CN102533677A

CN102533677A - 一种疟疾疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102533677A
Application number: CN2012100055734A
Authority: CN
Inventors: 吴昕昕; 陈剑清; 舒特俊; 张耀洲
Original assignee: TEFEI (TIANJIN) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TEFEI (TIANJIN) BIOMEDICINE TECHNOLOGY CO LTD; Tianjin International Joint Academy Of Biotechnology & Medicine; TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-10
Also published as: CN102533677B

Abstract

本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP11_9C)表达于家蚕杆状病毒表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒制备疟疾疫苗。相比于传统的疟疾疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。

Description

一种疟疾疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及疟疾疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球大约有3.2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约100万人的性命并导致4亿人感染，而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和血液传播等新的传播方式的出现使得疟疾疫情的控制面临更加严峻的挑战。每年感染疟疾致死的人群中，92%为五岁以下的儿童。因而疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。

疟原虫生活史有多个时期，每个生活时期具有多种抗原，而且每种抗原具有多个表位，而不同宿主的免疫反应也不相同，所有的这些因素使得疟疾疫苗的研究变得异常困难。传统的疟疾治疗主要依赖于药物治疗，氯喹是一种使用方便、疗效好且经济的红内期抗疟药物，氯喹可以与恶性疟原虫体内的血红蛋白降解产物高铁血红素结合从而影响恶性疟原虫的解毒，来达到杀灭疟原虫的目的。任何一种药物经过长时间的使用之后都会使其作用受体对其产生一定的耐受性，由于药剂量不足、治疗不彻底、药物半衰期长、疟疾传播密度高等都有可能致使恶性疟原虫对氯喹产生抗性，因此药物疗措施已面临着严重的挑战。

疟疾的临床症状主要发生在疟原虫裂殖子孢子在人体红细胞内无性增殖阶段，目前疟疾疫苗研究的热点主要是基于阻止此阶段疟原虫的无性裂殖来预防疟疾的感染。裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP1_19C)在子孢子侵染红细胞后仍然存在于裂殖子表面，可诱导机体T细胞和B细胞产生免疫应答，因此是当前最重要的疟疾疫苗研制的候选抗原位点之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的疟疾疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP1_19C)展示在家蚕杆状病毒表面MSP1_19C基因通过与GP64基因的跨膜(TM)基因与信号肽(SP)基因相连，通过信号肽(SP)基因的引导和跨膜(TM)基因的锚定，在病毒表达和复制过程中将MSP1_19C蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原进行生产，相比于传统疟疾疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5602。

上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c的制备方法，包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过BamHI/EcoR I和XhoI/HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；

(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因MSP1_19c序列，其5’和3’端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19C；

(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19C转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40h~48h后挑取白斑，培养20h~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物、MSP1_19c引物做PCR鉴定；

(4)取步骤(3)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0℃~4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物、MSP1_19c引物做PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c。

本发明还提供上述重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c表达的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

上述抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19C感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕蛹；

(3)收集表达的上述抗原蛋白。

本发明进一步提供上述重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c在疟疾疫苗制备中的应用。

本发明还提供上述蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。

本发明实现的技术效果如下：

1、世界上首次利用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达恶性疟原虫抗原蛋白，制备疟疾疫苗；

2、利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器高效表达真核生物蛋白，可以达到蛋白的正确折叠，从而能保证完整的抗原性；

3、蚕蛹作为天然食品，且杆状病毒对哺乳动物无感染，致热源性少，疫苗安全性高；

4、本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的疟疾疫苗应用价值大。

附图说明

图1显示的是融合杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体pFastBacI-gp64；

图2显示的是含有PfMSP1_19c的重组基因结构示意图； pPolh：多角体启动子；SP：gp64基因的信号肽序列；PfMSP1_19c：恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段；TM：gp64基因的跨膜区序列；Poly(A)：多腺苷酸化信号；

