CN102533998A

CN102533998A - 西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点pcr-rflp检测方法

Info

Publication number: CN102533998A
Application number: CN2012100011952A
Authority: CN
Inventors: 王雅春; 焦士会; 初芹; 俞英; 张胜利; 孙东晓; 张毅; 张沅
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102533998B

Abstract

本发明涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR-RFLP检测用引物，其核苷酸序列如下：5’-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3；5’-CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。本发明利用PCR-RFLP技术，对西门塔尔牛AS致病位点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，对西门塔尔牛AS致病位点可以进行准确的分型。

Description

西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR-RFLP检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点PCR-RFLP检测方法。

背景技术

家畜遗传缺陷多呈现隐性遗传模式的原因可能与家畜的生产方式不无关系，尤其是奶牛。人工授精(Artificial Insemination，AI)及精液低温冻存技术(Semen Cryopreservation Techniques)在奶牛生产繁育中的应用，为奶牛的人工授精育种体系(AI breeding system)的建立奠定了坚实基础。公牛因AI技术可承担更多母畜配种任务，因而可以被广泛应用于群体当中，获得大量后代，使得高产的基因在群体中迅速传播。精液低温保存技术使优秀种用公牛不受时间和地域限制，实现全球范围内遗传物质的交流(张沅，2001)。经严格遗传评定的验证公牛(Tested Bulls)在奶牛遗传改良中发挥巨大的推动作用。

人工授精技术的广泛应用使全世界种质资源交换日益频繁。对种公牛的高强度选择，使奶牛基因库缩小，群体平均近交系数大大增加。有研究表明，美国荷斯坦牛的群体近交系数以每年0.1％的速度持续增长，2004年出生的母牛平均群体近交系数高达5.0％(Hansen等，2005)。近交导致群体有效大小减小，一些不利基因的纯和，尤其是隐性基因控制的遗传缺陷，由于携带者表现正常，不易通过常规临床检测方法检出，致病基因“潜伏”在群体中很难被剔除。只有当群体中隐性突变基因频率达到一定程度时，临床阳性的个体大量出现，带来不利影响和经济损失。如荷斯坦牛的Weaver综合征(单雪松等，2006)、白细胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)(孙艺等，2006)、脊椎畸形综合征(Complex VertebralMalformation，CVM)(Chu等，2008)等。因而，寻找隐性缺陷病的致病突变，对致病突变建立准确快速的分子检测方法，注重对有害基因的识别与淘汰是奶牛育种工作的重要任务之一。

综上所述，动物遗传缺陷的致病基因研究是遗传学的重要组成部分。在家畜育种工作中，建立快速有效的动物遗传缺陷致病位点的分子检测方法，对种用动物、进口的遗传种质、甚至某些发病群体全群进行致病位点检测，对携带致病基因的个体进行标记或淘汰，降低遗传缺陷在动物群体中的传播与蔓延带来的经济损失。

自1975年，Rieck和Schade首次报道了德系西门塔尔牛群体中出现的一种新的犊牛先天畸形，并定名为牛蜘蛛腿综合征(AS)。Buitkamp等(2008)年报道了自2004年-2007年，绝迹三十多年的AS病例又在西门塔尔牛中重新出现，并且相继报道了大量的病例；系谱分析及后期测交试验证实了该病在德系西门塔尔牛群体中是属于常染色体单位点控制的隐性遗传缺陷。Buitkamp等(2009)将德系西门塔尔牛AS致病基因定位于BTA23。Buitkamp等(2011)年对AS的精细定位及群体检测证实MOCS1基因c.1224_1225delCA突变为西门塔尔牛AS的致病突变。但是，到目前为止，还没有一种适合商业操作的西门塔尔牛AS致病位点快速准确的检测方法。本发明需要解决的问题即根据目前的研究进展，设计一种快速准备，成本低廉的检测方法，以进行商业化试剂盒的生产。

