CN102533658A - 制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和细胞培养基及细胞培养基的应用。本发明的技术方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L、所述添加物为D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。本发明无血清培养基及培养方法解决了重组人干扰素β1a细胞培养得率低，活性低的问题，本发明最终获得的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达1×10⁶IU/ml以上，ELISA法检测干扰素β1a含量达0.8g/L以上。

Description

制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种制备人干扰素β1a的细胞培养方法和细胞培养基及细胞培养基的应用。

背景技术

人干扰素β(IFN-β)是具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要细胞因子，主要由成纤维细胞和某些上皮细胞产生，普通的干扰素诱生剂，例如病毒、双链RNA和一些微生物均能够诱导IFN-β的产生。自然IFN-β是一种糖蛋白(糖分约占20％)，相对分子质量约20000，由166个氨基酸组成，有21个氨基酸组成的信号肽，在S-M之间切开。在分子的第17位、31位、141位为Cys，在31位和141位之间形成的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。hIFN-β基因长777bp，位于染色体9p22，与IFN-α基因簇邻近。人白细胞干扰素与成纤维细胞干扰素之间在核苷酸水平上有45％的同源性，在氨基酸水平上有29％的同源性。IFN-α与IFN-β基因均无内含子。IFN-α与IFN-β结合于同一受体，但后者与受体的亲和力大于前者。

美国FDA已于1993批准IFN-β1b(大肠杆菌表达)和1996年批准IFN-β1a(CHO细胞表达)用于治疗多发性硬化症(MS)。目前，IFN-β是能够控制MS反复发作的唯一药物。据估计，我国MS患者至少有数十万人，迄今尚无特效药。CHO细胞与大肠杆菌表达的IFN-β1a相比，具有较高的抗病毒比活性，较小的副作用以及较长的半衰期。

中国仓鼠卵巢细胞-CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清<常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养，还是不能忽视血清带来的问题(如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养)。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发无血清培养基。

目前国内干扰素β1a研究较少，产干扰素IFN-β1a(CHO细胞表达)的培养基配方效率较低，亟需开发一种适合工业化生产，成本低，产量高的产重组人干扰素β1a的细胞培养基和培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种产人干扰素β1a的细胞的培养方法和细胞培养基及培养基的应用，从而得到一种适合工业化生产，活性高，产量高的产干扰素β1a细胞培养方法。

本发明的技术方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L、所述基础培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基，所述添加物为D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

优选的上述培养基中，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。

优选的上述培养基中，所述基础培养基为SFM培养基，所述SFM培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基。

优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM。

优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸钠：0.5mM、磷酸二氢钾：0.5mM、氯化钠：20mM。

本发明的另一个方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞培养方法，包括以下步骤

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞冻存管复苏，传代培养，转瓶培养；

b、按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行细胞罐培养，每天转速增加10rpm，最终加至120rpm，采用含血清培养基培养5-10天，在灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至3所述的制备人干扰素β1a的细胞培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

优选的上述方法包括以下步骤：

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞冻存管复苏，通过25cm²、75cm²、175cm²方瓶传代培养15天，传代5-7代，3L转瓶培养7-12天，获得种子细胞量5.0×10⁷-1×10⁹cells；

b、5L细胞罐培养：按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加10rpm，最终加至120rpm。采用含含血清培养基培养5-10天，所述含血清培养基为含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培养基，灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换上述无血清培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右。

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

本发明的又一个方案为提供上述制备人干扰素β1a的细胞培养基在含表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞培养中的应用。

本发明的有益效果为：本发明无血清培养基及培养方法解决了重组人干扰素β1a细胞培养得率低，活性低的问题，在未作培养基成分优化前，仅用商业用(基础培养基)无血清培养基，干扰素活性仅在1×10⁴IU/ml～1×10⁵IU/ml之间，干扰素含量在0.5g/L左右。而本发明最终获得的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达1×10⁶IU/ml以上，ELISA法检测干扰素β1a含量达0.8g/L以上。

附图说明

图1：D-半乳糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；

图2：D-甘露糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；

图3：N-乙酰氨基葡萄糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；

图4：D-葡萄糖各浓度同水平3个活性值之和变化趋势图；

图5：D-半乳糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；

图6：D-甘露糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；

图7：N-乙酰氨基葡萄糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；

图8：D-葡萄糖各浓度同水平3个干扰素含量之和变化趋势图；

图9：上罐培养过程中生长动力学曲线；

图10：上罐培养过程中葡萄糖浓度及培养基流加曲线。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

中国发明申请201010111886.9，审请人为深圳市职业技术学院，公开了一种重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法。本发明的带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的CHO细胞即为上述方法制得，本文中的名称和方法等沿用上述发明。

