CN110592243A - 维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针 - Google Patents

维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针。本发明设计了一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’‑CGA GCT TTT GCG CGT ATA‑3’，其反向引物为5’‑GCC ATT CCA ATA CAA AAC CAC ATA‑3’，以及探针、试剂盒和检测方法。本发明能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445生产菌株残留活菌及孢子，并开发了一种检测所涉及的引物、探针及检测方法。

Description

维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用 引物和探针
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针。
背景技术
维生素B2又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。为体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，导致多种疾病，是生命活动不可缺少的维生素。对于人和动物来说，必须从食物中获取维生素B2。人体每天大约需要0.3-1.8mg维生素B2，而动物饲料中必须含有1-4mg/kg的维生素B2才能满足其生长需要并提高营养的利用率。
目前维生素B2的生产途径主要采用微生物发酵法，主要使用的生产菌种有阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等，其中，枯草芽孢杆菌是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，可形成内生抗逆芽胞，无致病性，环境兼容性好，而且还具有良好的发酵基础等优点被作为最常用的生产菌株。由于天然菌株合成维生素B2的生产效率低，对其进行基因改造缩短发酵周期、提高维生素B2的产量是常用的方法，但是基因工程菌在构建过程中，通常需要引入外源抗性基因作为筛选标记。
转基因菌株在产品中的残留可能会使人和动物产生致病性、致癌、致突变；且其携带的抗性基因可能会在环境中转移导致人和动物对抗生素等药物产生抗性；转基因微生物或质粒上携带的抗药性基因也有可能通过基因转移而使得其他与人类和动物关系密切的致病性微生物获得该基因；另外，转基因微生物的转移也会对生态环境造成不利影响。活菌残留检测是一种对产品质量及安全性评估的有效方法，可以有效预防转基因微生物的转移对人、动物和生态环境造成危害。因此，对维生素B2产品中进行GM B.subtilis活菌及孢子进行残留检测是非常必要的，要严格控制微生物发酵产品的质量，保护产品的安全性和使用安全性。
常用的细菌活菌检测方法为平板培养法、代谢产物检测法、信使RNA法，但是这类方法只能检测活菌，不能特异性鉴别某一种菌株的残留，此外，有关孢子检测方面的内容很少。因此灵敏度高、特异性强、高通量和定量准确的实时荧光定量PCR技术被广泛应用于定性、定量检测致病菌、DNA残留等。人们常用16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌，但是该方法操作繁琐，对转基因菌株的鉴别具有局限性，且枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的16S rRNA基因相似度达到99％以上，无法用该方法进行区分，因此我们采用GMB.subtilis菌株的特有序列设计出qPCR的引物和探针，可特异性鉴别生产菌株的残留。
发明内容
本发明针对维生素B2产品中GM B.subtilis生产菌株活菌及孢子残留的检测开发了一种新的方法，该方法结合了选择性平板培养法和实时荧光定量PCR法。具体方法为在平板培养法的基础进行优化，采用氯霉素最低选择压力培养基排除杂菌的影响，且延长培养时间促使应激细胞恢复，能特异性检测生产菌株，且由于枯草芽孢杆菌是内生芽孢型菌株，对其进行孢子检测也是非常有必要的。为了排除抗性菌株的影响，进一步鉴别生产菌株的残留是必要的，采用qPCR方法特异性验证抗性平板中的菌株是否为GM B.subtilis生产菌株。本发明相对于传统的平板培养法，能消除杂菌的影响；相对于16S rRNA基因序列分析法而言，本发明所使用的引物和探针是根据GM B.subtilis特有的序列设计的，能特异性测定生产菌株活菌及孢子残留，且在实际样品测试中具有高的稳定性和特异性。
本发明提供了维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针，能有效检测维生素B2中生产菌株(GM B.subtilis)的残留活菌及孢子并判断维生素B2产品质量是否安全。
本发明提供的技术方案为一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCA ATA CAAAAC CACATA-3’。