商业化遗传病检测试剂盒的生产对我国的畜牧业蓬勃发展意义重大。随着中国奶牛杂交生产以及肉牛改良工作的开展，大量从国外，包括德国在内，引进西门塔尔优秀种公牛和公牛冻精，其中存在AS携带者。为了防患于未然，杜绝AS疾病给我国牛业带来不必要的损失，早发现、早淘汰是最好的途径。通过建立快速准确的携带者分子检测平台，完善我国牛遗传缺陷数据库，同时结合系谱分析，对引进西门塔尔牛以及现有群体中携带者的后代进行筛查，及时淘汰携带者，对我国奶业和肉牛业的发展都具有非常重要的意义。

PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法是在RFLP技术(Botstein等，1980)基础上结合PCR技术发展起来的。PCR-RFLP技术首先对目的片段进行PCR扩增，将PCR产物经限制性内切酶消化，致病等位基因产生与正常等位基因酶切产物不同长度片段，通过电泳区分基因型。

PCR-RFLP技术由于其共显性、成本低、快速简便的特点，在动物遗传缺陷检测方面有着广泛的应用。Schober等(1993)和Schwenger等(1993)，发现了牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)由UMPS基因的外显子5密码子405处发生(C→T)点突变，使编码精氨酸的密码子由(CGA)变为终止密码子(TGA)，这一突变导致DNA序列Ava I酶切位点消失，建立了PCR-RFLP检测方法，可对突变型和野生型基因型进行分型，可进而检测奶牛携带DUMPS突变位点情况。牛瓜氨酸血症(CN)由编码精氨酸琥珀酸合成酶(ArgininosuccinateSynthase，ASS)的基因ASS单碱基突变(C→T)，引起精氨酸密码子CGA转变为终止密码子TGA引发(Grupe等，1996)。Healy等(1990)，使用限制性内切酶Ava II区分正常与突变等位基因，建立PCR-RLFP方法。Shuster等(1992)年发现牛白细胞粘附缺陷症(BLAD)由CD18基因编码区的第383位发生A→G的突变，导致128为天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)代替，并首先建立PCR-RFLP检测方法，对牛的该致病位点携带情况进行检测。Tammen等(1996)、Kriegesmann等(1997)和孙艺(2006)分别针对该位点进行了PCR-RFLP方法的改进，建立了稳定的BLAD致病位点检测方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点PCR-RFLP检测方法。

本研究通过NEB cutterV2.0分析，发现存在MOCS1基因c.del1224_1225CA突变位点的等位基因由于2bp的缺失导致DraIII内切酶酶切位点消失，DraIII内切酶识别位点如图1所示。因而，DraIII内切酶可以进行缺失等位基因和野生型等位基因的酶切分型，野生型等位基因经酶切消化后产生412bp和217bp片段；杂合基因型产生629bp、412bp和217bp片段；突变型纯合子产生629bp的片段。由于酶切片段相差明显，本研究使用2％琼脂糖凝胶可以区分正常野生型等位基因和突变等位基因。使用PCR-RFLP方法可以准确区分致病和正常的等位基因，与测序结果一致。

为了实现本发明目的，本发明的一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点PCR-RFLP检测用引物，其核苷酸序列如下：

5’-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3’，

5’-CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂盒，其还包括：DNA裂解液、阴性模板和/或阳性模板。

本发明进一步提供利用上述引物检测西门塔尔牛蜘蛛腿综合征的方法，所用引物为权利要求1所述引物，或所用试剂盒为权利要求2或3所述的试剂盒，其包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以西门塔尔牛组织细胞DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；

2)核酸内切酶酶切PCR扩增产物；

3)酶切产物的RFLP分型。

所述PCR扩增条件优选为95℃预变性5min，然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，72℃最终延伸10min。

