CN102533981A - 一种快速检测枯草芽孢杆菌的引物及其检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的引物对和检测方法及其试剂盒。本发明的引物对可以特异性地扩增枯草芽孢杆菌的(Bacillus subtilis)基因片段。对分离、提取得到的待测样品基因组DNA，进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带的有无以及大小，判断样品中是否存在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本发明作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的分子检测方法，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低等优点，有很强的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种快速检测枯草芽孢杆菌的引物及其检测方法和试剂盒。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有典型的芽孢杆菌特征，属革兰氏阳性菌。它可以液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型的好氧菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此枯草芽孢杆菌能够抵抗高温、低温、干燥、辐射等不良环境，是食品工业生产中的主要污染菌之一，通常会引起食品的腐败，危害极大。枯草芽孢杆菌目前常用的检测方法是好氧平板培养法，待生长出菌落后，然后进行生化鉴定。一般情况下分离培养鉴定周期耗时比较长，约需5～7天，因此在生产实践上应用很不方便。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、成本低的优点，目前已被广泛地应用于微生物的鉴定。然而，迄今国内还未见有采用PCR方法快速检测枯草芽孢杆菌的报道。因此，建立开发一种快速、灵敏的检测枯草芽孢杆菌的方法显得迫切需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前检测枯草芽孢杆菌一般采用耗时长且操作复杂的生化鉴定方法的现状，提供一种检测速度快、灵敏度高、特异性强、成本低的检测枯草芽孢杆菌的方法。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一为：一种检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的引物对。
该引物对中，一条引物和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16s-23srRNA基因序列相同，引物长度为15-30bp，更佳的是18-23bp，另一条引物和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16s-23s rRNA基因序列互补，引物长度为15-30bp，更佳的是18-23bp。该引物对的扩增片段为100-1000bp，优选200-800，更优选469bp。优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的特异性扩增枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的引物，根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16s-23s rRNA的基因为靶序列进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之二为：一种检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物对。所述的试剂盒较佳的还包括dNTP，10×PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。更佳的，所述的试剂盒还包括阳性对照或者基因抽提试剂。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之三为：一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，包括如下步骤：
1)提取待测样品中的基因组DNA并稀释备用；
2)以步骤1)所得基因组DNA为模板，以本发明所述引物对进行PCR反应；
3)将步骤2)所得PCR反应产物进行电泳检测，具有本发明所述引物对扩增出的片段的样品中存在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
本发明中，步骤2)所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出枯草芽孢杆菌特异性的基因片段即可。较佳的是：反应体系总体积为20-50μL，反应体系中包括0.5μmol/L的上游引物，0.5μmol/L的下游引物，0.2mmol/L的dNTP，1×PCR buffer，1.5mmol/L的Mg2+，0.02U/μL的Taq DNA聚合酶，1.0-2.0ng/μL的DNA模板。
步骤2)所述的PCR反应程序为常规，只要能够扩增出枯草芽孢杆菌特异性的基因片段即可。较佳的为：95℃，5min；30个循环95℃30S，55℃30S，72℃30S；72℃，5min；4℃保存。
步骤3)所述电泳为本领域常规，可以是琼脂糖凝胶电泳或者是聚丙烯酰胺凝胶电泳，较佳的是琼脂糖凝胶电泳，优选1％琼脂糖凝胶电泳。按本领域常规方法，将凝胶电泳产物在一定条件下成像，即可判断结果。比如在紫外凝胶成像仪下拍照成像。采用序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物的PCR反应产物，若有469bp核酸片段，则说明待测样品中存在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。若不存在469bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。与本领域常规一样，可与对照DNA标准品比较而得DNA片段的长度。
本发明的待测样品为任何可能含有植物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的物质，较佳的比如牛奶或乳制品。
本发明提供了一种特异性检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的引物及通过该引物快速检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，具有如下优点：
1、检测速度快
与目前传统的生化培养鉴定技术整个鉴定周期需要耗时5～7天相比，本发明所述的采用分子生物学方法鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)只需要3～4小时，在实践应用上更为方便。
2、成本低
普通生化鉴定方法所用试剂种类多，操作步骤复杂，而本发明采用PCR鉴定所用试剂种类少，操作简单，成本较低，可以很方便地投入实际应用。
3、特异性强、灵敏度高
本发明所述枯草芽孢杆菌PCR定性检测引物只特异性地扩增枯草芽孢杆菌的特征性基因，不会扩增其他细菌的基因。PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平，即使待测样品中只含有3个目标细菌，通过PCR方法也可以检出，因此灵敏度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1鲜奶中枯草芽孢杆菌的检测
取10ml鲜奶，6000g离心10min，弃上清，取沉淀。以去离子水洗沉淀2次，用裂解试剂(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，购自TaKaRa公司)提取菌体基因组DNA。然后以所提DNA为模板进行PCR反应。