一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测探针，探针序列为FAM-CGGATC TAA CGC ATG CTC CGC A-BBQ。
一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，包括所述的引物、所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。
而且，qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。
而且，鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留的方法为，往含有不同氯霉素浓度的平板计数培养基中加入的活化菌液，进行培养，且延长培养时间促进细菌生产，同时以生产菌株作为阳性对照，确定能抑制样品杂菌生长的最低氯霉素浓度即为氯霉素最小选择压力，再采用抗性平板计数培养基鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留。
而且，检测平板培养基上的菌为活菌的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。
而且，检测平板培养基上的菌为孢子的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；60℃条件下热处理30min，诱导枯草芽孢杆菌的芽孢萌发；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。
与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：本发明能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留活菌及孢子，并开发了一种检测所涉及的引物、探针及检测方法。该方法结合了平板培养法和qPCR法的优势，能特异性检测GMB.subtilis活菌及孢子残留，而且不会存在杂菌干扰、假阳性的结果。
附图说明
图1为生产菌株的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1是Marker，泳道2是生产菌株基因组DNA；
图2为通过琼脂糖凝胶电泳分析qPCR产物，1是Marker，其中最下方条带代表100bp，2、3和4泳道是扩增不同浓度基因组DNA的qPCR产物；
图3为qPCR产物的序列；
图4为批号H201606004FM样品中活产菌株的检测。A:维生素B2活菌平板98％；B：活菌检测阳性对照板；C：活菌检测阴性对照板。
图5为批号H201804004FM样品中活产菌株的检测。D：维生素B280％制剂活菌检测板；E：活菌检测阳性对照板；F：活菌检测阴性对照板。
图6为批号H201606004FM的样品中生产菌株的活孢子检测。H：维生素B2(98％)活孢子检测板；I：活孢子检测阳性对照板；J：活孢子检测阴性对照板。
图7为批号H201804004FM的样品中生产菌株的活孢子检测。K:维生素B2(80％)制剂活孢子检测板；L：活孢子检测阳性对照板；M：活孢子检测阴性对照板。
具体实施方式
针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445(简称GMB.subtilis)生产菌株残留活菌及孢子的检测，根据其携带氯霉素抗性基因设计了维生素B2中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCAATA CAAAAC CAC ATA-3’。以及维生素B2中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的qPCR检测探针，其探针序列为FAM-CGG ATC TAA CGC ATG CTC CGC A-BBQ。如表1所示：
表1 引物和探针序列
针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的检测，设计了维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物、权利探针和qPCR扩增组件。
上述引物是根据枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株特有的序列设计的，通过GM B.subtilis与B.subtilis 168的全基因组序列比对，发现了一个含有完整的氯霉素抗性基因的外源基因插入片段,该片段是同源重组时随机整合进去的，野生型菌株和其他菌株不存在，根据其携带氯霉素抗性基因片段的插入位点两侧的DNA序列设计了检测引物和探针。
为了建立qPCR检测方法以及验证方法的可行性，我们首先验证引物和探针的特异性。以下方法用于验证引物的特异性。首先提取GM B.subtilis生产菌株总DNA，将提取到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度法测定了基因组DNA的质量和浓度，OD260/OD280的值为1.950，从图1的凝胶电泳可以看出基因组DNA完整无降解，无RNA或蛋白质污染。
