene una temperatura óptima de 40 °C o más, por ejemplo aproximadamente 50°C o más, tal como aproximadamente 60 °C o más, por ejemplo aproximadamente 70 °C o más, tal como aproximadamente 75 °C o más, por ejemplo aproximadamente 80 °C o más tal como 85°C o más. Las actividades en una composición para uso en la invención no tendrán típicamente la misma temperatura óptima, pero preferiblemente, no obstante, será termostable .

Adicionalmente , las actividades de enzima en una composición para uso en la invención puede ser capaz de trabajar a pH bajo. Para los propósitos de esta invención, el H bajo indica un pH de aproximadamente 5.5 o menos, aproximadamente 5 o menos , aproximadamente 4.9 o menos , aproximadamente 4.8 o menos, aproximadamente 4.7 o menos, aproximadamente 4.6 o menos, aproximadamente 4.5 o menos, aproximadamente 4.4 o menos, aproximadamente 4.3 o menos, aproximadamente 4.2 o menos, aproximadamente 4.1 o menos, aproximadamente 4.0 o menos aproximadamente 3.9 o menos , o aproximadamente 3.8 o menos, aproximadamente 3.7 o menos, aproximadamente 3.6 o menos , o aproximadamente 3.5 o menos .

Las actividades en una composición para uso en la invención se pueden definir mediante una combinación de cualquiera de las temperaturas óptimas y los valores de pH anteriores .

La composición utilizada en un método de la invención puede comprender, además de las actividades derivadas de Talaromyces, una celulosa (por ejemplo una derivada de una fuente derivada de Talaromyces) y/o una hemicelulosa (por ejemplo una derivada de una fuente diferente de Talaromyces) y/o una pectinasa.

Una composición para uso en la invención puede comprender una, dos, tres, cuatro clases o más de celulosa, por ejemplo una, dos tres o cuatro o todos de una endoglucanasa (EG) , una o dos exo-celobiohidrolasas (CBH) y una ß- glucosidasa (BG) .

Una composición para uso en la invención puede comprender dos o más de cualquiera de estas clases de celulosa.

Se sabe que la enzima de ß- glucosidasa natural a Talaromyces es muy activa, el valor Vmax para la ß-glucosidasa Talaromyces Cel3a es 512IU/mg que es considerablemente más que los valores reportados para las ß-glucosidasas de otras fuentes fúngicas (P. Murray et al. / Protein Expression and Purification 38 (2004) 248-257) . A pesar de la alta actividad de la ß-glucosidasa en las composiciones de acuerdo con la invención, y los niveles altos de glucosa logrados, no ocurre inhibición en glucosa.

Esto es ventajoso debido a las altas actividades y altos niveles de glucosa se pueden combinar utilizando las composiciones de acuerdo con la invención.

Una composición de la invención puede comprender una actividad que tiene un tipo diferente de actividad de celulosa y/o actividad de hemicelulosa y/o actividad de pectinasa que se proporciona por la composición para uso en un método de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de celulosa y/o actividad de hemicelulosa y/o actividad de pectinasa proporcionada a una composición como se describe aquí y un segundo tipo de celulosa y/o actividad de hemicelulosa y/o actividad de pectinasa proporcionada por una celulosa/hemicelulosa/pectinasa adicional .

Aquí, una celulosa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la celulosa en unidades más pequeñas, parcialmente, por ejemplo en celodextrinas , o completamente en monómeros de glucosa. Una celulosa de acuerdo con la invención puede surgir en una población mezclada de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se ponen en contacto con la celulosa. Tal degradación típicamente tomará lugar por medio de una reacción de hidrólisis .

Aquí, una hemicelulosa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la hemicelulosa. Es decir, una hemicelulosa puede ser capaz de degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano , glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos , o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulosa de acuerdo con la invención puede surgir a una población mezclada de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulosa. Tal degradación típicamente tomará lugar por medio de una reacción de hidrólisis.

Aquí, una pectinasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradación pectina en unidades más pequeñas, parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede surgir a una población mezclada de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradación típicamente tomará lugar por medio de una reacción de hidrólisis.

De acuerdo con lo anterior, una composición de la invención puede comprender cualquier celulosa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-3-l,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) ( 1 , 4 ) -glucanasa .

Aquí, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß -D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, que libera la celobiosa de los finales de las cadenas. Esta enzima también se puede denominar como celulosa 1,4-ß-celobiosidasa, 1 , 4 - ß-celobiohidrolasa, 1 , 4 - ß-D-glucan celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1 , 4 - ß-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa.

Aquí, una endo- ß -1 , 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - -D-glucosídicos en celulosa, lichenina o ß-D-glucanos de cereal. Tal polipéptido que también puede ser capaz de hidrolizar los enlaces 1,4 en ß-D-glucanos contiene enlaces 1,3. Esta enzima también se puede denominar como celulosa, avicelasa, ß-1 , 4-endoglucan hidrolasa, ß-1,4-glucanasa, carboximetil celulosa, celudextrinasa , ß???-1,4-ß-D-glucanasa, endo-1, ^-D-glucanohidrolasa, ????-1,4-ß-glucanasa o endoglucanasa .

Aquí, una ß -glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de terminal, residuos de ß-D-glucosa sin reducción con liberación de ß-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una amplia especificidad para las ß-D-glucosidas y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: a ß-D-galactosida, una a-L-arabinosida, una ß-D-xilosida o una ß-D-fucosida.

Esta enzima también se puede denominar como amigdalasa, ß-D-glucosida glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.

Aquí una ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4 ) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3- y 1,4. Tal polipéptido puede actuar en lichenina y ß-D-glucanos de cereales, pero no en ß-D-glucanos que contienen solo enlaces 1,3- o 1,4. Esta enzima también se puede denominar como licheninasa, 1,3-1,4-ß-?-glucan 4 -glucanohidrolasa , ß-glucanasa, endo-ß-?, 3-1, 4 glucanasa, lichenasa o ß-glucanasa de ligado mezclado. Una alternativa para este tipo de la enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1, 3 (4) -beta-glucanasa. Este tipo de enzima hidroliza los enlaces 1,3- o 1,4 en beta-D-glucanasa cuando el residuo glucosa cuyo grupo de reducción está implicado en el ligado que se va a hidrolizar en sí mismo sustituido a C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1 , 3 -beta-glucanasa, laminarinasa, 1 , 3 - ( 1 , 3 ; 1 , 4 ) -beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, lichenina y beta-D-glucanos de cereal.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulosa, por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa , una OÍ-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, un feruloil esterasa, una coumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß -manosidasa .

Aquí, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß -D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también se puede denominar como endo-1 , 4 - ß-xilanasa o 1 , 4 - ß-D-xilano xilanoohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar los enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos .

Aquí, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-ß-D-xilanos, para retirar los residuos sucesivos de D-xilosa del terminal de no reducción. Tales enzimas también pueden hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima también se puede denominar como xilano 1, 4^-xilosidasa, l,4- -D-xilano xilohidrolasa, exo-1 , 4 - -xilosidasa o xilobiasa.

Aquí, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar en a-L-arabinofuranosidas , a-L-arabinanos que contiene los enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también se puede denominar como oí-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, una -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronosida + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también se puede denominar como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas también pueden hidrolizar el ácido glucurónico 4-O-metilado, que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. La alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-1,2- (4-O-metil) glucuronosilo .

Aquí, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Tal polipéptido puede catalizar la hidrólisis de los grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato o p-nitrofenil acetato pero, típicamente, no de triacetilglicerol . Tal polipéptido típicamente no actúa en mañano o pectina acetilada.

Aquí, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Este típicamente puede catalizar la hidrólisis del grupo 4 -hidroxi- 3 -metoxicinnamoilo (feruloilo) de un azúcar esterificado, que es usualmente arabinosa en sustratos 'naturales'. p-nitrofenol acetato y metil ferulato son típicamente sustratos más pobres. Esta enzima también se puede denominar como hidrolasa cinamoil éster, esterasa de ácido ferúlico o esterasa hidroxicinamoilo . También se puede denominar como una enzima accesora hemicelulosa, debido a que puede ayudar a las xilanasas y pectinasas para descomponer la hemicelulosa y pectina de la pared celular de la planta.

Aquí, una coumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: coumaroil-sacárido + H(2)0 = coumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligpsacárido o un polisacárido . Esta enzima también se puede denominar como trans-4 -coumaroil esterasa, trans-p-coumaroil esterasa, p-coumaroil esterasa o esterasa de ácido p-coumárico. Esta enzima que también cae dentro de EC 3.1.1.73 también se puede denominar como una feruloil esterasa.

Aquí, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de terminal, los residuos de -D-galactosa sin reducción en -D-galactosidasa, que incluyen galactosa oligosacáridos , galactomananos , galactanos y arabinogalactanos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar las a-D-fucosidas. Esta enzima también se puede denominar como melibiasa .

Aquí, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de terminal de los residuos de ß-D-galactosa sin reducción en ß-D-galactosidas . Tal polipéptido también es capaz de hidrolizar las a-L-arabinosidas . Esta enzima también se puede denominar como exo- ( 1- >4 ) - ß-D-galactanasa o lactasa.