本发明的基础培养基为培养CHO细胞常用的基础培养基。

本发明涉及一种重组人干扰素β1a细胞培养基及培养方法，培养基成分包括：基础(CHO)培养基、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-葡萄糖。(以往培养基仅用基础(CHO)培养基，或加一些培养基厂家的添加剂)。添加所述四种糖是因为：真核细胞中的蛋白质在进行糖基化时多采用n连接、o连接及C-甘露糖连接等的方式将低聚糖与蛋白进行连接，形成糖蛋白，糖基化是生物体最常见的蛋白质修饰作用，它可以影响蛋白质的折叠、定位、分拣、投送以及蛋白质的可溶性、抗原性、生物活性等，为了提高干扰素β1a的糖基化程度，我们添加了利于O连接的N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖，利于C-甘露糖连接的D-甘露糖，以及考虑到利于细胞生长的能源物质D-葡萄糖。

实施例1

本发明人干扰素β1a的细胞培养基的配置，其组分包括基础培养基和添加物，所述添加物为D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-葡萄糖，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。

本发明所述基础培养基即SFM培养基(无血清培养基)，本实施例中的基础培养基为GIBCO公司的CHO-S-SFM II培养基、HYCLONE公司的SFM4CHO培养基。

本发明的无血清培养基包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM。

培养基的配置：在以基础培养基添上述物质至以下浓度：

D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM；

本发明人干扰素β1a的细胞培养基(无血清培养基)可为：

配方一：CHO-S-SFM II培养基：12g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.1g/L、D-葡萄糖：1.0g/L。

配方二：CHO-S-SFM II培养基：16g/L、D-半乳糖：0.3g/L、D-甘露糖：0.5g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：3.0g/L。

配方三：CHO-S-SFM II培养基：18g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.5g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：1.0g/L。

配方四：SFM4CHO培养基：15g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸钠：0.5mM、磷酸二氢钾：0.5mM、氯化钠：20mM。

在我们未作培养基成分优化，仅用商业用无血清培养基，如CHO-S-SFM II培养基、HYC SFM4CHO培养基，得到干扰素活性仅在1×10⁴IU/ml～1×10⁵IU/ml之间，干扰素含量在0.5g/L左右。

按配方一的培养基及本发明的人干扰素β1a的细胞培养方法，配方一得到的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达4.5×10⁵IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为1.253g/L。

按配方二的培养基及本发明的人干扰素β1a的细胞培养方法，配方二得到的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达4.7×10⁵IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为1.017g/L。

按配方三的培养基及本发明的人干扰素β1a的细胞培养方法，配方三得到的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达5.2×10⁵IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为1.253g/L。

按配方四的培养基及本发明的人干扰素β1a的细胞培养方法，配方四得到的细胞收集液干扰素β1a生物学活性达1.5×10⁶IU/ml最终获得的细胞收集液干扰素为1.425g/L。

实施例2人干扰素β1a的培养基各成分对比实验分析

实验材料：

1.细胞株：细胞株来源于深圳市职业技术学院，利用表达重组人干扰素β1a的质粒表达载体转入CHO-DHFR-细胞中，构建而成工程细胞，通过筛选获得高表达的细胞株进行扩增后制备成细胞冻存管，使用时取细胞冻存管于37℃快速融化后接种于已温浴的含血清培养基中培养。

2.含血清培养基为GIBCO公司的高糖DMEM培养基；所述含血清培养基为含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培养基。

基础培养基：GIBCO公司的CHO-S-SFM II培养基、HYCLONE公司的SFM4CHO培养基。

3.试剂：D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-葡萄糖均为SIGMA公司生产，纯度均在99％以上。正丁酸钠：国产分析纯试剂；氯化钠：国产分析纯试剂；磷酸二氢钾：国产分析纯试剂。

4.仪器：超净工作台；CO₂培养箱；紫外可见分光光度计；酶标仪；双目倒置显微镜。

本发明细胞培养方法中的含血清培养基为：含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培养基。无血清培养基为实施例1中配方配制所得培养基。