将提取到的生产菌株基因组DNA稀释成三个不同的浓度进行qPCR扩增，再用琼脂糖凝胶电泳对qPCR产物进行分析，结果如图2所示，三条清晰的条带为qPCR产物(76bp)，且再无任何其他产物的条带，说明qPCR扩增为特异性扩增，引物特异性非常强。将PCR产物克隆到pMD-18T载体上并测序。测序结果如表2和图3所示。该序列确认是我们的目标序列。
表2 qPCR产物序列
利用直接从枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株提取的基因组DNA，验证上述维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物和探针的特异性。
枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株基因组DNA提取方法，根据美基试剂盒protocol进行操作，具有以下步骤：
1.将GM B.subtilis工程菌在含抗生素的培养基中过夜培养。室温下，取3mL培养液在12000×g条件下离心1min。
2.加入220μL STE缓冲液、5μLRNA酶和30μL溶菌酶至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴10min。
3.加入20μL SDS缓冲液和10μL蛋白酶K至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30min。
4.加入250μL DL缓冲液和250μL无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。注：这一步若有絮状沉淀出现，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀。
5.把DNA纯化柱装在2mL收集管中。把第五步获得的混合液(包括沉淀)转移至柱子中。10000×g离心1min。
6.倒弃流出液，把柱子装回收集管中。加入500μL洗涤液GW1(已用乙醇稀释)至柱子上洗涤去除蛋白质和其它杂质。10000×g离心1min。
7.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μL洗涤液GW2(已用乙醇稀释)至柱子中洗涤去除盐分。10000×g离心1min，倒弃流出液，重复三次。
8.把柱子装回收集管中，10000×g离心2min；这一步可去除柱子中残留的乙醇。
9.将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30-50μL预热至65℃缓冲液AE至柱子膜中央。放置3min。10000×g离心1min，重复一次。
10.丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
对枯草芽孢杆菌GM B.subtilis基因组DNA的qPCR分析如下：
qPCR在25μL的PCR反应体系中进行，将GM B.subtilis全基因组DNA梯度稀释为10ng/g，1ng/g，10-1ng/g，10-2ng/g，10-3ng/g，10-4ng/g，10-5ng/g，10-6ng/g八个不同浓度，作为后续qPCR扩增的模板。
PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液(Taq TM探针即Taqman探针，是一种检测寡核苷酸的荧光探针)、每个引物0.4mM，0.1mM探针和2μL模板DNA。qPCR扩增热循环条件为先95℃变性10min，然后经过45个循环(94℃变性40s，60℃复性延伸)扩增出目的片段。
为了防止平板培养过程中杂菌的繁殖影响到可能存在的生产菌株繁殖，采用选择性培养基进行活菌及孢子检测。根据其携带氯霉素抗性基因片段的特点，该片段包含完整的氯霉素抗性基因，因此我们采用氯霉素作为筛选标记。首先为了确定氯霉素最小选择压力，将样品加入到LB液体培养基中培养，延长培养时间促进菌株的生长和检测，再将得到的杂菌分别加入到含有不同浓度的氯霉素的平板计数培养基上，测得氯霉素最小选择压力——测得抑制杂菌生长的最低氯霉素浓度为氯霉素对样品的最小选择压力，在该浓度下阳性对照的生产菌株应能正常生长，否则结果无效。随后我们用含该氯霉素浓度的抗性平板计数培养基进行生产菌株的活菌残留检测。
一、氯霉素最小选择压力的确定
我们采用直接将样品加到LB液体培养基中活化，然后再涂布于含有不同浓度的氯霉素平板计数琼脂培养基(plate count agar，PCA)平皿上，确定氯霉素最小选择压力，可以防止在后续测定过程中杂菌的繁殖影响到可能存在的生产菌株的繁殖，同时延长培养时间，进一步促进可能存在的菌株生长，增加结果的准确性。
取1g维生素B2样品加到50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，摇瓶培养24小时，得到样品杂菌。取同一数量级数的生产菌株和样品杂菌，分别加入到不同浓度氯霉素的平板计数琼脂培养基(plate count agar，PCA)平皿上。如表3所示，每种浓度做两个平行样，同时将这两种菌加入到无抗生素的PCA平板上做阳性对照，37℃培养72小时，观察结果。结果表明，阳性对照的平板上菌株均能正常生长，培养基和培养条件均能使生产菌株的活细胞生长。培养条件为37℃ 72小时。取能抑制样品杂菌生长的最低氯霉素浓度为氯霉素对样品的最小选择压力，并且在此浓度下对照的生产菌株应能正常生长，所对应的氯霉素最低选择压力为5mg/L。