Aquí, una ß-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , 4 - ß-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos . Esta enzima también se puede denominar como manan endo-1, 4- -manosidasa o endo- 1, 4-mananasa.

Aquí, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de terminal, residuos ß-D-manosa sin reducción en ß-D-manosidas . Esta enzima también se puede denominar como mananasa o manasa.

Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectin metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectin acetil esterasa, una endo-pectin liasa, pectato liasa, alfa rhamnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una rhamnogalacturonan hidrolasa, una rhamnogalacturonan liasa, una rhamnogalacturonan acetil esterasa, una rhamnogalacturonan galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa .

Aquí, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , 4 -a-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos . Esta enzima también se puede denominar como poligalacturonasa pectin despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectin hidrolasa, pectin poligalacturonasa, poli-a-1 , 4 -galacturonida glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli (1, -a-D-galacturonida) glicanohidrolasa.

Aquí, una pectin metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima también se puede conocer como pectinesterasa, pectin demetoxilasa, pectin metoxilasa, pectin metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectin pectilhidrolasa.

Aquí, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-ß-D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima también se puede conocer como arabinogalactan endo- 1 , - ß -galactosidasa, endo-1, 4 - ß-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactan 4 - ß -D-galactanohidrolasa .

Aquí, una pectin acetil esterasa se define aquí como cualquier enzima que tiene una actividad acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos GalUA de pectina.

Aquí, una endo-pectin liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la división eliminativa de metil éster (1 4 ) - -D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-a- D-galact-4-enuronosilo en sus extremos sin reducción. La enzima también se puede conocer como pectin liasa, pectin trans-eliminasa; endo-pectin liasa, transeliminasa polimetilgalacturónico, pectin metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 4)-6-0-metil-a-D-galacturonan liasa.

Aquí, un pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la división eliminativa de (1 4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4 -enuronosilo en sus extremos sin reducción. La enzima también · se conoce como transeliminasa poligalacturónico, transeliminasa de ácido péptico, poligalacturonato liasa, endopectin metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, liasa de ácido péctico, liasa péctica, liasa de ácido OÍ-1,4-D-endopoli galacturónico , liasa PGA, PPasa-N, liasa de ácido endo-a-1, -poli galacturónico, liasa de ácido poli galacturónico, pectin trans-eliminasa, trans-eliminasa de ácido poli galacturónico o (1 4 ) -a-D-galacturonan liasa.

Aquí, una alfa rhamnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos terminales a-L-rhamnosa sin reducción en a-L-rhamnosidas o alternativamente en rhamnogalacturonano . Esta enzima también se puede conocer como a-L-rhamnosidasa T, ot-L-rhamnosidasa N o a-L- rhamnosida rhamnohidrolasa .

Aquí, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de la hidrólisis del ácido péptico del extremo sin reducción, que libera digalacturonato . La enzima también se puede conocer como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

Aquí, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1, 4-a-D-galacturonida) n + H20 = (1, 4 -a-D-galacturonida) n-1 + D-galacturonato . La enzima también se puede conocer como galacturan 1,4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli (1 , 4-a-D-galacturonida) galacturonohidrolasa .

Aquí, la exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la división eliminativa de 4- (4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato del extremo de reducción de pectato, es decir. Pectina desesterificada. Esta enzima se puede conocer como disacárido-liasa pectato, exo-liasa pectato, transeliminasa de ácido exopéctico, exopectato liasa, ácido exopoli galacturónico- trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido-liasa de extremo de reducción (1 4)-a-D-galacturonano .

Aquí, la rhamnogalacturonan hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y rhamnopiranosilo en una forma endo en estructuras rhamnogalacturonano estrictamente alternantes, que consiste del disacárido [ácido (1,2-alfa-L-rhamnoil- ( 1 , 4 ) -alfa-galactosilurónico] .

Aquí, la liasa rhamnogalacturonano es cualquier polipéptido que es cualquier polipéptido que es capaz de dividir los enlaces a-L-Rhap- (1 4)-a-D-GalpA en una forma endo en rhamnogalacturonano por eliminación beta.

Aquí, la acetil esterasa rhamnogalacturonano es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación de la estructura principal de rhamnosa alternante y residuos de ácido galacturónico en rhamnogalacturonano.

Aquí, galacturonohidrolasa rhamnogalacturonano es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el ácido galacturónico del extremo sin reducción de las estructuras rhamnogalacturonano estrictamente alternantes en una forma exo .

Aquí, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa en xilogalacturonano al dividir la estructura principal de ácido galacturónico sustituido por ß-xilosa en una forma endo. Esta enzima también se puede conocer como hidrolasa xilogalacturonano .

Aquí, una -L- arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar en las a-L-arabinofuranosidas , a-L-arabinanos que contiene los enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también se puede denominar como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, la endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1, 5- -arabinofuranosídicos en 1, 5-arabinanos . La enzima también se puede conocer como endo-arabinasa, arabinan endo-1, 5-a-L-arabinosidasa, endo-1 , 5-a-L-arabinanasa, endo-a-1, 5-arabanasa; endo-arabanasa o 1 , 5 - -L-arabinan 1,5-a-L-arabinanohidrolasa .

Una composición de la invención comprenderá típicamente por lo menos una celulosa y/o por lo menos una hemicelulosa y/o por lo menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa . Tal composición también puede comprender una o más hemicelulosas y/o una o más pectinasas .

Adicionalmente , uno o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todos) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa, una glucuronidasa o una expansina o una proteína inducida por celulosa o una proteína que integra celulosa o proteína similar puede estar presente en una composición de la invención (estos se denominan como las actividades auxiliares anteriores) .

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan los enlaces de péptido (peptidasas) , así como también enzimas que hidrolizan los enlaces entre péptidos y otras unidades estructurales, tal como azúcares (glicopeptidasas) . Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para uso en la invención incorporada aquí como referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, proteasas de cisteína que incluyen proteasas pepsina, papaína y serina que incluyen quimotripsionas , carboxipeptidasas y metalloendopeptidasas.

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos, y acilglicéridos , que incluye fosfoglicéridos , lipoproteínas , diacilgliceroles , y similares. En las plantas, se utilizan lípidos como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como también cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o descomponer la estructura de los polímeros lignina. Las enzimas que se pueden descomponer la lignina incluyen peroxidasas de lignina, peroxidasas de manganeso, laccasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocidas para despolimerizar o de otra forma descomponer los polímeros lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar los enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (notablemente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan a las siguientes enzimas: peroxidasas lignina (EC 1.11.1.14), peroxidasas manganeso (EC 1.11.1.13), laccasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de catalizar una reacción de transferasa, pero que también pueden catalizar una reacción de hidrólisis, por ejemplo de celulosa y/o productos de degradación de celulosa. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede utilizar en la invención es una ß-glucanosiltransferasa . Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3) (l,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de una glucoronosida, por ejemplo ß -glucuronosida para producir un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para uso en la invención, por ejemplo ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil -disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrhizinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición para uso en la invención puede comprender una expansina o proteína similar a expansina, tal como una swollenina (ver Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) o una proteína similar a swollenina.

Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de las células de planta. Se ha propuesto que las expansinas interrumpen la unión de hidrógeno entre celulosa y otros polisacáridos de pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta forma, se considera que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el alargamiento de la pared celular. La swollenina, una proteína similar a expansina contiene un dominio de la Familia 1 del Módulo de Unión a Carbohidrato de terminal N (CBD) y un dominio similar a expansina de terminal C. Para los propósitos de esta invención, una proteína similar a expansina o una proteína similar a swollenina puede comprender uno o ambos de tales dominios y/o puede interrumpir la estructura de las paredes celulares (tal como interrumpir la estructura de celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores .

Una composición para uso en la invención puede ser una proteína inducida por celulosa, por ejemplo el producto de polipéptido del gen cipl o cip2 o genes similares (ver Foreman et al., J. Biol . Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), una 'proteína que integra celulosa/celulosoma, por ejemplo el producto de polipéptido del gen cipA o cipC, o una escafoldina o una proteína similar a escafoldina. Las escafoldinas y las proteínas que integran celulosa son subunidades de integración multi-funcional que pueden organizar las subunidades celulolíticas en un complejo multi -enzima. Esto se lleva a cabo mediante la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir un dominio de cohesión en escafoldina y un dominio de doquerina en cada unidad enzimática. La subunidad escafoldina también lleva un módulo de unión a celulosa (CBM) que media la adhesión de la celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína que integra celulosa para los propósitos de esta invención puede comprender uno o ambos de tales dominios .

Una composición para uso en un método de la invención se puede componer de un miembro de cada una de las clases de las enzimas mencionadas anteriormente, diversos miembros de una clase de enzima, o cualquier combinación de estas clases de enzimas o proteínas auxiliares (es decir aquellas proteínas mencionadas aquí que no tienen actividad enzimática per se, pero no obstante puede asistir en la degradación lignocelulósica) .