所述引物用量为1.5μL，引物的终浓度为10μM。

所述核酸内切酶优选为DraIII内切酶。

DraIII内切酶采用15μL的酶切体系，各组分体系如下：PCR产物，8μL；NEB buffer3，1.5μL；100×BSA，0.15μL；内切酶，0.35μL；ddH₂O，5μL。酶切体系各组分添加相应体积后，盖好盖子，混匀，离心。酶切反应条件为，37℃下孵育13小时。酶切反应结束后，使用2％的琼脂糖凝胶进行PCR酶切产物分型。酶切应该保证PCR产物浓度的一致性和酶切时间的优化，保证野生纯型等位基因在酶切位点被全部切开。

本发明还提供了上述所述方法在牛抗病育种中的应用。

该检测方法是在证实MOCS1基因的c.del1224_1225CA位点为西门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点的基础上，结合PCR-RFLP法，即聚合酶链式反应-限制片段长度多态法，设计的一种快速准确遗传致病基因检测的方法。对牛AS致病突变位点准确有效的分子检测方法的建立，目的在于筛选出我国牛群中的突变携带者个体，进行不利基因的筛查和剔除，对我国进口的西门塔尔牛种用动物及遗传物质(冷冻精液，胚胎等)进行检测，防止AS在我国牛群中的传播，对我国西门塔尔牛及相关杂交品种的遗传改良提供保障。

本发明利用PCR-RFLP技术，对西门塔尔牛AS致病位点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，能够快速准确筛查出AS致病位点携带个体。

附图说明

图1为本发明DraIII内切酶识别位点；

图2为本发明牛冻精基因组1％琼脂糖检测结果；

图3为本发明牛血液基因组1％琼脂糖检测结果；

图4为本发明牛耳组织基因组1％琼脂糖检测结果；

图5为本发明多重PCR反应程序；

图6为本发明MOCS1基因c.del1224_1225CA突变PCR产物2％凝胶检测；

图7为本发明ROMEL及其两个后代测序结果；

图8为本发明MOCS1基因c.del1224_1225CA位点酶切示意图；

图9为本发明MOCS1基因c.del1224_1225CA突变位点PCR-RFLP结果。

图8中a为野生型纯合子，b为杂合型，c为突变型纯合子。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1试验材料的准备和DNA的提取

本研究采用的试验材料来自两个部分：4头德系西门塔尔公牛家系中的与配母牛和杂交后代抗凝血样及耳组织样；11个牛品种或品系的公牛管制冻精。

4个德系西门塔尔公牛家系(表1)，包括80头与配母牛及106头后代，分别来自中国鞍山恒利奶牛场(鞍山恒利)和内蒙古海拉尔市谢尔塔拉三河牛种牛场(海拉尔谢尔塔拉)。4个家系中，母牛品种为中国荷斯坦牛和中国三河牛，后代均为杂交牛(荷斯坦×德系西门塔尔杂交牛、三河牛×德系西门塔尔杂交牛)。其中4头德系西门塔尔公牛分别为ROMEL、BOSSAG、RIFURT、HIRMER(德国西门塔尔牛系谱查询网站：http://www.zar.at/article/archive/18981)。ROMEL为已知AS致病基因携带者，其他3头公牛均为不携带AS致病基因的正常个体。

表14头德系西门塔尔公牛家系信息

本研究以11个牛品种或品系的194头公牛冻精为试验材料。品种或品系名称、样品数、样品来源见表2。其中德系西门塔尔公牛分别为ROMEL、BOSSAG、RIFURT、HIRMER。ROMEL为AS致病基因携带者，其他3头公牛均为不携带AS致病基因的正常个体。

表210个牛品种或品系冻精样品信息

本试验提取DNA的方法参考陈慧勇(2005)方法提取公牛冻精DNA，采用DNA提取试剂盒DP304(天根生化科技有限公司，北京)提取牛耳组织、血液中的DNA。使用NanoDrop2000色谱法检测DNA浓度及纯度后，4℃保存备用。