表3为氯霉素最低选择压力的测定
样本细菌：样本中的细菌作为样本细菌进行培养。生长：检测到可见菌落无生长：未发现可见菌落。阳性对照菌株：枯草芽孢杆菌KCCM-10445
LB培养基(/L)：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，25℃时pH 7.0±0.2。PCA(/L)：5g色氨酸，2.5g酵母提取物，1g葡萄糖，15g琼脂，25℃时pH 7.0±0.2。二、维生素B2生产菌株活菌检测
通过在抗性的培养基中活化，抑制了样品中可能存在的杂菌的增殖，从而使样品中原本可能少量存在的生产菌株能在平板上长出菌落，同时为排除高浓度维生素B2对生产菌株生长的影响，导致核黄素活化的样品可能无法长出菌株，所以增加了一组在核黄素样品中加入生产菌株进行阳性对照。
称取10g维生素B2样品置于盛有90mL蛋白胨缓冲液中充分混匀。分别吸取1mL样品匀液于10个无菌平皿内。同时，分别吸取1mL空白蛋白胨缓冲液加入到两个无菌平皿中作空白对照。及时将15mL～20mL冷却至46℃的含氯霉素平板计数培养基(PCA)倒入平板中，旋转平板使其均匀混合。待琼脂固化后，将平板倒置培养，37℃培养72小时。同时将少量生产菌株(每平板10～1000个细胞)添加到另一相同样品中进行阳性对照。观察平板上的结果，阳性对照板上应该有生产菌株生长，证明培养基和培养条件能使产品中剩余的任何可能的生产菌株活细胞生长，与此同时阴性对照板上不应观察到菌落。如果样品板上没有菌落，则意味着样品中没有生产菌株的活细胞；如果样品板上有菌落，最终结果计数，单位CFU/g。然后提取这些菌落的基因组DNA，进行实时荧光定量PCR分析，以确定样品板上是否存在活的生产菌株。
我们分析了三个独立批次的维生素B2样品，每批次平行测定三次。样品为维生素B298％产品三批(批号：H201606004FM、H201606005FM、H201606006FM)。三批维生素B2 80％制剂(批号：H201804004FM、H201804005FM、H201804006FM)，维生素B2 98％和80％九次实验的结果一致，随机取一组结果。结果如图5和图6所示：蛋白胨缓冲液(/L)：10g蛋白胨，5g氯化钠，3.5g磷酸二钠和1.5g磷酸二氢钾，25℃时pH 7.2±0.2。其中，图4批号H201606004FM样品中活产菌株的检测。A:维生素B2活菌平板98％；B：活菌检测阳性对照板；C：活菌检测阴性对照板。图5批号H201804004FM样品中活产菌株的检测。D：维生素B280％制剂活菌检测板；E：活菌检测阳性对照板；F：活菌检测阴性对照板。
表4为维生素B2 98％和维生素B2 80％活菌检测结果
活菌：用PCA检测样品中的生产菌株活菌；CFU/g：每克样品的菌落数；阳性对照：在样品中加入生产菌株的活细胞；阴性对照：用蛋白胨缓冲液代替样品进行检测。
三、维生素B2生产菌株活孢子检测。
枯草芽孢杆菌的孢子抗逆性极强，是生物界抗逆性最强的一种生物结构，在极冷、极热、极酸等环境中能存活十几年之久，同时它对外界环境的变化也是极其敏感，只要发现适宜萌发的因子，芽孢就萌发，生长成营养细胞。由于这一特性，对维生素B2中生产菌株的孢子进行检测是非常有必要的。
为了使样品中潜在的孢子萌发，我们进行了孢子萌发程序。将10g均质样品悬浮于90mL蛋白胨缓冲液中，充分混匀，在60℃下进行热处理30分钟诱导枯草芽孢菌的芽孢萌发，然后分别吸取1ml样品匀液于10个无菌平皿内，同时分别吸取1mL空白蛋白胨缓冲液加入到两个无菌平皿内中进行空白对照。及时将15mL～20mL冷却至46℃的含氯霉素平板计数培养基(PCA)倒入平板中，旋转平板使其均匀混合。琼脂固化后，倒置培养板，37℃培养72小时。同时将少量(每板10～1000个细胞)生产菌株添加到另一个样品中进行阳性对照。观察平板上的结果，应在阳性对照板上观察菌落，阴性对照板上不应观察菌落。如果样品板上没有菌落，则意味着样品中没有生产菌株的活细胞；如果样品板上有菌落，最终结果计数，单位CFU/g。然后提取这些菌落的基因组DNA，进行实时PCR，以确定样品板上是否有生产菌株。我们分析了三个独立批次的产品，每批次平行测定三次。图6批号为H201606004FM的样品中生产菌株的活孢子检测。H：维生素B2(98％)活孢子检测板；I：活孢子检测阳性对照板；J：活孢子检测阴性对照板。图7批号为H201804004FM的样品中生产菌株的活孢子检测。K:维生素B2(80％)制剂活孢子检测板；L：活孢子检测阳性对照板；M：活孢子检测阴性对照板。
表5为维生素B298％和维生素B280％活菌检测结果
活菌：用PCA检测样品中的生产菌株活孢子；CFU/g：每克样品的菌落数；阳性对照：在样品中加入生产菌株的活细胞；阴性对照：用蛋白胨缓冲液代替样品进行检测。
四、qPCR-特异性验证
为了测定平板中的菌株是否为生产菌株，需要将有菌落生长平板上的菌提取DNA，进行qPCR验证，而且该方法可以有效防止死菌假阳性结果。