Una composición para uso en un método de la invención se puede componer de las enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) enzimas que expresan los genes clonados; (3) caldo de cultivo complejo (tal como aquellos resultantes del crecimiento de una cepa microbiana en el medio, en donde las cepas secretan proteínas y enzimas dentro del medio; (4) lisados celulares de las cepas crecen en (3) ; y/o (5) enzimas que expresan el material de planta. Se pueden obtener diferentes enzimas en una composición de la invención de diferentes fuentes.

Las enzimas se pueden producir exógenamente en los microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego se aislan y se agregan, por ejemplo, a la materia prima lignocelulósica. Alternativamente, las enzimas se producen, perp no se aislan, y el caldo de cultivo de fermentación de masa celular- cruda, o material de planta (tal como rastrojo de maíz o paja de trigo) , y similares se pueden agregar a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción de enzima o material de planta se pueden tratar para evitar el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o la adición de los agentes antimicrobianos) , luego se agrega a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzima cruda pueden incluir el organismo que produce la enzima .

Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que utiliza la materia prima (pre-tratada) (tal como rastrojo de maíz o paja de trigo) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima. En esta forma, las plantas que producen las enzimas pueden en sí mismas servir como una materia prima lignocelulósica y se agregan en la materia prima lignocelulósica.

En los usos y métodos descritos aquí, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar concomitantemente (es decir como una composición per se) o separadamente o secuencialmente .

La invención así se relaciona con métodos en los que la composición descrita anteriormente se utiliza y con usos de la composición en procesos industriales.

Material ligno-celulósico El material lignocelulósico aquí incluye cualquier material lignocelulósico y/o hemicelulósico . El material lignocelulósico adecuado para uso como materia prima en la invención incluye biomasa, por ejemplo biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, orgánicos comerciales, residuos de construcción y demolición, desperdicio sólido municipal, residuos de papel y desechos de jardín. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, miscanto, maíz, rastrojo de maíz, cascaras de maíz, granos de maíz, tallos de cañóla, tallos se soja, sorgo dulce, mazorcas de maíz que incluye fibra de mazorcas, productos y subproductos de molido de granos tales como maíz, trigo y cebada (que incluye molido húmedo y molido seco) frecuentemente llamado "salvado o fibra" así como también desperdicio sólido municipal, residuos de papel y desechos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, desperdicios sólidos municipales, residuos de papel, y pulpa y residuos de papel molido. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, cáscaras de maíz y maíz, cultivos energéticos, residuos forestales, frutos, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, acículas, troncos, raíces, vastagos, cultivos de madera de rotación corta, arbustos, pasto varilla, árboles, vegetales, cáscaras de frutas, vinos, pulpa de remolacha azucarera, molidos de trigo, cáscaras de avena, y maderas duras y blandas (no que incluye maderas con materiales perjudiciales) . Adicionalmente , la biomasa agrícola incluye materiales de desperdicio orgánico generados de procesos agrícolas que incluyen actividades forestales y de granja, que incluye específicamente desperdicio de madera forestal .

La biomasa agrícola puede ser de cualquier singular o en cualquier combinación o mezcla de los mismos mencionada anteriormente .

Pre- tratamiento La materia prima se puede pretratar opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métodos con el fin de mejorar la accesibilidad del sustrato para hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, en cualquier forma conocida en la técnica. En una realización, el pretratamiento se conduce al tratar la lignocelulosa con explosión de vapor, tratamiento de agua caliente o tratamiento con ácido diluido o base diluida .

Etapa de lavado Opcionalmente, el proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de lavado. La etapa de lavado opcional se puede utilizar para retirar compuestos solubles en agua que pueden actuar como inhibidores para la etapa de fermentación. La etapa de lavado se puede conducir en forma conocida.

Hidrólisis enzimática El proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de hidrólisis enzimática. La hidrólisis enzimática incluye, pero no se limita a, hidrólisis para el propósito de licuefacción de la materia prima e hidrólisis para el propósito de liberar azúcar de la materia prima o ambos. En esta etapa pretratar opcionalmente y lavar opcionalmente el material ligno-celulósico se pone en contacto con la composición de enzimas de acuerdo con la invención.

Dependiendo del material lignocelulósico y el pre-tratamiento, las diferentes condiciones de reacción, por ejemplo temperatura, dosificación de enzima, tiempo de reacción de hidrólisis y concentración de materia seca, se puede adaptar por la persona experta con el fin de lograr una conversión deseada de lignocelulosa a azúcar. Se dan adelante algunas indicaciones.

En un aspecto de la invención la hidrólisis se conduce a una temperatura de 50°C o más, 55°C o más, 60°C o más, 65°C o más, o 70°C o más. La alta temperatura durante hidrólisis tiene muchas ventajas, que incluyen trabajo a la temperatura óptima de la composición de enzima, la reducción del riesgo de contaminación (bacteriano) , viscosidad reducida, cantidad más pequeña de agua fría requerida, uso de agua fría con una temperatura mayor, reutilización de las enzimas y más.

En un aspecto adicional de la invención, la cantidad de la composición de enzimas agregada (aquí también llamada dosificación de enzima o carga de enzima) es baja. En una realización la cantidad de la enzima es 6 mg de proteína / g de peso de materia seca o menos, 5 mg de proteína / g de materia seca o menor, 4 mg de proteína / g de materia seca o menor, 3 mg de proteína / g de materia seca o menor, 2 mg de proteína / g de materia seca o menor, o 1 mg de proteína / g de materia seca o menor (expresado como proteína en mg de proteína / g de materia seca) . En una realización, la cantidad de la enzima es 0.5 mg enzima / g de peso de materia seca o menos, 0.4 mg la composición de enzimas / g de peso de materia seca o menos, 0.3 mg enzima / g de peso de materia seca o menos, 0.25 mg enzima / g de peso de materia seca o menos, 0.20 mg enzima / g de peso de materia seca o menos, 0.18 mg enzima / g de peso de materia seca o menos, 0.15 mg enzima / g de peso de materia seca o menos o 0.10 mg enzima / g de peso de materia seca o menos (expresado como el total de las enzimas de celulosa en mg de enzima / g de materia seca) . La dosificación baja de enzima es posible, debido a la actividad y estabilidad de las enzimas, es posible aumentar el tiempo de reacción de hidrólisis.

En un aspecto adicional de la invención, el tiempo de reacción de hidrólisis es 40 horas o más, 50 horas o más, 60 horas o más, 70 horas o más, 80 horas o más, 90 horas o más, 100 horas o más, 120 horas o más, 130 h o más. En otro aspecto, el tiempo de reacción de hidrólisis es 40-130 horas, 50-120 horas, 60-120 horas, 60-110 horas, 60-100 horas, 70-100 horas, 70-90 horas o 70-80 horas. Debido a la estabilidad de la composición enzimática son posibles mayores tiempos de reacción de hidrólisis con el correspondiente aumento de rendimiento de azúcar.

El pH durante hidrólisis se pude seleccionar por la persona experta. En un aspecto adicional de la invención, el pH durante la hidrólisis puede ser 3.0 - 6.4. Las enzimas estables de la invención pueden tener un rango de pH amplio de hasta 2 unidades de pH, hasta 3 unidades de pH, hasta 5 unidades de pH. El pH óptimo se puede encontrar dentro de los límites de pH 2.0 a 8.0, 3.0-8.0, 3.5-7.0, 3.5-6.0 3.5-5.0, 3.5-4.5, 4.0-4.5 o es aproximadamente 4.2.

En un aspecto adicional de la invención la etapa de hidrólisis c) se conduce hasta 70% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 92% o más, 95% o más de azúcar disponible en material lignocelulósico liberado.

De forma significativa, se puede llevar a cabo un proceso de la invención utilizando altos niveles de materia seca (del material lignocelulósico) en la reacción de hidrólisis. Así, la invención se puede llevar a cabo con un contenido de materia seca de aproximadamente 5% o más , aproximadamente 8% o más , aproximadamente 10% o más , aproximadamente 11% o más , aproximadamente 12% o más , aproximadamente 13% o más , aproximadamente 14% o más , aproximadamente 15% o más , aproximadamente 20% o más , aproximadamente 25% 0 más , aproximadamente 30% o más , aproximadamente 35% < ? más o aproximadamente 40% ¦ o más . En una realización adicional, el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% , 20%, 1%, 22*?; 23~Ó, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31% , 32%, 33% (p/dmw) o más o 14-33%. La abreviatura dmw aquí significa "peso de materia seca", los pesos se expresan en g (gramos) .