图3显示的是GP64信号肽SP基因的PCR扩增结果图；M：10kb DNA标记；1：信号肽 SP的 PCR产物；

图4显示的是GP64基因跨膜结构域TM基因的PCR扩增结果；M：10kb DNA 标记；1′：跨膜结构域TM的 PCR产物；

图5显示的是MSP1_19c基因的PCR扩增；M：10Kb DNA分子量标准；1：MSP1_19C基因扩增的PCR产物；

图6显示的是重组质粒的鉴定；M：10Kb DNA 分子量标准；1：pFastBacI-gp64-MSP1_19C重组质粒的双酶切产物；2：pFastBacI-gp64-MSP1_19C重组质粒的PCR产物；

图7显示的是Bacmid-gp64-MSP1_19c的鉴定；M：10Kb DNA分子量标准；1：M13上、下游引物PCR结果；2：MSP1_19c引物PCR结果；

图8A显示的是重组病毒在细胞中的PCR检测结果（用M13通用引物鉴定）； M：10Kb DNA分子标准量大小；1：M13上、下游引物的PCR产物;

图8B显示的是重组病毒在细胞中的PCR检测结果（用MSP119c基因引物鉴定）；M：10Kb DNA分子标准量大小；1：MSP1_19c引物的PCR产物；

图9A显示的是MSP1_19C蛋白在蚕蛹中表达中的SDS-PAGE检测结果；M：标记；1：正常蚕蛹上清；2：正常蚕蛹沉淀；3：发病蚕蛹上清；4：发病蚕蛹沉淀；

图9B显示的是MSP1_19C蛋白在蚕蛹中表达中的Western Blotting检测结果；M：标记；1：正常蚕蛹上清；2：正常蚕蛹沉淀；3：发病蚕蛹上清；4：发病蚕蛹沉淀；

图10A显示的是离心过程均取样的SDS-PAGE检测结果；M：标记；1：超离上清；2：超离沉淀；3：300kD超滤流出；4：300kD超滤截留；5：8000rpm上清；6：8000rpm沉淀；7：15000rpm上清；8：15000rpm沉淀；

图10B显示的是离心过程均取样的Western Blotting检测结果；M：标记；1：超离上清；2：超离沉淀；3：300kD超滤流出；4：300kD超滤截留；5：8000rpm上清；6：8000rpm沉淀；7：15000rpm上清；8：15000rpm沉淀。

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP1_19C)展示在家蚕杆状病毒表面(如图2)，MSP1_19C基因通过与GP64基因的跨膜(TM)基因与信号肽(SP)基因相连，通过信号肽(SP)基因的引导和跨膜(TM)基因的锚定，在病毒表达和复制过程中将MSP1_19C蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。

下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。

实施例1：重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19c的构建

以杆状病毒gp64序列为模板，分别用引物P1(如SEQ ID NO：1所示)、P2(如SEQ ID NO：2所示)和P3(如SEQ ID NO：3所示)、P4(如SEQ ID NO：4所示)进行PCR扩增gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)，PCR产物通过BamHI、EcoR I和XhoI、HindⅢ(均购自Fermentas 公司)双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFstBacI-gp64。以恶性疟原虫3D7标准株cDNA(由云南昆明科学院杨照青教授惠赠)为模板，用引物P5(如SEQ ID NO：5所示)、P6(如SEQ ID NO：6所示)进行PCR扩增恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD抗原位点的DNA序列，PCR产物通过EcoRI和XhoI (均购自Fermentas 公司)双酶切插入展示载体pFastBacI-gp64(见图1)，构建重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19c。该重组转移载体包括多角体启动子（pPolh）、gp64信号肽（SP）和跨膜区（TM）、恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端19kD片段（PfMSP1_19c），结构如图2所示。将含有PfMSP1_19c（融合有gp64 ）的通过EcoRⅠ和XhoⅠ插入到多角体启动子下，利用该多角体启动子启动PfMSP1_19c融合基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)，C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端19kD片段（PfMSP1_19c）通过杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽（SP）引导和跨膜区（TM）锚定展示于杆状病毒表面，形成刺猬状（伪病毒），末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的翻译有重要作用。引物序列设计如下：