一、制备人干扰素β1a的细胞培养方法：

1、种子培养，取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)冻存管复苏，通过25cm²、75cm²、175cm²方瓶传代培养15天，传代5～7代，3L转瓶培养7～12天，获得种子细胞量5.0×10⁷～1×10⁹cells；目的是活化富集状态良好、生命力旺盛的种子细胞，这样接种于细胞罐后能快速稳定的进入对数生长期。

2、5L细胞罐培养：按0.2×10⁶～2×10⁶cells/ml接种量接入转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8～7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加10rpm，最终加至120rpm。起始条件相对温和，利于细胞改变一个生长环境后在较短时间内适应新的环境并开始增殖。采用含含血清培养基培养5～10天(，灌流速度大于0.2～0.8L/h时，先采用含血清培养基培养，是为了在营养最丰富的时候完成细胞数量的积累，灌流速度增加说明细胞数量增值较快，需要的营养相应增加，在灌流速度大于0.2～0.8L/h时，说明细胞处于对数生长期中期，此时细胞量已达到一定积累，可以换成无血清培养基进行细胞维持生长和目的蛋白干扰素β1a的表达收获了，瞬间排空含血清培养基更换上述无血清培养基，为了尽可能多的收获含干扰素β1a的无血清培养基，因为含血清培养基的细胞收集液中杂蛋白较多，且用于制药生产时最好不要从有动物组织来源添加成分的收集液中的进行提取纯化。培养基中的蛋白含量减少可以降低成本，有利于分离纯化。调整培养温度为34～36℃，低温会适当减少细胞的比生长速率，延长培养周期，增加干扰素β1a的表达量，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3～2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30～50天左右。

3、灌流培养至灌流速度小于0.05～0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0～3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

二、检测指标及检测方法：

1.葡萄糖浓度：使用血糖诊断试剂盒。将试剂盒内酶-显色剂和磷酸盐缓冲液以1∶9的体积比混合成工作液。准备3支试管，分别标记为空白管、标准管和样品管，每管加工作液3.0ml，空白管不加，标准管再加0.02ml标准液，样品管加0.02ml样品液。混匀后置37℃温浴15min，以空白调零，在505nm处测吸光度值，分别记为标准管A1、样品管A2。计算糖浓度＝(A2/A1)×1(g/L)。

2生物学活性检测：

2.1试剂：

(1)RPMI 1640培养液：取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。

(2)完全培养液量取新生牛血清10ml，加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。

(3)测定培养液量取新生牛血清7ml，加RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。

(4)攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。

(5)消化液取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。

(6)染色液取MTS 0.1g，PMS 0.0023g，分别用PBS溶解，混合定容至50ml，除菌过滤，分装于EP管中，-20℃避光保存。

(7)PBS取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。

2.2标准品溶液的制备：取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

2.3样品的制备：将样品分别进行100倍或1000倍预稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。

2.4测定法：使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1∶2～1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每1ml含1.0×10⁵～2.0×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和样品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100CCID50，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳培养24～48小时(镜检标准品溶液的50％病变点在1IU/ml)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入100μl PBS和20μl MTS，于37℃、5％二氧化碳培养箱中放置1小时后，混匀，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长492nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果

供试品生物学活性

(IU/ml)＝Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。

3IFN-β-1a含量检测：

3.1ELISA试剂盒R&D公司生产，批号为201011。

3.2标准品的稀释：取原倍标准品一支，分别稀释至2、4、8、16和32pg/ml。

3.3加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加样标准品50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.4温浴-洗涤：用封板膜将酶标板封口后置37℃温育30分钟后小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

3.5加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

3.6温育-洗涤操作同4.4。

3.7显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

3.8终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

3.9测定及计算：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

三、培养基中添加各组分的结果分析：

1.培养基中添加四种低聚糖正交试验：

设计了一个正交试验确定几种低聚糖对CHO-IFN-β细胞生长及干扰素表达、干扰素活性综合影响，确定本发明无血清培养基中(基础培养基：12-18g/L中添加的各类低聚糖)各组分浓度的最优配比，正交试验设计表见下表1：低聚糖种类及3个水平方案，试验结果见下表2。

表1

表2

从生物学活性角度直观分析，第3和4号试验、A₃B₁C₂D₃和A₁B₂C₂D₁的5.2×10⁵U/ml最好，第5号试验A₂B₂C₃D₃的4.8×10⁵U/ml次之。经各个水平相应的IFN-β活性之和分析，对于每列比较各自的T1、T2和T3的大小，因为活性越高越好，所以活性之和大的水平较好。A列的T1大，所以T1较好；B列的T1大，所以B₁较好；C列T2大，所以C₂较好；D列T3大，所以D₃较好。把这四个好水平结合在一起，A₁B₁C₂D₃即为关于活性的可能好水平组合，即D-半乳糖浓度0.05g/L，D-甘露糖浓度0.3g/L，N-乙酰氨基葡萄糖浓度0.3g/L，D-葡萄糖浓度5g/L。请参阅图1、图2、图3、图4为从活性分析时各因素水平之和变化趋势图。