Fermentación El proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de fermentación d) . En un aspecto adicional, la invención incluye así en la etapa d) los procesos de fermentación en ÍQS que se utiliza un microorganismo para la fermentación de una fuente de carbón que comprende azúcares, por ejemplo glucosa, L-arabinosa y/o xilosa. La fuente de carbón puede incluir cualquier oligo o polímero de carbohidrato que comprende unidades de L-arabinosa, xilosa o glucosa, tales como por ejemplo lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, arabinano y similares. Para la liberación de las unidades de xilosa o glucosa de tales carbohidratos, las carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) se pueden agregar al medio de fermentación o se pueden producir mediante la célula anfitriona modificada. En el último caso la célula anfitriona modificada se puede construir genéticamente por ingeniería para producir y excretar tales carbohidrasas. Una ventaja adicional de utilizar las fuentes oligo- o poliméricas de glucosa es que permite mantener una concentración menor de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo al utilizar cantidades limitantes del índice de las carbohidrasas. Esto, a su vez, evitará la represión de los sistemas requeridos para el metabolismo y transporte de azúcares sin glucosa tales como xilosa. En un proceso preferido los fermentos de célula anfitriona modificada y L-arabinosa (opcionalmente xilosa) y glucosa, preferiblemente simultáneamente en cuyo caso se utiliza preferiblemente una célula anfitriona modificada que es insensible a la represión de glucosa para evitar el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de L-arabinosa, opcionalmente xilosa (y glucosa) como fuente de carbón, el medio de fermentación comprenderá adicionalmente el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula anfitriona modificada. Son bien conocidas en la técnica- las composiciones del medio de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras u hongos filamentosos.

El tiempo de fermentación puede ser más corto en fermentación convencional en las mismas condiciones, en donde parte de hidrólisis enzimática aún tiene que tomar parte durante la fermentación. En una realización, el tiempo de fermentación es 100 horas o menos, 90 horas o menos, 80 horas o menos, 70 horas o menos, o 60 horas o menos, para una composición de azúcar de 50g/l de glucosa y que corresponde a otros azúcares de la materia prima lignocelulósica (por ejemplo 50 g/1 de xilosa, 35 g/1 de L-arabinosa y 10 g/1 de galactosa. Para composiciones de azúcar más diluidas el tiempo de fermentación se puede reducir en forma correspondiente .

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico aquí se define como un proceso de fermentación que corre en la ausencia de oxígeno o en el que no se consume sustancialmente oxígeno, preferiblemente menos 5, 2.5 o 1 mmol/L/h, se consume más preferiblemente 0 mmol/L/h (es decir el consumo de oxígeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven como donantes de electrones y receptores de electrones. En la ausencia de oxígeno, el NADH producido en glicólisis y la formación de biomasa, no se puede oxidar mediante fosforilación oxidativa .

Para resolver este problema muchos microorganismos utilizan piruvato o uno de sus derivados como un electrón y receptor de hidrógeno regenerando por lo tanto el NAD+ . Así, en un proceso de fermentación anaeróbico preferido se utiliza piruvato como un electrón (y receptor de hidrógeno) y se reduce para los productos de fermentación tales como etanol, ácido láctico, ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1 , 3 -propano-diol , etileno, glicerol, butanol, antibióticos ß-lactama y una cefalosporina . En una realización preferida, el proceso de fermentación es anaeróbico. Un proceso anaeróbico es ventajoso debido a que es más barato que los procesos aeróbicos : se necesita equipo menos especial. Adicionalmente , se espera que los procesos anaeróbicos de un rendimiento dé producto mayor que los procesos aeróbicos. Bajo condiciones aeróbicas, usualmente la producción de biomasa es más baja que las condiciones anaeróbicas. Como consecuencial , usualmente bajo condiciones aeróbicas, el rendimiento de producto esperado es menor que bajo condiciones anaeróbicas.

En otra realización, el proceso de fermentación es bajo condiciones limitadas de oxígeno. Más preferiblemente, el proceso de fermentación es aeróbico y bajo condiciones limitadas de oxígeno. Un proceso de fermentación limitado de oxígeno es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina mediante la cantidad y composición del flujo de gas que entra así como también las propiedades de transferencia de mezcla/masa reales del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxígeno, el índice de consumo de oxígeno es por lo menos 5.5, más preferiblemente por lo menos 6 y aún más preferiblemente por lo menos 7 mmol/L/h. El proceso de fermentación preferiblemente corre a una temperatura que es óptima para la célula modificada. Así, para la mayoría de levaduras o células fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es menor de 42° C, preferiblemente menor de 38° C. Para las células anfitrionas de levadura u hongo filamentoso, el proceso de fermentación se realiza preferiblemente a una temperatura que es menor de 35, 33, 30 o 28° C y a una temperatura que es mayor de 20, 22, o 25° C.

En una realización de la invención, en la etapa d) la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar por lo menos un azúcar C5. En una realización el proceso es un proceso para la producción de etanol por lo cual el proceso comprende la etapa d) que comprende fermentar un medio que contiene azúcares con un microorganismo que es capaz de fermentar por lo menos un azúcar C5 , por el que la célula anfitriona es capaz de fermentar la glucosa, L-arabinosa y xilosa a etanol . En una realización por lo tanto el microorganismo que es capaz de fermentar por lo menos un azúcar C5 es una levadura. En una realización, la levadura pertenece al género Saccharomyces , preferiblemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, en la que se han hecho las siguientes modificaciones genéticas: a) un grupo que consiste de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, bajo el control de promotores fuertes, b) un grupo que consiste de un gen xylA y el gen XKS1 ambos bajo el control de promotores constitutivos, c) un grupo que consiste de los genes araA, araB y araD y/o un grupo del gen xylA y el gen XKS1; d) eliminación de un gen de reductasa de aldosa; y la evolución adaptativa del microorganismo modificado resultante. Tal microorganismo y su preparación se describen en más detalle en la WO 2008/041840 y en la Solicitud de Patente Europea EP 10160622.6, presentada el 21 de Abril de 2010. En una realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol es anaeróbico. El término anaeróbico ya se ha definido aquí anteriormente. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol es aeróbico. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol está bajo condiciones limitadas de oxígeno, más preferiblemente aeróbicas y bajo condiciones limitadas de oxígeno. Las condiciones limitadas de oxígeno ya se han definido aquí anteriormente.

En tal proceso, la productividad volumétrica de etanol es preferiblemente por lo menos 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0 o 10.0 g de etanol por litro por hora. La producción de etanol en L-arabinosa y opcionalmente xilosa y/o glucosa en el proceso preferiblemente es por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%. La producción de etanol aquí se define como un porcentaje de la producción teórica máxima, que, para glucosa y L-arabinosa y opcionalmente xilosa es 0.51 g. de etanol por g. de glucosa o xilosa.

En un aspecto, el proceso de fermentación conduce a la producción de etanol, tiene diversas ventajas mediante comparación a los procesos de fermentación de etanol conocidos: - son posibles procesos anaerobicos; - también son posibles condiciones limitadas de oxígeno; - se pueden obtener más productos de etanol y producción de etanol; - la cepa utilizada puede ser capaz de utilizar L-arabinosa y opcionalmente xilosa.

Alternativamente al proceso de fermentación descrito anteriormente, por lo menos se pueden utilizar dos células distintas, esto significa que este proceso es un proceso de co- fermentación. Todas las realizaciones preferidas del proceso de fermentación como se describió anteriormente también son realizaciones preferidas de este proceso de co-fermentación : identidad del producto de fermentación, identidad de la fuente de L-arabinosa y la fuente de xilosa, las condiciones de fermentación (condiciones aeróbicas o anaeróbicas, condiciones limitadas de oxígeno, temperatura en la que se lleva a cabo el proceso, productividad de etanol, producción de etanol) .

El proceso de fermentación se puede llevar a cabo sin cualquier requerimiento para ajustar el pH durante el proceso. Es decir, el proceso es uno que se puede llevar a cabo sin la adición de cualquiera de los ácidos o bases. Sin embargo, esto excluye una etapa de pretratamiento, en donde se puede agregar ácido. El punto es que la composición de la invención se capaz de actuar a pH bajo y, por lo tanto, no hay necesidad de ajustar el pH del ácido de una materia prima pretratada ácido con el fin de que pueda tener lugar la sacarificación. De acuerdo con lo anterior, un método de la invención puede ser un método de cero desperdicios utilizando solo productos orgánicos sin requerimiento de entrada química inorgánica.

Tiempo de reacción general De acuerdo con la invención, el tiempo de reacción general (es decir el tiempo de reacción de la etapa de hidrólisis c) y la etapa de fermentación d) se puede reducir.

En una realización, el tiempo de reacción general es 150 horas o menos, 140 horas o menos, 130 o menos, 120 horas o menos, 110 horas o menos, 100 horas o menos, 90 horas o menos, 80 horas o menos, 75 horas o menos, o aproximadamente 72 horas a 90% de producción de glucosa. Los tiempos generales correspondientemente menores pueden lograr producción menor de glucosa. Esto es independiente del modo en que los procesos se conducen en modo SHF o SSF.

Productos de fermentación Los productos de fermentación que se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos de alimentos para animales, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, que incluye etanol de combustible (el término "etanol" se entiende que incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos de valor agregado específicos que se pueden producir mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (que incluye etanol y butanol) ; ácido láctico; ácido 3 -hidroxi -propiónico ; ácido acrílico; ácido acético; 1 , 3 -propano-diol ; etileno; glicerol; un plástico; un producto químico especial; un ácido orgánico, que incluye ácido cítrico, ácido suecínico y ácido maleico; un solvente; un complemento de alimento para animal; un producto farmacéutico tal como un antibiótico ß-lactama o una cefalosporina ; una vitamina; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; una enzima, tal como una proteasa, una celulosa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidoreductasa, una transferasa o una xilanasa; una materia prima química; o un complemento de alimento para animal.