(1)gp64信号肽(SP)基因 (如SEQ ID NO：7所示)的扩增

以gp64 DNA为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。

在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：

10×PCR Buffer 10μl

25mmol MgCl₂ 8μl

2.5 mmol dNTPs 8μl

Psp1 1μl

Psp2 1μl

模板 1μl

KOD-Plus DNA聚合酶 1μl

加无菌双蒸水至 100μl

各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，结果显示出现与预期大小一致的DNA条带(见图3), 同时切胶回收目的片断。

(2)gp64跨膜区(TM)基因(如SEQ ID NO：9所示)的扩增

100μl的反应体系同上，所用引物为Ptm1 和Ptm2，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断(见图4)，结果显示出现与预期大小一致的DNA条带同时切胶回收目的片断。

(3)MSP1_19c基因(如SEQ ID NO：8所示)的扩增

以恶性疟原虫3D7标准株cDNA为模板，PCR反应参数为94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火30s，68℃复性延伸90s，35个循环，68℃延伸10min。

在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：

10×PCR Buffer 5μl

2.5mmol MgSO₄ 2μl

2.5 mmol dNTPs 5μl

Pama1 5μl

Pama2 1.5μl

模板 1μl

KOD-Plus DNA聚合酶 1μl

加无菌双蒸水至 50μl

各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计35个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断(见图5)，结果显示出现与预期大小一致的DNA条带同时切胶回收目的片断。

(4)载体构建

将上述PCR扩增获得的gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)分别通过BamHI、EcoR I和Xho I、HindⅢ(均购自Fermentas 公司)双酶切插入pFastBac I载体多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFstBac I-gp64。然后将MSP1_19c的PCR产物通过EcoR I和Xho I双酶切插入展示载体pFastBacI-gp64中(见图1)，构建重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19c。通过酶切、PCR分析鉴定目的条带与载体正确连接(见图6)。PCR体系及反应程序同(3)，酶切体系及反应条件如下：

重组载体pFastBacI-gp64-MSP1_19c分别用EcoRI和XhoI双酶切消化。反应条件如下：

PCR产物/载体	25 μL
		EcoRⅠ	1 μL
XhoⅠ	1 μL
		10×Buffer	5 μL
ddH₂O	18 μL
		Total	50 μL

分别轻微震荡混匀，37℃反应30min。

实施例2：家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c的获得及扩增

鉴定重组成功的pFastBacI-gp64-MSP119c转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen 公司)，在含有卡那霉素(Kan)、庆大霉素(Gen)、四环素(Tet)、X-gal和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养48h后挑取白斑，培养24h后用异丙醇抽提基因组，用M13通用引物及MSP119c引物做PCR鉴定，结果显示，分别在2500bp~3000bp之间及400bp~500bp之间出现特异性条带(见图7)。

鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞(方法参照Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent说明书)，发病(显微镜下观察)后获得一代病毒悬液4℃保存，试剂盒提取病毒基因组并用M13通用引物及MSP119c基因引物进行PCR鉴定，结果显示分别在2500bp~3000bp之间(见图8A)及400bp~500bp之间出现特异性条带(见图8B)，获得病毒株命名为BmNPV-gp64-MSP119c。取发病的细胞，将其轻轻混匀，并转移到无菌Eppendorf管中，800g离心5 min，小心取上清液即为一代病毒株，于4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物、MSP1_19c引物做PCR鉴定。取80 μL第一代病毒感染健康的家蚕BmN细胞(购自Invitrogen 公司)，72 h后收获第二代重组病毒株，以相同方法扩增该病毒至获得第四代重组病毒株。