PCR反应体系为：5μmol/L上游引物3μL，5μmol/L下游引物3μL，2.5mmol/L dNTP(TaKaRa公司)2.4μL，10×PCR Buffer (TaqTM，TaKaRa公司)3μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶(TaqTM，TaKaRa公司)1U，加去离子水至30μL。
PCR反应程序为：95℃预热5min，35个循环(95℃，30S；55℃，30S；72℃，30S)，72℃延伸5min，4℃保存。
最后进行电泳检测，取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V，电泳时间为30min。以DNA分子量标记(DL2000)为对照进行检测。
结果显示在紫外灯下存在469bp的核酸片段，说明待测样品中存在枯草芽孢杆菌。
实施例2培养平板上菌落的枯草芽孢杆菌检验
待测样品为某超市购买的豆浆。将所购豆浆进行梯度稀释后，选择2～3个适当稀释度，各以0.1mL涂布到LB琼脂平板上，37℃，好氧培养48h。挑取3个或以上可疑菌落，用裂解试剂(Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR，TaKaRa公司)提取菌体基因组DNA并稀释备用。然后以所提菌体基因组DNA为模板进行PCR反应。
PCR反应体系为：5μmol/L上游引物3μL，5μmol/L下游引物3μL，2.5mmol/L dNTP(TaKaRa公司)2.4μL，10×PCR Buffer (TaqTM，TaKaRa公司)3μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶(TaqTM，TaKaRa公司)1U，加去离子水至30μL。
PCR反应程序为：95℃预热5min，35个循环(95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)，72℃延伸5min，4℃保存。
最后进行电泳检测，取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V，电泳时间为30min。以DNA分子量标记(DL2000)为对照进行检测，
结果计算：根据待测样品平板菌落总数(N)、样品稀释倍数(M)、PCR鉴定为枯草芽孢杆菌的阳性菌落数与挑选出做PCR鉴定的菌落数的比值(R)，计算出样品中枯草芽孢杆菌的含菌量(P)，P＝N×M×R。
在本实施例中，待测样品平板菌落总数N＝10，样品稀释倍数M＝101，PCR鉴定为枯草芽孢杆菌的阳性菌落数与挑选出做PCR鉴定的菌落数的比值R＝3/10。因此，该豆浆样品中枯草芽孢杆菌的含菌量P＝N×M×R＝10×101×(3/10)＝3×101(cfu/mL)。
实施例3检测方法灵敏度测试
将纯培养的枯草芽孢杆菌稀释，在显微镜下用血球计数板计数。将菌液梯度稀释到拷贝数分别为3×105/mL、3×104/mL、3×103/mL、3×102/mL、3×101/mL后进行实验。用裂解试剂(Lysis Buffer for Microorganism to DirectPCR，TaKaRa公司)提取各梯度菌体基因组DNA并稀释备用。然后以所提菌体基因组DNA为模板进行PCR反应。
PCR反应体系为：5μmol/L上游引物3μL，5μmol/L下游引物3μL，2.5mmol/L dNTP(TaKaRa公司)2.4μL，10×PCR Buffer(TaqTM，TaKaRa公司)3μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶(TaqTM，TaKaRa公司)1U，加去离子水至30μL。
PCR反应程序为：95℃预热5min，35个循环(95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)，72℃延伸5min，4℃保存。
最后进行电泳检测，各个梯度均取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为100V，电泳时间为30min。以DNA分子量标记DL2000为对照进行检测。
结果显示拷贝数为3×105/mL、3×104/mL、3×103/mL的三个梯度均有较亮的469bp电泳条带，拷贝数为3×102/mL的有较弱的469bp电泳条带，拷贝数为3×101/mL的没有469bp电泳条带。
结果说明本发明所设计的PCR引物检测灵敏度为3×103/mL个拷贝数，检测灵敏度高。
实施例4检测方法特异性测试
待测样品如下：纯培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)。用裂解试剂(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，TaKaRa公司)分别提取各菌种的菌体基因组DNA并稀释备用。然后以所提菌体基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系和程序以及电泳的具体操作参照实施例1。
结果显示在紫外灯下，只有枯草芽孢杆菌有较亮的469bp电泳条带，其它的菌种均没有469bp电泳条带。说明设计的PCR引物检测特异性强，可以方便、准确地将枯草芽孢杆菌与其它不同种细菌区分开来。
Claims (10)
1.一种检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的引物对，其特征在于，该引物对中，一条引物和枯草芽孢杆菌16s-23s rRNA的基因序列相同，引物长度为15-30bp，另一条引物和枯草芽孢杆菌16s-23s rRNA的基因序列互补，引物长度为15-30bp，该引物对的扩增片段长度为200-800bp。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，一条引物的序列如SEQ IDNO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1或2所述的引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTP，10×PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照或者基因抽提试剂。
6.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以步骤1)所得的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述引物对进行PCR反应；
3)将步骤2)所得PCR反应产物进行电泳检测，具有权利要求1或2所述引物对扩增出的片段的样品中存在枯草芽孢杆菌。
7.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的待测样品为乳制品。
8.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR反应体系中包括0.5mmol/L的上游引物，0.5mmol/L的下游引物，0.2mmol/L的dNTP，1×PCR buffer，1.5mmol/L的Mg2+，0.02U/μL 的Taq DNA聚合酶，1.0-2.0ng/μL的DNA模板。
9.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR反应程序为：95℃，5min；30个循环95℃30S，55℃30S，72℃30S；72℃，5min；4℃保存。
10.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的检测方法，其特征在于，步骤3)所述的电泳检测中，采用序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示引物对的PCR反应产物，若有469bp核酸片段，则说明待测样品中存在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
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