Separación del producto de fermentación El proceso de acuerdo con la invención opcionalmente comprende la recuperación del producto de fermentación. Un producto de fermentación se puede separar del caldo de cultivo de fermentación en cualquier forma conocida. Para cada producto de fermentación la persona experta así será capaz de seleccionar una técnica de separación apropiada. Por ejemplo se puede separar etanol de un caldo de cultivo de fermentación de levadura mediante destilación, por ejemplo destilación de vapor / destilación de vacío en forma convencional .

Ciertas realizaciones de la invención se describirán adelante en más detalle, pero no por vía de limitación del alcance de la presente invención.

Uso de enzimas termoestable bajo condiciones de temperatura óptimas En una realización, la invención se relaciona con el uso de enzimas termoestables tales como enzimas celulolíticas de Talaromyces en procesos de Hidrólisis y Fermentación Separada (SHF) y SSF para la producción de azúcares reductores de la materia prima ligno-celulósica pretratada en, pero no limitado a, producción de etanol . Las enzimas celulolíticas de Talaromyces se aplican en la materia prima ligno-celulósica pretratada que muestra índices de conversión máximos a temperatura dentro del rango de 50-70°C. La enzima permanece activa bajo estas circunstancias durante 14 días y sin cese completo de actividad.

Al utilizar las condiciones óptimas de temperatura, la cantidad máxima de azúcares reductores se puede liberar de la materia prima (hidrólisis total) dentro del tiempo de hidrólisis posible más corto. En esta forma, 100% de conversión de celulosa en glucosa se logra en menos de 5 días (120 h, ver Figura 1) en un proceso SHF con una dosificación de enzima de 0.175 mL (6 mg de proteína) /g de materia seca de materia prima. Bajo condiciones SSF a 33 °C la conversión total de la celulosa en la materia prima ligno-celulósica será de aproximadamente 168 h [2] y junto con ello estas condiciones mesofílicas determinan el tiempo de proceso requerido para la producción máxima de etanol de la materia prima .

En el caso de las enzimas celulolíticas termo estables, tal como de Talaromyces, se utilizan en un proceso SSF con microorganismos que producen etanol termofílico, los tiempos de fermentación serán más cortos que las enzimas celulolíticas de Talaromyces que liberan los azúcares reductores más rápido a temperaturas mayores que a temperaturas mesofílicas.

En ' la operación SSF, la concentración de producto (g/L) es dependiente de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible debido a que los azúcares se convierten al producto en el SSF, y las concentraciones de producto se pueden relacionar con la concentración de glucosa subyacente mediante multiplicación con la producción teórica máxima (Yps max en producto gr por gramo de glucosa) La producción teórica máxima (Yps max en gr de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede derivar de la bioquímica del texto. Para etanol, 1 mole de glucosa (180 gr) producido de acuerdo con la ruta normal de fermentación de glicólisis en levadura 2 moles de etanol (=2x46 = 92 gr de etanol. La producción teórica máxima de etanol en glucosa es por lo tanto 92/180 = 0.511 gr de etanol/gr de glucosa.

Para Butanol (MW 74 gr/mol) o iso butanol, la producción teórica máxima es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así Yps max para ( iso- ) butanol = 74/180 = 0.411 gr de (iso-)butanol/gr de glucosa.

Para el ácido láctico la producción de fermentación para fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (MW = 90 gr/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequiometría, el Yps max = 1 gr de ácido láctico/gr de glucosa .

Para otros productos de fermentación se puede hacer un cálculo similar.

La reducción del coste alcanzada con la aplicación de enzimas celulolíticas de Talaromyces será el resultado de una reducción general del tiempo de proceso.

Reducción del tiempo de proceso con enzimas termoestables Debido a que las enzimas estables permiten el tiempo extendido de hidrólisis sin pérdidas significativas en actividad, se pueden aplicar tiempos de hidrólisis de por ejemplo 72 horas, que resulta en conversiones de aproximadamente 90% del máximo teórico de los azúcares reductores obtenidos con solo 0.175 mL de enzima/ g de materia seca de materia prima (ver Figura 1, punto A) . La masa así obtenido se puede utilizar como sustrato en una etapa de fermentación sucesiva, por ejemplo pero no limitado a, producción de etanol. Aproximadamente el 10% de la celulosa restante, que aún no se convierte en azúcares reductores, se convertirá en azúcares reductores y directamente en etanol durante la fermentación (SSF) . Debido a que tal fermentación inicia con 90% de la cantidad máxima de azúcares disponibles al inicio de la fermentación, el índice de liberación de los azúcares reductores no determinará el índice de crecimiento del microorganismo que produce etanol como lo hace durante SSF convencional. En esta forma, la producción de etanol puede tener lugar en mayores índices de producción, que permite la terminación de la producción de etanol en menos de 48 h, menos de 45 h, menos de 40h, menos de 35h, menos de 30h, menos de 25h, por ejemplo 24h. El tiempo de proceso general así se puede reducir de 7 días a menos de 5 días, a menos de 4 días, a menos de 3 días, a menos de 2 días (48 horas) . Debido a que los tiempos de fermentación más cortos, se utiliza menos sustrato para el mantenimiento del microorganismo que produce etanol. La producción general de este método para extender el tiempo de hidrólisis y acortar el tiempo de fermentación puede resultar en 5-15% más etanol en el sustrato se produce en comparación con pre-sacarificación y SSF convencional.

La reducción del coste lograda con la aplicación de enzimas celulolíticas estables, como aquellas de Talaromyces, en esta forma resultará de la reducción del tiempo de proceso general .

Compensación de menor dosificación de enzima con tiempo extendido de hidrólisis utilizando enzimas Talaromyces Debido a la alta estabilidad de las enzimas estables, las actividades no cesan en el tiempo, aunque se liberan menos azúcares reductores en el curso de la hidrólisis. Es posible disminuir la dosificación de la enzima y extender el uso de la enzima al prolongar el tiempo de hidrólisis para obtener niveles similares de azúcares reductores liberados. Por ejemplo, 0.175 mL de enzima/ g de materia seca de materia prima resulta en la liberación de aproximadamente 90% del máximo teórico de los azúcares reductores de la materia prima pretratada dentro de 72 h (punto A en la Figura 2) .

Cuando se utiliza 0.075 mL de enzima/ g de materia seca de materia prima, aproximadamente 90% de conversión del máximo teórico se logra dentro de 120 h (punto B en la Figura 2) . Los resultados muestran que, debido a la estabilidad de la actividad de la enzima, disminuir la dosificación de la enzima se puede compensar al extender el tiempo de hidrólisis para obtener la misma cantidad de azúcares reductores. Lo mismo sucede con la hidrólisis de la materia prima pretratada en contenidos de materia seca de más de 10% muestra que el efecto compensatorio de tiempo extendido de hidrólisis a 15% de materia seca de materia prima.

La reducción del coste logrado al utilizar las enzimas celulolíticas estables, tal como de Talaromyces, resulta de requerir menos dosificación de enzima, que resulta en producción de conversión de hidrólisis similar.

Optimización del proceso de fermentación con enzimas estables Si la hidrólisis resulta en reducir los niveles de azúcar o cerca al máximo teórico de azúcares reductores de la materia prima pretratada, la solución de los azúcares reductores se puede ajustar y procesar con el objetivo de obtener la composición de solución de sustrato óptima para la etapa de fermentación. Este ajuste y procesamiento incluye, pero no se limita a, concentración, purificación, ajuste de pH, complementación de nutrientes adicionales, etc. la fermentación se puede iniciar al transferir la solución de los azúcares reductores al recipiente de fermentación, o al agregar el nutriente necesario y el inoculo al recipiente que contiene la solución de los azúcares reductores.

Adicionalmente, el modo de agregar la solución de los azúcares reductores al recipiente de fermentación, se puede optimizar para eficiencia de fermentación máxima, tal como adición bajo condiciones limitadas de carbón, en modo de lotes, alimentación por lotes y modo continuo.

Debido a la estabilidad de las enzimas, la actividad permanecerá presente durante la fermentación y continuará convirtiendo la celulosa restante y parcialmente hidrolizando la celulosa en azúcares reductores. De esta forma, las enzimas estables permiten la optimización de la etapa de fermentación sin pérdidas en la producción de conversión general .

La reducción del coste alcanzado con la aplicación de enzimas celulolíticas estables, tal como de Talaromyces, en esta forma resultará de maximizar la eficiencia del proceso.

Disminuir el riesgo de contaminación con enzimas estables En un proceso común para convertir el material ligno-celulósico en etanol, las etapas de proceso se hacen preferiblemente bajo condiciones sépticas para disminuir los costes operacionales . La contaminación y el crecimiento de los microorganismos contaminantes por lo tanto puede ocurrir y resultar en efectos colaterales indeseables, tal producción de ácido láctico, ácido fórmico y ácido acético, pérdidas de producción de etanol en sustrato, producción de toxinas y polisacáridos extracelulares , que pueden afectar significativamente los costes de producción. Una alta temperatura de proceso y /o un tiempo de proceso corto limitará el riesgo en contaminación durante hidrólisis y fermentación. Las enzimas termoestables, como aquellas de Talaromyces, son capaces de hidrolizar la materia prima ligno-celulósica a temperaturas de más de 60 °C. A estas temperaturas, el riesgo que un microorganismo contaminante provocará efectos colaterales indeseados será poco a casi cero.