如若样品平板中有菌株存在则可能存在生产菌株活菌残留，需要进一步确认样品中是否存在生产菌株，以排除其他抗性菌株的影响。因此我们挑取平板上的菌落提取其基因组DNA进行特异性qPCR试验来鉴定平板上的生长菌株是否为GM B.subtilis，同时还可以排除死菌DNA的假阳性结果。首先我们根据GM B.subtilis基因改造过程中随机同源重组的特异性片段插入位点两侧的DNA序列设计引物和探针，挑取平板上的菌落，提取其基因组DNA，以生产菌株的基因组DNA作为阳性对照，和无DNA模板试剂作为阴性对照进行qPCR实验，鉴定样品中是否存在生产菌株活菌及孢子残留。所使用的引物探针已在表1中写明。
一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，包括所述的引物、所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。
具体为挑取平板上的菌落到0.9％NaCl无菌溶液中，采用试剂盒提取基因组DNA，以生产菌株DNA作为阳性对照，以无模板试剂作为空白对照；若PCR结果呈阳性则说明该菌株是生产菌株，若呈阴性则说明该菌株不是生产菌株，由于试验样品维生素B2 98％和维生素B2 80％中不存在生产菌株的活菌和孢子，我们只显示了批号为H201606004FM的维生素B298％阳性对照板菌落的qPCR结果，如表6所示。
表6：批号H201606004FM中98％维生素B2阳性对照板菌落的鉴定
N/A：No amplification，不适用。
综上可知，本方法针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留活菌及孢子的检测，非常精确。
该方法为检测基因工程菌活菌残留、孢子残留提供思路：
前述的活菌及孢子残留检测方法对于其它细菌，特别是革兰氏阳性菌属的活菌检测也是适用的，只需将对应于GM B.subtilis的引物对、探针替换为对应于其它细菌的引物对、探针即可。
序列表
<110> 湖北广济药业股份有限公司
<120> 维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagcttttg cgcgtata 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccattccaa tacaaaacca cata 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggatctaac gcatgctccg ca 22

Claims (7)

1.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，其特征在于引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCTTTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCAATA CAAAAC CACATA-3’。
2.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测探针，其特征在于：探针序列为FAM-CGGATC TAACGCATG CTC CGCA-BBQ。
3.一种维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：包括权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。
4.根据权利要求3所述的维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。
5.根据权利要求3所述的维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：鉴别平板培养基上活菌及孢子是否存在残留的方法为，往含有不同氯霉素浓度的平板计数培养基中加入的活化菌液，进行培养，且延长培养时间促进细菌生产，同时以生产菌株作为阳性对照，确定能抑制样品杂菌生长的最低氯霉素浓度即为氯霉素最小选择压力，再采用抗性平板计数培养基鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留。
6.根据权利要求3所述的维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：检测平板培养基上的菌为活菌的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。
7.根据权利要求3所述的维生素B2中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：检测平板培养基上的菌为孢子的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；60℃条件下热处理30min，诱导枯草芽孢杆菌的芽孢萌发；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。
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