CN113862224A - 一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法 - Google Patents

一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，通过调整细胞培养条件的pH和转速，以及其他培养条件，再使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞。结果发现，本发明细胞培养方法在细胞培养过程中细胞新陈代谢无明显区别，但是pH变化范围相较于搅拌式生物反应器更小，减少对细胞的损伤；而且本发明提供的培养方法能够长时间保持较高的细胞活率，延长培养时间；具有较为一致的表达量曲线及比生产速率曲线，在环轨摇晃式生物反应器中延长培养时间能够较为明显的提高蛋白表达量。

Description

一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，且特别涉及一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法。
背景技术
单克隆抗体在生物医药产品中占有很重要的地位，目前主要通过动物细胞体外培养表达和生产单克隆抗体。搅拌式生物反应器是细胞培养领域常用的反应器，技术比较成熟，但依然存在许多问题，给细胞放大培养过程中带来障碍。首先，在放大培养过程中，搅拌桨所造成的剪切力会对细胞造成伤害，甚至死亡。其次，搅拌式生物反应器一般采用深层通气方式，易产生泡沫，同时气泡的破裂会造成更巨大的剪切力。另外，搅拌式生物反应器在扩大培养过程中，由于涉及的参数较多，流体力学复杂，造成放大困难，甚至失败。
大多细胞培养条件，如温度、溶氧、光照、pH等，都比较稳定。如pH维持在7.0，转速恒定。但是搅拌式生物反应器稳定的细胞培养条件，不适于环轨摇晃式生物反应器。环轨摇晃式生物反应器是一种通过环轨摇晃混合方式进行细胞培养的生物反应器，可以很好地解决搅拌式生物反应器存在的问题。但是，环轨摇晃式生物反应器与搅拌式生物反应器的工作原理存在较大差异，搅拌式生物反应器的培养条件并不适用环轨摇晃式生物反应器。因此，提供一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法十分必要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的一个方面，提供了一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，所述培养细胞的转速随着培养天数递增，所述转速范围为：90-110rpm。发明人发现，使用上述转速后，细胞能够保持高的细胞活率，蛋白的表达量高。
发明人进行进一步优化，惊喜发现，在以下转速范围内，细胞活率以及蛋白表达量更高。培养细胞的转速如下：
D0-D4转速约为90rpm，
D5-D6转速约为92rpm，
D7-D8转速约为95rpm，
D9-D12转速约为100rpm，
D13至培养结束转速约为110rpm。
根据本发明的实施例，培养细胞的温度为：
D0-D4温度为35-39℃，
D5至培养结束温度为30-35℃。
优选地，培养细胞的温度为：
D0-D4温度约为37℃，
D5至培养结束温度约为32℃。
在该温度条件下更利于细胞的培养，有利于细胞保持高的细胞活率，提高蛋白的表达量。
根据本发明的实施例，培养细胞的培养基中含有基础培养基、葡萄糖和谷氨酰胺。
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自M5培养基、或M17培养基，所述M5培养基商品名为M5
Figure BDA0002562275030000021
Advanced CHO Fed-batch Medium，购自Sigma公司，所述M17培养基商品名为BalanCD Transfectory CHO Medium，购自Irvine公司。
根据本发明的实施例，补料培养基选自Feed4、或F6，所述Feed4商品名为Balan CDCHO Feed 4，购自Irvine公司，所述F6商品名为HyClone Cell Boost 7a and Cell Boost7b supplements，购自GE公司。
根据本发明的实施例，所述葡萄糖的浓度为4-6g/L。
根据本发明的实施例，所述谷氨酰胺浓度为3-4g/L。
培养细胞过程中葡萄糖以及谷氨酰胺的浓度保持在此范围内，有利于细胞保持高的细胞活率，提高蛋白的表达量。