Durante la etapa de fermentación, en la que se produce etanol, las temperaturas están típicamente entre 30 - 37 °C y no surgirán preferiblemente debido a las pérdidas de producción. Al aplicar tiempos de proceso de fermentación tan cortos como sean posibles los riesgos y efectos de contaminación y/o el crecimiento de los contaminantes se reducirá tanto como sea posible. Con enzimas estables, como aquellas de Talaromyces, se pueden aplicar tiempos de fermentación tan cortos como sea posible (ver descripción anterior) , y así los riesgos en la concentración y/o crecimiento de contaminantes se reducirá tanto como sea posible. La reducción del coste alcanzado con la aplicación de enzimas celulolíticas termoestables de Talaromyces en esta forma resultará de menor riesgo de fallas en el proceso debido a contaminación.

Las enzimas estables reducen los costes de enfriamiento y aumentan la productividad de plantas de etanol La primera etapa después del pretratamiento térmico enfriará la materia prima pretratada a temperaturas cuando las enzimas son activas óptimas. A gran escala, esto se hace típicamente al agregar agua (fría) , que, a pesar de reducir la temperatura, reducirá el contenido de materia seca. Al utilizar enzimas termpestables , como aquellas de Talaromyces, la reducción de costes se puede lograr por el hecho que (i) menor enfriamiento de la materia prima pretratada se requiere debido a que se permiten más temperaturas durante hidrólisis, y (ii) se agregará menos agua, lo que aumentará el contenido de materia seca durante hidrólisis y fermentación y así aumentará la capacidad de la producción de etanol (cantidad producida por unidad de tiempo por volumen) de una planta de etanol. También, al utilizar enzimas termoestables de acuerdo con la invención, como aquellas de Talaromyces, también se püede lograr la reducción de costes al utilizar agua fría que tiene más temperatura que el agua que se utiliza en un proceso con enzima no termoestable .

Reciclaje de enzima después de hidrólisis con enzimas estables Al final de la hidrólisis, las actividades de enzima parecen ser menores debido a que se liberan pocos azúcares reductores una vez se convierte casi toda la celulosa. La cantidad de actividad enzimática presente, sin embargo, se ha reducido solo un poco, asumiendo principalmente debido a absorción de las enzimas al sustrato. Al aplicar la separación de sólido-líquido después de hidrólisis, tal como centrifugación, filtración, sedicantación, etcétera, 60% o más por ejemplo 70% de la actividad de enzima en la solución se puede recuperar y reutilizar para hidrólisis de una materia prima ligno-celulósica pretratada durante la siguiente hidrólisis (Ver Figura 3) .

Más aún, después de la separación de sólido- líquido la enzima en la solución se puede separar de la solución que contiene azúcares reductores y otros productos de hidrólisis de las acciones enzimáticas. Esta separación se puede hacer mediante, pero no se limita a, (ultra y micro) filtración, centrifugación, sedicantación, sedimentación, con o sin la primer adsorción de la enzima a un portador de cualquier tipo .

Por ejemplo, después de hidrólisis de la materia prima pretratada con 0.175 mL/g de enzima de materia seca de materia prima cargada durante 20h, 50% de la cantidad teórica máxima de azúcares reductores se libera y después de la misma hidrólisis durante 72h, se libera 90% de la cantidad teórica máxima de azúcares reductores. Mediante centrifugación y ultrafiltración, se recupera 60-70% de la actividad de enzima en la fracción retenida, mientras que el filtrado contiene más de 80% de los azúcares reductores liberados. Al reutilizar la fracción retenida, cuando está o después de purificación y/o concentración adicional, la dosificación de la enzima durante la siguiente etapa de hidrólisis se puede reducir con 60-70%. La reducción del coste lograda al utilizar enzimas celulolíticas estables, tal como de Talaromyces, en esta forma resulta de requerir menos dosificación de enzima.

Reciclaje de enzima después de hidrólisis i.c.w. producción de enzima y reciclaje de células de levadura con enzimas estables El proceso que incluye el reciclaje de la enzima después de hidrólisis, como se describió anteriormente, se puede combinar con el reciclaje del microorganismo que produce etanol después de fermentación y con el uso de los azúcares reductores que contienen el filtrado como un sustrato (purificado y/o concentrado o diluido) en la fermentación de producción de enzima y como sustrato para el cultivo del microorganismo que produce etanol .

Reciclaje de enzima después de destilación por vacío con enzimas estables La termoestabilidad de las enzimas, como aquellas de Talaromyces, provoca la actividad celulolítica restante después de hidrólisis, fermentación y destilación por vacío en la vinaza delgada. La actividad total de la enzima se reduce durante las tres etapas de proceso sucesivas con 10-15 unidades de Sustrato por g de materia seca de materia prima, independientemente de la dosificación inicial de la enzima (ver Figura 5) . La vinaza delgada obtenida después de destilación por vacío así se puede reutilizar como una fuente de la enzima para un ciclo de proceso de hidrólisis-fermentación-destilación nuevamente iniciado de conversión de paja de trigo pretratada en etanol. La vinaza delgada se puede utilizar en forma concentrada o (no) diluida y/o purificada y con o sin complementación adicional de enzima.

Se describe la reutilización de vinaza delgada para la hidrólisis del material celulósico, "grids" de maíz y lactosa para un reactor SSF multietapa [2] , destinado a la producción y separación continúa de productos de fermentación volátiles. En este sistema, se utiliza una columna que pone en contacto el gas- líquido para la separar continuamente el etanol de la masa. El sistema complejo, sin embargo, requiere enormes cantidades de enzimas para lograr liberación suficientemente rápida de azúcares reductores de la materia prima ligno-celulósica debido a que las condiciones de proceso son subóptimas para la enzima utilizada. La reducción del coste lograda al utilizar enzimas celulolíticas termoestables, como aquellas de Talaromyces, en esta forma resulta de la capacidad de reutilizar la actividad de la enzima.

Reciclaje de enzima en combinación con complementacion de enzima después de destilación por vacío con enzimas termoestables En un proceso óptimo, una cantidad de la enzima se complementa en la vinaza delgada, antes de reutilizar en un nuevo ciclo de proceso, igual a la cantidad de actividad perdida d rante las tres etapas sucesivas de proceso del ciclo de proceso previo. En esta forma se evita la sobredosificación de la enzima y así se obtiene uso más eficiente de la enzima.

Más aún, al proporcionar la alta dosificación de enzima en el primer ciclo de proceso, y complementar la enzima igual a la cantidad de actividad perdida durante las tres etapas de proceso sucesivas en los siguientes ciclos de proceso, se pueden obtener índices de hidrólisis posibles mayores en cada ciclo de proceso que resulta en tiempos cortos de hidrólisis de menos de 48 h en combinación con el uso más eficiente de las enzimas.

Uso de enzimas estables en sistemas mezclados Al aplicar mezcla durante hidrólisis, las enzimas entran más frecuentemente en contacto con sustratos, que resulta en un uso más eficiente de la actividad catalítica. Esto resultará en una dosificación menor de enzima y así en menores costes, a menos que la mezcla tenga un efecto negativo en las enzimas. Las enzimas estables, como las enzimas termoestables de Talaromyces, son robustas y puede resistir a las circunstancias de alto corte (localmente) y temperaturas, que es el caso durante mezcla intensiva de suspensiones. El uso en sistemas mezclados es por lo tanto beneficioso y conducirá a la dosificación y eventueal reducción de costes.

La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que se deben constituir como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Reducción del tiempo de proceso al utilizar la composición de enzimas que retiene la actividad para más de 30 horas a temperaturas elevadas Se hace una comparación entre un proceso en el que la hidrólisis se extiende a 72 horas y un proceso en el que el tiempo para la hidrólisis se limita a 20 horas para demostrar el beneficio de utilizar la actividad retenida de la composición de enzimas en una hidrólisis extendida.

Materiales y métodos El método de hidrólisis y fermentación se describe en la solicitud de patente O 2010018105 (PCT/EP2009/060098 ) . Se utiliza paja de trigo pretratada como materia prima y se lava en agua potable de 70°C hasta que el pH es más de 3, preferiblemente entre 6.0 y 6.5. Se prepara una suspensión de 10% p/p de la materia prima pretratada lavada y se pre-incuba a 56°C. La composición de enzimas se agrega a una concentración de 0.20 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima. La mezcla se divide en dos porciones iguales A y B y se incuba a 56°C en una incubadora mientras se agita suavemente. Durante esta hidrólisis, las muestras se toman diariamente para determinar la cantidad de glucosa liberada de la celulosa presente en la suspensión. La porción A representa el proceso en el que se utiliza un tiempo de hidrólisis e 20 horas; la porción B representa el proceso en el que se utiliza la actividad retenida en una hidrólisis extendida de 72 horas.