实施例3: 家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c在家蚕蚕蛹中的表达和鉴定

选取上簇后第6-9天的蚕蛹(为一代杂交种菁松×皓月，由浙江中奇生物药业股份有限公司)，除去坏死、败血、状况不好的蚕蛹以减少蚕蛹注射后的细菌感染率，用70%浸润酒精消毒后，于节间膜处分别接种1~5μl实施例3所得第四代重组病毒，注射后放置在人工气候箱内，25℃保护4-5天，让重组病毒充分繁殖，然后收集发病的蚕蛹，取部分用于检测，其余-80℃保存备用。

分别取10g上述发病蚕蛹进行转录翻译水平检测基因的表达。取发病蚕蛹置于研钵中充分研磨后置于离心管中，12000rpm，4℃离心10min，分别取上清沉淀制样进行SDS-PAGE电泳，以未感染病毒的正常蚕蛹上清沉淀为阴性对照。电泳结束后转移到 PVDF膜(购自Sigama公司，30cm²)上，以抗MSP1标准阳性羊血清(购自北京鼎国生物技术公司)为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG (HRP) (购自北京鼎国生物技术公司)为二抗，DAB显色检测目的蛋白(如SEQ ID NO：10所示)的表达，如图9A所示，发病蚕蛹上清样品在26kDa~34kDa之间约为28kDa处有特异性条带，而其沉淀样品及正常蚕蛹样品均无条带，说明目的蛋白在蚕蛹中表达，且主要分布在上清液中，但其表观分子量比预测分子量(18.7kDa)偏大，推测重组蛋白在家蚕蛹中进行了翻译后修饰，其与抗MSP1标准阳性羊血清的特异性反应表明重组蛋白具有良好的反应原性(见图9 B)。

实施例4：疟疾疫苗的获得

(1)从蚕蛹中分离纯化重组病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c(疟疾疫苗)

a．取100g经重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c感染的蚕蛹样品，4℃解冻后，与100ml预冷灭菌ddH₂O混合，匀浆至浆液细致均匀即可；

b．将匀浆液加入500ml离心管中，配平4℃，8000rpm离心60min，取200ml上清，小心弃去油脂，重复离心三次；

c．将8000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平4℃，15000rpm离心30-120min，取上清用4层纱布过滤，弃油脂，重复离心三次；

d．15000rpm离心后取100ml上清，进行下一步超滤。

(2)超滤

使用中空纤维膜进行超滤，选择截留分子量为300KD的中空纤维素进行清洗后加样。将上述步骤d中的100ml上清液置于超滤系统中，超滤浓缩至10ml之后，用2L无菌超纯水稀释后再进行超滤，最后取50ml超滤截留液。

(3)超速离心

将上述超滤截留液置于25ml超速离心管中，配平置于超速离心机中(购自Hitachi 公司),4℃，40000rpm离心1h。离心结束后，取1ml上清制样，沉淀用2ml超纯无菌水重悬，所得悬液即为纯化后病毒粒子。上述离心过程均取样进行SDS-PAGE电泳及Western Blotting检测(见图10A、图10B)，检测方法同实施例2。从图10A、图10B中可以看出，MSP1_19C蛋白在8000rpm、15000rpm超滤截留和超离的沉淀中均存在，并且能够与抗MSP1标准阳性羊血清的特异性反应表明在蚕蛹中表达的MSP1_19C蛋白具有良好的反应原性，并且该方法能够有效地分离纯化重组病毒。

(3)疫苗效果

疟疾疫苗进行动物体(新西兰雄兔、2.5kg，3-4个月，购自天津奥易动物饲养中心)试验，皮下注射，注射剂量为0.1-50mg/kg，2-4周后检测抗体效价，其保护抗体效价大于1：150，攻毒试验结果显示该剂量疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 特菲(天津)生物医药科技有限公司