所提取的DNA条带单一，经紫外分光光度计检测，冻精浓度在150ng/μl左右，血液DNA在100ng/μl左右，耳组织DNA浓度在150ng/μl左右。所有个体DNA均稀释到50ng/μl，冻存于-20℃备用。牛冻精基因组1％琼脂糖检测结果如图2所示，牛血液基因组1％琼脂糖检测结果如图3所示，牛耳组织基因组1％琼脂糖检测结果如图4所示。

实施例2亲子鉴定

为了保证结果的可靠性，本研究对ROMEL及其31个后代，进行了亲子鉴定。采用ABI(美国应用生物)的牛用亲子鉴定试剂盒(Stock

Bovine Genotyping Kit)进行11个标记的多重PCR。

1、标记信息如表3所示

表3Stock

牛用亲子鉴定试剂盒标记信息

2、亲子鉴定试剂盒多重PCR

牛用亲子鉴定试剂盒采用11重PCR，15μL体系，组分为Gold Taq酶，0.5μL；Permix引物，5.5μL；PCR缓冲液，3μL；dNTP预混液，4μL；模板DNA，1μL；ddH₂0，1μL。本研究使用试剂盒中的对照DNA(正常个体DNA)作为阳性对照，并设有不加DNA模板的阴性对照。多重PCR反应程序见图5。

3、利用ABI3700测序仪进行微卫星标记基因型的判定

PCR扩增结束后，须用琼脂糖电泳初步检测一下扩增效果，并初步估计产物浓度，检测合格后根据预试验结果将PCR产物稀释，加入到适量的灭菌水中震荡3分钟充分混匀，在离心机4000转/分钟的转速下离心30秒。将混匀的PCR产物取1～1.5μL和上样混合液混匀。混匀后的PCR产物取1-1.5μL，加甲酰胺10μL，分子内标400HD或500LIZ0.6μL，配制成混合体系，然后再在3700测序仪上样电泳与收集荧光信号。上测序仪前要先进行变性处理，方法是：进行95℃水浴5min，然后迅速放入4℃水浴5min。变性后的样品要保持在低温状态，以使PCR产物的两条链处于分离状态。注意如果温度过高，则可能会复性，影响电泳结果。

利用ABI Gene Mapper4.0软件完成基因型判定与数据导出Excel文件，作为基因型文件，准备下一步亲子鉴定的整理与统计分析。

4、利用Cervus3.0进行亲子鉴定

本研究使用Cervus3.0软件，利用最大似然法原理对32头犊牛及4头候选父亲进行亲子鉴定。分别使用99％和95％的置信概率。亲子鉴定根据群体各标记基因型值，进行10000次模拟，假设标记基因型判型过程存在0.001的判型错误率。犊牛可用标记与公牛可用标记数为基因型分析后可以用来做亲子鉴定的标记数目。不匹配标记对指犊牛与对其应的最可能父亲不符合孟德尔遗传定律的标记数目。亲子对LOD值为最可能父亲和第二可能父亲的似然值的比(似然比)，再取对数的值。亲子对置信度取0.99和0.95两种水平，用“+”和“*”表示。

根据系谱得到的携带者ROMEL的后代为31头，亲子鉴定结果表明，ROMEL的真实后代有24头，另外7头犊牛的系谱记录发生错误。所有亲子对的置信度都达到95％或以上，表明是可信的。

表431头犊牛与4头公牛亲子鉴定结果

注：上表中，*代表进行亲子鉴定99％置信度，+代表95％。

实施例3AS致病突变的直接测序分析

本研究针对MOCS1基因c.del1224_1225CA突变，设计了引物，选取了ROMEL等4头德系西门塔尔公牛及ROMEL系谱记录上的31个后代，进行对突变所在片段的PCR扩增，扩增后进行PCR产物测序。测序引物为表5所示，PCR体系同实施例2，PCR反应如图5所示。PCR经2％凝胶检测，PCR产物在华大基因进行纯化和Sanger测序。