Después de 20 horas, la porción A se retira de la incubadora y se enfría a 33 °C. Se realiza la fermentación, de acuerdo con la patente WO 2010018105 (PCT/EP2009/060098) , mediante la adición de células de levadura y sales y se incuba a 33 °C durante 6 días adicionales. El tiempo de proceso de la porción A alcanza aproximadamente 7 días (20 horas de hidrólisis y 6 días de fermentación) .

Después de 72 horas, la porción B se retira de la incubadora y se enfría a 33°C. Se realiza fermentación a 33°C en la misma forma como la porción A pero se detiene después de 48 horas. El tiempo de proceso de la porción B adjunta alcanza 5 días (3 días de hidrólisis y 2 días de fermentación) .

Resultados y discusión Durante la fermentación, los azúcares liberados se convierten en células de levadura, C02 y etanol. Una vez se detiene la producción de células de levadura, la cantidad de etanol producida es proporcional a la cantidad de dióxido de carbono producido. Debido a que el dióxido de carbono se puede medir en línea, su producción refleja la cantidad de etanol producida. La Tabla 1 da la cantidad de glucosa liberada, la cantidad de dióxido de carbono producida y la producción final de etanol en las porciones A y B.

Tabla 1: Resultados del análisis de glucosa, dióxido de carbono y etanpl de la porción A y B.

Los resultados muestran que un periodo de hidrólisis de 20 horas, seguido por un periodo de fermentación de 6 días produce la misma cantidad de etanol como un periodo de hidrólisis de 72 horas seguido por una fermentación de 48 horas. Así con un tiempo de proceso de 5 días, se logra un nivel de producción de etanol similar como un tiempo de proceso de 7 días.

La razón para esto es que durante las 20 horas de hidrólisis en la porción A se libera menos de 60% de la cantidad máxima teórica de azúcares. La cantidad restante se libera durante la fermentación, bajo condiciones menos óptimas debido a temperatura menor.

En la porción B la composición de enzimas que retiene la actividad durante el periodo de hidrólisis de 72 horas en condiciones más óptimas. Durante esta hidrólisis, se libera 95% de la cantidad máxima teórica de glucosa, mientras que la cantidad de 5% se libera durante el periodo de fermentación de 48 horas. Con esto se demuestra que la actividad retenida de la composición de enzimas se puede utilizar para acortar el tiempo de proceso y así disminuir los costes operacionales .

Ejemplo 2 Reducción de la dosificación de enzima al aumentar el tiempo de proceso con la composición de enzimas que retiene la actividad durante más de 30 horas a temperaturas elevadas En otro experimento, la propiedad para retener la actividad de la composición de enzimas se utilizar para compensar la baja dosificación de enzima mediante hidrólisis extendida.

Materiales y métodos Se utiliza el método de hidrólisis y fermentación como se denomina en el Ejemplo 1.

Una suspensión de 10% p/p de la materia prima pretratada lavada se prepara y se preincuba a 56°C. La suspensión se divide en dos porciones iguales A y B. La composición de enzimas se agrega a una concentración de 0.20 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima a la porción A y a una concentración de 0.09 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima a la porción B. Las porciones A y B se incuban a 56 °C en una incubadora mientras se agita suavemente durante 220 horas.

Durante esta hidrólisis, las muestras se toman diariamente para determinar la cantidad de glucosa liberada de la celulosa presente en la suspensión. La glucosa medida se gr fica contra el tiempo de hidrólisis (ver Figyra 5) .

En un experimento separado la porción A, con 0.20 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima, y porción B, con 0.09 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima, se incuban a 56°C. Después de 72 horas (porción A) y 120 horas (porción B) las porciones se toman de la incubadora y se enfrían a 33 °C. Se realiza fermentación, de acuerdo con la WO 2010018105 (PCT/EP2009/060098) , mediante la adición de levaduras células y sales y se incuba a 33 °C durante 48 horas adicionales.

Resultados y discusión La Figura 6 muestra la liberación de glucosa de celulosa en una suspensión de materia seca de 10% p/p de materia prima pretratada con ácido en una dosificación de 0.20 y 0.09 g de la composición de enzimas por g en peso de la materia seca de materia. Esto muestra que mientras se reducen las dosificaciones de la enzima, se pueden lograr niveles similares de glucosa si se extienden los tiempos de hidrólisis. De forma sorprendente, aunque la cantidad de la enzima es más de la mitad, se requiere una extensión de 60% del tiempo de hidrólisis para compensar la dosificación menor de la enzima. Se logra el nivel de 52 g/L dentro de 72 horas cuando se utiliza una dosificación de 0.20 g de la composición de enzimas por g en peso de materia seca de materia prima, mientras se logra el mismo nivel en 120 horas cuando se utiliza 0.09 g de la composición de enzimas por g en peso de materia seca de materia prima.

En el experimento separado ambas porciones se fermentan después de 72 (porción A) y 120 horas (porción B, ver Tabla 2) . Aunque el tiempo de hidrólisis es 60% mayor para la porción B, se obtienen niveles similares de etanol después de fermentación. De esta forma, se demuestra que la actividad de retención de la composición de enzimas se puede utilizar para disminuir la dosificación de enzima, y así reducir proporcionalmente los costes operacionales .

Tabla 2: Resultados de hidrólisis y fermentación, comparación de las porciones A y B.

Ejemplo 3 Uso de la composición de enzimas con actividad retenida permite la reutilización de la actividad después de hidrólisis Se realiza un experimento para demostrar el uso de la fracción liquida de la suspensión de materia prima-enzima después de hidrólisis, como una fuente de actividad para la hidrólisis en un siguiente ciclo de proceso.

Materiales y métodos Se utiliza el método de hidrólisis como se denomina en el Ejemplo 1.

Una suspensión de 10% p/p de la materia prima pretratada se prepara y se preincuba a 60°C. La composición de enzimas se agrega a una concentración de 0.20 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima y se incuba a 56 °C en una incubadora mientras se agita suavemente durante 120 horas. La suspensión se toma de la incubadora y se centrifuga a 4500 g. el glóbulo se lava una vez, se centrifuga y el sobrenadante de lavado se combina con el sobrenadante de la primera separación de sólido- líquido . El sobrenadante combinado se filtra, utilizando un filtro Z200 (a aproximadamente 0.2 um de espesor de papel de filtro por Pall) y se concentra utilizando una unidad de ultra-filtración en espiral de 10 kD PES a 10°C. El concentrado así obtenido se utiliza como fuente de enzima en un segundo hidrólisis con la nueva materia prima pretratada bajo las condiciones como se describió anteriormente. Todas las corrientes de proceso se analizan para actividad de glucosa y enzima.

Resultados y discusión El análisis de las corrientes demuestra que la glucosa se púede separar de la enzima al utilizar separación de sólido-líquido, seguido por filtración y ultra filtración. La actividad de la enzima del concentrado UF permanece en un nivel de 70% de la actividad original después de hidrólisis, como se muestra en la Figura 4. Esto significa que, utilizando la composición de enzimas con actividad retenida y utilizando las etapas de recuperación descritas aquí, la enzima se pude reutilizar para la hidrólisis de la materia prima en un ciclo sucesivo de proceso. Se recupera aproximadamente 86% de la glucosa, y se puede utilizar como una corriente de proceso limpia en fermentación.

Mediante la recuperación de la actividad de la enzima después de hidrólisis hace posible reutilizar esta actividad de enzima y así ahorrar en costes para las enzimas. Más aún, la corriente limpia de proceso que contiene la glucosa resultará en menor mantenimiento y costes de energía como el resultado de la ausencia de los sólidos durante fermentación y destilación.

Ejemplo 4 El uso de la composición de enzimas con actividad retenida permite la reutilización de la actividad después de destilación Se realiza un experimento para demostrar el uso de vinaza delgada, obtenido después de hidrólisis con la composición de enzimas con actividad retenida, fermentación y destilación, como una fuente de actividad para hidrólisis.

Materiales y métodos Se utiliza el método de hidrólisis y fermentación como se denomina en el Ejemplo 1.

Una suspensión de 10% p/p de la materia prima pretratada lavada se prepara y se preincuba a 56 °C. La composición de enzimas se agrega a una concentración de 0.20 g de la composición de enzimas por g de materia seca de materia prima y se incuba a 56°C en una incubadora mientras se agita suavemente durante 20 horas. La suspensión luego se toma de la incubadora y se enfría a 33 °C. Se realiza fermentación, de acuerdo con PCT/EP2009/060098 , mediante la adición de levaduras células y sales y se incuba a 33 °C durante 148 horas .

La suspensión se destila, utilizando destilación por vacío durante 20 minutos a 100 mbar y 60 ± 1°C hasta que se retira todo el etanol . La suspensión, que contiene residuos insolubles, células de levadura y enzimas, se centrifuga para retirar los residuos insolubles y las células de levadura; y se recolecta el sobrenadante. El sobrenadante se denomina adicionalmente como vinaza delgada.