<120> 一种疟疾疫苗及其制备方法

<130> 111703-I-CP-TJYU

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

cgcggatcca tggtaggcgc tattgtttta tacgtgcttt tggcggcgg 49

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

cgacgtaggc ctttgaattc baccgccgca aaggcagaat gcgccggcgc cgccgccaaa 60

agcacgta 68

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

ccgctcgaga tggctgaagg cgaat 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

cccaagcttt taatattgtc tactat 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ccggaattct ttaaaaaccc ttacgac 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

gacctcgagg gaactgcaga aaatacc 27

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> gp64信号肽基因

<400> 7

atggtaggcg ctattgtttt atacgtgctt ttggcggcgg cgcattctgc ctttgcggcg 60

<210> 8

<211> 501

<212> DNA

<213> PfMAP1-19c基因

<400> 8

tttaaaaacc cttacgactt cgaagcaatt aaaaaattga taaatgatga tacgaaaaaa 60

gatatgcttg gcaaattact tagtacagga ttagttcaaa attttcctaa tacaataata 120

tcaaaattaa ttgaaggaaa attccaagat atgttaaaca tttcacaaca ccaatgcgta 180

aaaaaacaat gtccagaaaa ttctggatgt ttcagacatt tagatgaaag agaagaatgt 240

aaatgtttat taaattacaa acaagaaggt gataaatgtg ttgaaaatcc aaatcctact 300

tgtaacgaaa ataatggtgg atgtgatgca gatgccacat gtaccgaaga agattcaggt 360

agcagcagaa agaaaatcac atgtgaatgt actaaacctg attcttatcc acttttcgat 420

ggtattttct gcagttcctc taacttctta ggaatatcat tcttattaat actcatgtta 480

atattataca gtttcattta a 501

<210> 9

<211> 132

<212> DNA

<213> gp64跨膜区基因

<400> 9

atggctgaag gcgaattggc cgccaaattg acttcgttca tgtttggtca tgtagccact 60

tttgtaattg tatttattgt aattttattt ttgtactgta tggttagaaa ccgtaatagt 120

agacaatatt aa 132

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> PfMSP1-19c蛋白

<400> 10

Phe Lys Asn Pro Tyr Asp Phe Glu Ala Ile Lys Lys Leu Ile Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Lys Lys Asp Met Leu Gly Lys Leu Leu Ser Thr Gly Leu Val

20 25 30

Gln Asn Phe Pro Asn Thr Ile Ile Ser Lys Leu Ile Glu Gly Lys Phe

35 40 45

Gln Asp Met Leu Asn Ile Ser Gln His Gln Cys Val Lys Lys Gln Cys

50 55 60

Pro Glu Asn Ser Gly Cys Phe Arg His Leu Asp Glu Arg Glu Glu Cys

65 70 75 80

Lys Cys Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Glu Gly Asp Lys Cys Val Glu Asn

85 90 95

Pro Asn Pro Thr Cys Asn Glu Asn Asn Gly Gly Cys Asp Ala Asp Ala

100 105 110

Thr Cys Thr Glu Glu Asp Ser Gly Ser Ser Arg Lys Lys Ile Thr Cys

115 120 125

Glu Cys Thr Lys Pro Asp Ser Tyr Pro Leu Phe Asp Gly Ile Phe Cys

130 135 140

Ser Ser Ser Asn Phe Leu Gly Ile Ser Phe Leu Leu Ile Leu Met Leu

145 150 155 160

Ile Leu Tyr Ser Phe Ile

165

Claims

1.一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5602。

2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过BamH I/EcoR I和XhoI/HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；

(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-MSP1_19C转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养20~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物、MSP1_19c引物做PCR鉴定；

3.种权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c表达的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

4.一种权利要求3所述抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19C感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕蛹；

(3)收集表达的权利3所述抗原蛋白。

5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP1_19c在疟疾疫苗制备中的应用。

6. 一种权利要求3所述的蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。