表3

从干扰素含量角度直观分析如表3正交表设计干扰素含量分析结果，第1号试验、A₁B₁C₃D₂的1.253mg/ml最好，第5号试验A₂B₂C₃D₃的1.159mg/ml次之。与活性分析相似，确定可能好水平为A₁B₂C₁D₂即为关于干扰素含量的可能好水平组合，即D-半乳糖浓度0.05g/L，D-甘露糖浓度0.50g/L，N-乙酰氨基葡萄糖浓度0.10g/L，D-葡萄糖浓度3g/L。请参阅图5、图6、图7、图8为从干扰素含量分析时各因素水平之和变化趋势图。

2、上述1中的无血清培养基中添加不同浓度正丁酸钠试验

有研究表明，一种小分子短链脂肪酸-丁酸钠可以提高多种外源蛋白在CHO细胞中的表达量，比如凝血Ⅷ因子、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、促红细胞生成素(EPO)、人血小板生成素(hTPO)及一氧化氮合成酶(NOS)等。表达量提高的程度因表达产物的不同而有差异。同时研究还显示丁酸钠可以抑制细胞生长，阻断细胞周期，诱导细胞凋亡等。本实验中用不同浓度的丁酸钠对细胞株进行处理，在表1低聚糖种类及3个水平方案的无血清培养基的培养条件下观察和比较它们对细胞生长代谢和干扰素表达量的影响，结果见下表4无血清培养基中添加不同浓度正丁酸钠试验。

表4

由表4可见，在添加0.5mM正丁酸钠时，虽然干扰素含量和残糖与其他浓度时差别不大，但生物学活性比其他浓度时高出近一倍，而且细胞状态也最佳，因此确定细胞培养时加入0.5mM正丁酸钠。

3、上述1中的无血清培养基不同浓度磷酸二氢钾试验

磷是核酸和磷脂的成分，组成高能磷酸化合物及许多酶的活性基团，能有效的促进微生物的生长。钾也是微生物必须的营养元素。因此改变培养基中的磷酸二氢钾的浓度，有可能更适合细胞的生长。有文献报道说在培养集中添加一定浓度的磷酸二氢钾利于细胞的生长，因此尝试在培养基中加入不同浓度磷酸二氢钾，观察对细胞生长及干扰素生成的影响。试验结果见下表5无血清培养基中添加不同浓度磷酸二氢钾试验结果。

表5

由表5可见，添加低浓度磷酸二氢钾时却有增加干扰素活性的作用，添加低浓度磷酸二氢钾时随有增加干扰素含量的作用，但对干扰素活性贡献不大，因此选则在无血清培养基中添加0.5～2.0mM的磷酸二氢钾。

4、上述1中的无血清培养基添加不同浓度氯化钠改变渗透压试验

高渗透压常被用于提高抗体产量和重组蛋白产量。然而，这往往需要牺牲细胞的生长速度。文献结果显示往培养基中加入40mM氯化钠增加渗透压可以增加β-干扰素产量，减少蛋白聚集率到62％。本实验尝试培养过程中加入氯化钠改变渗透压，观察对细胞生长及干扰素表达的影响，结果见表6无血清培养基中添加不同浓度氯化钠改变渗透压试验结果。

表6

由上表6可见，20mM氯化钠时虽然活性稍低于40mM，但综合考虑细胞状态及干扰素含量，还是确定其作为本发明无血清培养基中加入的最适氯化钠浓度。

常用SFM培养基配方如表7。

表7

含10％新生牛血清的完全培养基配方：

在90ml DMEM培养基中加入10ml新生牛血清既是含10％新生牛血清的完全培养基，DMEM培养基配方如表8(DMEM培养基高糖型)。

表8

实施例3制备人干扰素β1a的细胞的培养方法

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞冻存管复苏，通过25cm²、75cm²、175cm²方瓶传代培养15天，传代5-7代，3L转瓶培养7-12天，获得种子细胞量5.0×10⁷-1×10⁹cells；

b、5L细胞罐培养数据

1.含血清培养阶段：5L细胞罐培养起始条件：按2×10⁵cells/ml接种量接入转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH7.2、溶氧大于30％(+3)、转速40rpm进行培养，接入细胞4h后观察细胞在微载体上的贴壁情况，细胞贴壁正常，细胞开始生长。细胞贴附微载体后将转速升至45rpm，进行含血清培养。培养1天后转速调至50rpm，流加饱和碳酸氢钠调节细胞罐内溶液pH，使pH维持在6.8～7.8之间。以后每天转速增加10rpm，最终加至120rpm。起始条件相对温和，利于细胞改变一个生长环境后在较短时间内适应新的环境并开始增殖。