La materia prima pretratada se agrega a la vinaza delgada a una concentración de 10% en peso de materia seca. La suspensión así obtenida se divide en diversas porciones iguales a las que cada una de ellas se agrega una cantidad de la enzima en el rango de 0 a 0.58 g de enzima per g de materia seca de materia prima. La suspensión se incuba a 56°C durante 20 horas y se libera la cantidad de glucosa.

Resultados y discusión Para distinguir entre altas y bajas actividades de enzima, la hidrólisis debe finalizar hasta que se hidroliza toda la celulosa. Por lo tanto, se utiliza aquí un tiempo de hidrólisis de 20 horas. La cantidad de glucosa liberada dentro de estas 20 horas depende de la cantidad de la enzima presente durante la hidrólisis. La cantidad máxima de glucosa es el nivel indicado en la Figura 6, y se fija a 100% aquí.

Como se puede ver en la Figura 7, la vinaza delgada sin agregar enzima contiene actividad hidrolítica que resulta del uso de la composición de enzimas con actividad retenida en el ciclo de proceso más temprano. Por lo tanto, utilizando la composición de enzimas suspendida en vinaza delgada mejora lá liberación de la glucosa en comparación con la composición de enzimas suspendida en agua. Esta mejora es más significativa en menores dosificaciones de enzimas, que se pueden explicar por el hecho que con actividad aumentada de enzima, los índices de liberación de glucosa se reducen más temprano en tiempo como también se muestra en la Figura 7. La curva mayor de dosificación de enzima cae antes que la curva menor de dosificación de enzima. Al reutilizar vinaza delgada en la hidrólisis, se puede reducir la dosificación de enzima y así se puede obtener reducción de los costes.

Ejemplo 5 Hidrólisis enzimática del material lignocelulósico y fermentación con levadura que convierte C5.

Hidrólisis Las muestras pretratadas diluidas de ácido de rastrojo de maíz y paja de trigo se hidrolizan enzimáticamente al utilizar una preparación de celulosa de amplio espectro experimental a 60 °C durante 3 días (72 horas) . El pH al inicio de la hidrólisis es 5.0. El contenido de materia seca al inicio de la hidrólisis es 10% p/p.

Las condiciones para la hidrólisis de muestras de fibra de maíz pretratadas son esencialmente iguales, excepto que la temperatura de hidrólisis es 50 °C y el contenido de materia seca al inicio de la hidrólisis es 13.8%.

Después de hidrólisis (72 hrs) , las muestras se dejan enfriar a temperatura ambiente. El pH se ajusta a 5.5 utilizando 10% de NaOH. Posteriormente, se agrega 1 mililitro de 200 gramos por litro (NH4)2S04 y 1 mililitro de 100 gramos por litros KH2P04.

Fermentación Luego, se agregan muestras de levadura que corresponden a un contenido de materia seca de levadura de 1 gramo de levadura por kilogramo de hidrolizado. La evolución de CQ2 en el tiempo se sigue utilizando el AFM (Monitor de Fermentación de Alcohol; HaloteC Instruments BV, Veenendaal, Países Bajos) . Se realizan experimentos en por lo menos triplicado, durante 72 horas a 33 °C. Uno de estos se muestrea a intervalos regulares con el fin de ser capaz de analizar la formación de etanol y concentraciones de azúcar residual.

Estos datos se pueden utilizar para calcular la producción de fermentación. El caldo de cultivo de los otros dos experimentos no se muestrea. En su lugar, al final el caldo de cultivo de fermentación se destila utilizando una unidad de destilación Buchi K-355 a 45% de vapor durante 15 minutos. El alcohol producido se determina utilizando un medidor de densidad Antón Paar DMA 5000 (Antón Paar Benelux BVBA, Dongen, Países Bajos) .

La cepa utilizada para la fermentación es BIE252, cuya preparación se describe en la solicitud de patente Europea EP10160622.6 , presentada el 21 de Abril 2010. Esta cepa es una cepa Saccharomyces cerevisae que se ha adaptado genéticamente para permitir metabolizar los azúcares C5 , es decir xilosa y arabinosa.

Se cultiva durante la noche BIE252 en matraces de agitación que contienen medio YEP complementado con 2% de glucosa. Las células se cosechan mediante centrifugación en a una concentración resuspendida de 50 gramos de materia seca por litro.

Las materias primas que se prueban consisten de lotes de fibra de maíz, rastrojo de maíz y paja de trigo. La hidrólisis y fermentación se realizan como se describe en la sección de materiales y métodos.

Los resultados se presentan en las figuras 17 (fibra de maíz) , 18 (rastrojo de maíz) y 19 (paja de trigo) . En el caso de rastrojo de maíz y paja de trigo, las materias primas con una cantidad relativamente baja de galactosa y arabinosa pero que consiste principalmente de glucosa y xilosa, todos los azúcares se convierten en 72 horas en C02 y etanol. En el caso de fibra de maíz (figura 17) , existe una cantidad residual baja arabinosa, galactosa y xilosa.

En las tablas adelante se calcula la producción de fermentación, en base de los azúcares liberados al final de la hidrólisis y la cantidad de etanol que se produce al final de la fermentación.

Tabla 3: Azúcar total liberada (g/1) , etanol producido (g/1) y producción de etanol (g de etanol/g de azúcar) de la fermentación de BIE252, para diferentes materias primas lignocelulósicas . * (azúcar monomérica liberada al inicio de la fermentación) Con base en la cantidad de etanol producida al final de la fermentación, como se determina por la medición del medidor de densidad Antón Paar DMA 5000, y la cantidad de materia prima pretratada que se utiliza, se calculan la hidrólisis general y fermentación producida, en duplicado. Estas figuras se establecen en la tabla 4.

Tabla 4: Hidrólisis general y producción de fermentación (galones de etanol por tonelada de materia seca) de fermentación de BIE252, para diferentes materias primas lignocelulósicas Hidrólisis general Hidrólisis general Materia y producción de y producción de prima fermentación (galones fermentación (galones lignoceluló de etanol por tonelada de etanol por tonelada sica de materia seca) Ira de materia seca) 2da fermentación fermentación Rastrojo de 81 81 maíz Paj de 72 73 trigo Fibra de 67 69 Maíz Bibliografía [1] Badger, P, Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses. 2002. J. Janick and A. hipkey (eds.). ASHS Press, Alexandria, VA; [2] Kumar, S., Chem. Eng. Technol . 32 (20?9) 517-526; [3] WO 2007/091231 [4] urray, P. , et al., Enzima Microbial Technol 29 (2001) 90-98; [5] Dow, N. , y McMillian, J. Technical Report NREL/TP-510-42630, January 2008; t6] US 5141861; [7] WO 2008/008793.

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico , que comprende las siguientes etapas: a) pretratamiento opcional b) lavado opcional; c) hidrólisis enzimática; d) fermentación; y e) recuperación opcional de un producto de fermentación; en donde en la etapa c) se utiliza una composición de enzima que tiene una temperatura óptima de 55 °C o más, el tiempo de hidrólisis es 40 horas o más y la temperatura de hidrólisis es 50°C o más.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tiempo de reacción en ambas etapas c) y d) es 150 horas o menos a 90% de liberación de glucosa o un tiempo correspondientemente más corto en liberación de glucosa a menor porcentaje.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el tiempo de fermentación es 18-120 horas.

4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición de enzimas utilizada retiene la actividad durante 30 horas o más.

5. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura de 55 C o más.

6. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición de enzimas se deriva de un microorganismo del género Talaromyces.

7. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición de enzimas utilizada retiene la actividad en el periodo de 30-500 horas.

8. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa c) se realiza hasta que se libera 70% o más de azúcar disponible en material lignocelulósico .

9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etapa c) se realiza hasta que se libera 90% o más de azúcar disponible en material lignocelulósico.

10. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la dosificación de la composición de enzimas es 6 mg de proteína / g de peso de materia seca o menos.

11. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde en la etapa d) la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar por lo menos un azúcar C5.

12. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es 14% (p/ dmw) o más.

13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es 14-33% (p/ dmw) o más.

14. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde en la etapa e) después de la recuperación del producto de fermentación, la enzima que contiene la suspensión resultante se recicla en la etapa c) .

15. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , en donde el producto de la etapa de hidrólisis c) se somete a separación de líquido sólido y (parte de) la fracción líquida se carga en la etapa de fermentación d) .

16. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el producto de la etapa de hidrólisis c) se somete a separación de líquidos y sólidos y (parte* de) la fracción líquida se recicla en la etapa c) .

17. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el producto de la etapa de hidrólisis c) se somete a separación de líquidos y sólidos y la fracción líquida se carga a una unidad de ultrafiltración, en donde el filtrado se carga en la etapa de fermentación d) y la fracción retenida se recicla en la etapa c) .

18. Proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde parte del filtrado se utiliza para alimentar los fermentadores de producción para la producción de microorganismos utilizados en el proceso.

19. Proceso de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en donde parte del filtrado se utiliza para alimentar los fermentadores de producción para la producción de la enzima.

20. Proceso de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, en donde parte del filtrado se utiliza para alimentar los fermentadores de producción para la producción del producto de fermentación.

21. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en el que el filtrado se utiliza para alimentar los termentadores de producción en lotes, alimentación por lotes y o cultivo continuo.