表5MOCS1基因突变位点直接测序用引物

本研究对35头牛进行跨MOCS1基因c.del1224_1225CA突变PCR产物2％凝胶检测(图6)。凝胶检测得到PCR产物明清晰的均一条带，目的条带理论长度在250bp。胶图上的目的条带在200bp和300bp的Marker之间，PCR引物特异性良好。

4头德系西门塔尔公牛及ROMEL的24头真实后代，和7头其他公牛后代的PCR产物直接测序结果中，发现ROMEL及其12头真实后代(表6)为携带该突变的杂合基因型，其他22个个体均为纯合野生型。ROMEL及其2头后代测序峰图如图7所示，ROMEL在突变位点为杂合型，其两个后代94254和9129x在突变位点分别为杂合型与野生纯合型，黑色箭头表示突变位点。测序结果与参考序列的多重比对结果与测序峰图相符。

表624头ROMEL真实后代MOCS1基因c.del1224_1225CA突变位点检测结果

注：A为野生型、B为突变型

实施例4AS致病突变的PCR-RFLP分析

酶切试验以表1和表2中共380头牛为试验材料。

PCR扩增引物如下：

5’-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3’，

5’-CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT3-’，

引物的退火温度为60℃，理论片段长度为629bp。PCR反应同实施例2，反应程序如图2所示，酶切原理如图8所示。

本研究采用15μL的酶切体系，各组分体系为：PCR产物，8μL；NEB buffer3，1.5μL；100×BSA，0.15μL；内切酶，0.35μL；ddH₂O，5μL。酶切体系各组分添加相应体积后，盖好盖子，混匀，离心。酶切反应条件为，37℃下孵育13小时。酶切反应结束后，使用2％的琼脂糖凝胶进行PCR酶切产物分型。酶切应该保证PCR产物浓度的一致性和酶切时间的优化，保证野生纯型等位基因在酶切位点被全部切开。

PCR产物2％凝胶检测可得到清晰的条带，进行酶切反应后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶检测的结果如图9所示，不携带MOCS1基因c.del1224_1225CA突变位点的野生型纯合子的酶切产物可以看到清晰的两条带，条带分别在200bp-300bp、400bp-500bp之间，与理论长度217bp和412bp相符；携带该突变位点的杂合子个体通过凝胶检测可见3条清晰的条带，分别位于600bp附近、400bp-500bp、200bp-300bp之间，与理论长度629bp、412bp和217bp相符。图9表示的是部分被测个体的酶切结果，其中AB表示杂合子，AA表示纯合子个体。酶切判型结果中，ROMEL在MOCS1基因c.del1224_1225CA突变位点为野生型纯合子，其24头真实后代中，有12头犊牛为野生型纯合子，12头为杂合子，与测序结果一致，符合1∶1的孟德尔遗传规律。其他3头德系西门塔尔公牛及其它检测的不同品种的公牛、母牛和犊牛均为野生纯合型AA型。酶切结果证实了PCR-RFLP方法的准确性和可靠性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR-RFLP检测用引物，其核苷酸序列如下：

5’-ATGAAGGGACAGAGTGGTCGT-3’，

5’-CGTGGGTCAGTTGGTCAGAGT-3’。

2.含权利要求1所述引物的检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括：DNA裂解液、阴性模板和/或阳性模板。

4.一种检测西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点的方法，其特征在于，所用引物为权利要求1所述引物，或所用试剂盒为权利要求2或3所述的试剂盒，其具体包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

2)核酸内切酶酶切PCR扩增产物；

3)酶切产物的RFLP分型。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为95℃预变性5min，然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，72℃最终延伸10min。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物用量为1.5μL，引物的终浓度为10μM。

7.如权利要求4～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述核酸内切酶为DraIII。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，DraIII内切酶采用15μL的酶切体系，各组分体系如下：PCR产物，8μL；NEB buffer3，1.5μL；100×BSA，0.15μL；内切酶，0.35μL；ddH₂O，5μL。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，酶切反应条件为37℃下孵育13小时。

10.权利要求4～9任意一项所述方法在牛抗病育种中的应用。