根据本发明的实施例，所述培养细胞的培养基的pH值为6.7-7.5。
进一步地，所述培养基的pH如下：
D0-D3的pH约为7.0，
D4-D6的pH约为6.9，
D7-D9的pH约为7.0，
D10-D11的pH约为7.1，
D12至培养结束的pH约为7.2。
在上述pH范围内，利于细胞营养物质的生成。
在细胞培养过程中，实时监测培养基的pH，如果pH低于上述pH范围，加入1MNaHCO3升高pH，如果pH低于上述pH范围，则通入CO2降低pH。
根据本发明的实施例，所述培养细胞的培养基的溶氧为45-50％。
进一步地，所述培养细胞的培养基的溶氧为50％。
在细胞培养过程中，实时监测培养基的溶氧，通过通入空气将溶氧控制在上述范围内。
根据本发明的实施例，通气速率为0.3-0.5L/min。
根据本发明的实施例，细胞培养起始体积为5-7.6L。
根据本发明的实施例，细胞起始接种密度为(0.3-0.5)×106cells/mL。
根据本发明的实施例，所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
根据本发明的实施例，所述中国仓鼠卵巢(CHO)细胞包含编码单克隆抗体的核酸。
根据本发明的实施例，所述单克隆抗体为anti-CD20单克隆抗体、或anti-HER2单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
1、本发明的细胞培养方法在细胞培养过程中细胞新陈代谢与小体积(3L)搅拌式生物反应器无明显区别，但是pH变化范围相较于搅拌式生物反应器更小。
2、本发明提供的培养方法能够长时间保持较高的细胞活率，延长培养时间。
3、本发明提供的培养方法与使用3L搅拌式生物反应器培养细胞的方法相比，具有较为一致的表达量曲线及比生产速率曲线，在环轨摇晃式生物反应器中延长培养时间能够较为明显的提高表达量，相对于培养体积接近的15L搅拌式生物反应器，环轨摇晃式生物反应器具有更高的蛋白表达量及比生产速率。
附图说明
图1是细胞培养中的新陈代谢监测情况，A-F分别是pH、pO2(氧分压)、pCO2(二氧化碳分压)、谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖的变化范围；G-K分别是乳酸、NH4+、Na+、K+、渗透压(OSM)的变化范围。
图2是细胞培养中的活细胞密度(VCD)和细胞活率(VIA)。
图3是细胞培养中的抗体滴度(Titer)。
图4是细胞培养中的比生产速率(Qp)。
具体实施方式
本发明实施例中使用的摇晃生物反应器为SB10-X(Kuhner科耐)为例。对比例1使用的搅拌式生物反应器为3L搅拌式生物反应器(My-control Applikon)，对比例2使用的生物反应器为15L搅拌式生物反应器(EZ2-control Applikon)。
本发明实施例和对比例使用的细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO ExpressTM)表达anti-CD20 Mab(利妥昔)。本发明使用的补料培养基Feed4商品名为Balan CD CHO Feed4，购自Irvine公司。本发明使用的M5培养基商品名为M5
Figure BDA0002562275030000042
Advanced CHO Fed-batch Medium，购自Sigma公司。本发明的D0、D1、D2、D3、D4……代表第0天、第1天、第2天、第3天、第4天……。
实施例1
一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，将细胞株按照一定密度接种在培养基中进行细胞的培养。实施例1、对比例1、对比例2培养细胞条件如表1所示。
表1对比例和实施例的培养条件
Figure BDA0002562275030000041
Figure BDA0002562275030000051
注：N/A表示不适用。
培养期间实时监测培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的含量，如其含量低于限定范围的最低值，则需要在培养基中添加葡萄糖和谷氨酰胺。
pH控制策略：实时监测培养基pH，如果pH低于上述pH范围，加入1M NaHCO3升高pH，如果pH低于上述pH范围，则通入CO2降低pH。
DO控制策略：实时监测培养基溶氧，通入空气将溶氧控制在限定范围内。
培养细胞过程中，使用细胞计数仪(贝克曼公司)检测细胞密度、活率，使用生化分析仪(美国NOVA)检测营养物质。细胞培养完成后，离心后收集上清。将上清用高效液相色谱法，收集抗人CD20单克隆抗体(anti-CD20 Mab)，并检测其表达产量，结果如下：