培养4d后，取样观察，细胞基本全都伸展开来，细胞量开始大量增加，细胞浓度为4.8×10⁶个/ml，且细胞开始表达干扰素β1a蛋白，经检测细胞收集液中干扰素β1a生物学活性为1.6×10⁵IU/ml、干扰素含量为0.201g/L，此时开始流加新鲜含血清培养基，先按0.25L/h流加，然后根据饱和碳酸氢钠的消耗量、溶氧下降情况逐渐增加每天的培养基流加量，培养至9d后开始培养基流加速度达0.6L/h，此时微载体上细胞增殖很快，部分出现圆缩，悬浮细胞量也相应增加，细胞浓度为14.8×10⁶个/ml，由于培养基流加量供不上细胞生长，所以出现部分细胞死亡。此时细胞量已达到一定积累，可以换成无血清培养基进行细胞维持生长和目的蛋白干扰素β1a的表达收获了。

2.无血清培养阶段：

更换培养基时瞬间排空含血清培养基，以尽可能短的时间泵入优化后的无血清培养基，待达到培养体积后恢复更换前的培养条件，培养6～8h后调整培养温度为35℃，继续培养，每天监测葡萄糖浓度，尽可能保证葡萄糖浓度在0.3～2.0g/L之间，参考葡萄糖浓度设定无血清培养基流加速度，培养过程中每天取样检测细胞数量及干扰素β1a生物学活性。

图9和图10为上罐期间整个培养过程细胞生物动力学曲线，由细胞照片及动力学曲线可以看出在细胞初换成无血清培养基时有一天的适应时间，换成无血清培养基后第一天(即培养第10天)无论是细胞量还是生物学活性、干扰素含量都存在一个小的下降，培养第11天时细胞状态恢复正常又开始大量增殖，生物学活性及干扰素含量也随之不断升高，葡萄糖浓度开始下降、培养基灌流量开始平稳增加。在第17天左右时细胞生长及干扰素β1a表达进入一个平稳期，葡萄糖浓度变化不大，培养基灌流量趋于恒定，相应的细胞数量、干扰素β1a生物学活性及含量数值均波动不大。

3.培养终点：

上罐培养至35天之后，葡萄糖浓度开始升高，培养基灌流速度开始急速降低，细胞状态收集液中的开始有悬浮的死细胞出现，细胞数量开始减少，干扰素β1a生物学活性和含量也开始降低，说明细胞进入衰亡期，在40天时大量细胞开始从微载体上脱落，经连续3次检测葡萄糖浓度分别为2.01、2.08和2.13g/L，培养基灌流速度为0.20L/h，细胞收集液活性为0.49×10⁵IU/ml，此时基本可以判定为细胞培养终点，停止灌流，结束培养。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L，所述添加物为D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

2.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。

3.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为SFM培养基，所述SFM培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基。

4.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM。

5.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，包括以下浓度的各组分：基础培养基：15g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸钠：0.5mM、磷酸二氢钾：0.5mM、氯化钠：20mM。

6.制备人干扰素β1a的细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞冻存管复苏，传代培养，转瓶培养；

b、按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行细胞罐培养，每天转速增加10rpm，最终加至120rpm，采用含血清培养基培养5-10天，在灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至4所述的制备人干扰素β1a的细胞培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

7.按权利要求6所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞冻存管复苏，通过25cm²、75cm²、175cm²方瓶传代培养15天，传代5-7代，3L转瓶培养7-12天，获得种子细胞量5.0×10⁷-1×10⁹cells；

b、5L细胞罐培养：按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加10rpm，最终加至120rpm。采用含含血清培养基培养5-10天，所述含血清培养基为含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培养基，灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至4所述的制备人干扰素β1a的细胞培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

8.权利要求1-4制备人干扰素β1a的细胞的培养基的用途，在含表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞培养中的应用。

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