1、培养过程中的新陈代谢
由图1结果可知：使用本实施例中的方法pH变化范围相较于使用搅拌式生物反应器的方法更小，在细胞生长代谢方面没有明显差异，且在培养前期使用本实施例中方法，乳酸积累速率晚于使用搅拌式生物反应器，培养中后期也低于使用搅拌式生物反应器。
2、细胞生长
活细胞密度(VCD)和细胞活率(VIA)
由图2结果可知，本实施例中的方法和使用搅拌式生物反应器的方法在前期细胞生长过程中细胞密度略有差异，但最终的最高细胞密度一致均可达到35×106cells/mL。使用3L搅拌式生物反应器的方法时，在第12天开始细胞活率开始下降，使用15L搅拌式生物反应器的方法在第14天细胞活率开始下降，本实施例中的方法则能维持较高的细胞活率直至第17天。
3、抗体滴度、比生产速率(Qp)
结果见图3和图4，anti-CD20 Mab的表达结果显示：本实施例中的培养方法能延长培养时间，能够较为明显的提高anti-CD20 Mab表达量，且本实施例中的培养方法与使用3L搅拌式生物反应器的方法具有较为一致的表达量曲线及比生产速率曲线。而使用15L搅拌式生物反应器的方法中anti-CD20 Mab表达量及比生产速率出现降低。
实施例2
实施例2和实施例1除培养基pH值存在差异外，其他培养条件相同。实施例2中培养基的pH为7.0。
培养细胞过程中，使用细胞计数仪(贝克曼公司)检测细胞密度、活率，使用生化分析仪(美国NOVA)检测营养物质。细胞培养完成后，离心后收集上清。将上清用高效液相色谱法，收集抗人CD20单克隆抗体(anti-CD20 Mab)，并检测其表达产量。
结果显示，固定pH设定值细胞生长状态与实施例1中的接近，pCO2比例有所增加，表达量无明显下降。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，环轨摇晃式生物反应器的转速随着培养天数递增，所述转速为90-110rpm。
2.根据权利要求1所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述培养细胞的转速如下：
D0-D4转速约为90rpm，
D5-D6转速约为92rpm，
D7-D8转速约为95rpm，
D9-D12转速约为100rpm，
D13至培养结束转速约为110rpm。
3.根据权利要求1所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，培养细胞的温度为：
D0-D4温度为35-39℃，
D5至培养结束温度为30-35℃。
4.根据权利要求1所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，培养细胞的培养基中含有基础培养基、葡萄糖和谷氨酰胺。
5.根据权利要求4所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述基础培养基选自M5培养基、或M17培养基；和/或
补料培养基选自Feed4、或F6；和/或
所述葡萄糖的浓度为4-6g/L；和/或
所述谷氨酰胺浓度为3-4g/L；和/或
所述培养细胞的培养基的pH值为6.7-7.5；和/或
所述培养细胞的培养基的溶氧为40-50％。
6.根据权利要求5所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述培养基的pH如下：
D0-D3的pH约为7.0，
D4-D6的pH约为6.9，
D7-D9的pH约为7.0，
D10-D11的pH约为7.1，
D12至培养结束的pH约为7.2。
7.根据权利要求1所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，
细胞培养起始体积为5-7.6L；和/或
细胞起始接种密度为(0.3-0.5)×106cells/mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
9.根据权利要求8所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞包含编码单克隆抗体的核酸。
10.根据权利要求9所述的使用环轨摇晃式生物反应器培养细胞的方法，其特征在于，所述单克隆抗体为anti-CD20单克隆抗体、或anti-HER2单克隆抗体。
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