CN102525928A - 一种顺铂长循环脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种顺铂长循环脂质体及其制备方法，主要解决顺铂毒性大，顺铂脂质体载药量低的问题。该脂质体的制备依赖于带负电荷的磷脂酰甘油衍生物与带正电荷的水合顺铂之间的静电作用力。本发明的顺铂长循环脂质体粒径可以控制在120nm左右，具有较高的包封率与载药量以及较好的稳定性，且制备方法简单易行。
Description
技术领域：本发明涉及顺铂长循环脂质体及其制备方法。
背景技术：顺铂自1978年被批准为抗肿瘤药物后，在临床的应用非常广泛。顺铂可以单独或与其他药物联合使用来治疗不同的癌症，如膀胱癌、卵巢癌、头颈癌以及肺癌等。顺铂具有较高的细胞毒性，一般认为，其在进入细胞内部后被水解，形成具有高活性的水合顺铂。水合顺铂与DNA形成共轭物，从而导致DNA二级结构发生变化，阻碍DNA的转录和复制，最终导致细胞的凋亡。然而，顺铂对肿瘤细胞缺乏特异性，它在病灶杀灭肿瘤细胞的同时，也杀伤体内的正常细胞，产生严重的毒副作用。
脂质体作为药物载体安全无毒、生物相容性好。具有合适粒径，高载药量的脂质体可以被动靶向肿瘤组织，降低药物毒性。而长循环脂质体更是能够避免脂质体被巨噬细胞吞噬，使脂质体顺利到达肿瘤组织。因此，长循环脂质体具有越来越高的实际应用价值。将顺铂制备成长循环脂质体能够降低顺铂毒副作用，然而顺铂脂质体的制备面临两个难题。第一，顺铂亲脂性差且水溶性不佳，在水中的溶解度4℃时约1mg/ml；第二，顺铂只能通过被动的方法载入脂质体内，无法参照已上市的阿霉素脂质体Doxil等进行pH梯度主动载药。上述两个原因通常造成顺铂脂质体的载药量较低。目前已经进入临床试验的顺铂脂质体SPI-077通过加热增加顺铂的溶解度。SPI-077制备过程中，水化温度为65℃。在此温度下，顺铂具有较高的溶解度，约为8mg/ml。但是此方法制备的顺铂长循环脂质体载药量依然较低，到达肿瘤部位后释药不足，导致抗肿瘤活性降低。有人将顺铂转化成顺铂衍生物CDDP3，它具有较高的水溶性，且在氯离子存在下容易转化为CDDP。然后通过静电作用力将CDDP载入脂质体或其他载体中。这一方法不仅解决了顺铂溶解性的问题，同时静电作用力能够提高脂质体的载药量，但是制备方法相当繁琐。有专利报道，带正电荷的水合顺铂与带负电荷的磷脂酰甘油衍生物在适当比例的乙醇水溶液中形成胶束，再将胶束用磷脂材料包裹形成脂质体，该专利产品Lipoplatin目前已进行临床三期试验。因此，利用带负电荷的磷脂酰甘油衍生物来通过静电作用力实现顺铂高载药量的目的是可行的。
发明内容：本发明的目的是提供具有较高载药量的顺铂长循环脂质体及其一种更为简单易行的制备方法。该脂质体的制备建立在Lipoplatin的基础上，省略胶束的制备过程，直接制得脂质体。该脂质体的高载药量是通过带负电荷的磷脂材料与带正电荷的水合顺铂静电作用实现的。
本发明提供的顺铂长循环脂质体的制备方法：
先得到带有负电荷的磷脂材料，再制备带正电荷的水合顺铂溶液，最后在水相体系中，将带正电的水合顺铂和带负电荷的磷脂材料通过静电作用，制得顺铂长循环脂质体。
上述顺铂长循环脂质体，其特征在于，带负电荷的磷脂材料中含有带负电荷的磷脂酰甘油脂质衍生物。
顺铂长循环脂质体，其特征在于，上述磷脂酰甘油脂质衍生物选自于以下一种或几种的组合：二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二癸酰基磷脂酰甘油(DCPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。
顺铂长循环脂质体，其特征在于，带负电荷的磷脂材料的用量为20％～50％。
顺铂长循环脂质体，其特征在于，磷脂材料还包含电中性组分：胆固醇、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。
顺铂长循环脂质体，其特征在于，胆固醇用量为7％～15％，SPC用量为30％～60％，mPEG-DSPE用量为7％～15％。
顺铂长循环脂质体，其特征在于，带正电荷的水合顺铂的制备，是将顺铂溶解于双蒸水中，搅拌使其充分水合制得，或者是将顺铂与硝酸银溶于双蒸水中，反应后弃去沉淀制得。
更具体的，本发明提供一种顺铂长循环脂质体的制备方法：
a)将适量的DPPG，SPC，胆固醇，mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入适量氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)将摩尔比DPPG∶顺铂为1～2.5∶1量的顺铂置于西林瓶中，加入适当体积的双蒸水，在50℃，转速为300rpm条件下恒温磁力搅拌器中搅拌4h。或者将摩尔比2∶1的硝酸银溶液与顺铂溶液反应，弃去沉淀，得水合顺铂。
c)将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
附图说明：
图1为实施例5顺铂长循环脂质体与顺铂注射剂体外释放曲线
图2为实施例5顺铂长循环脂质体与顺铂注射剂体外细胞毒性试验数据曲线
具体实施方式：
实施例1
a)带负电荷磷脂薄膜的制备
将7.5mg的DPPG，16mg的SPC，4mg胆固醇，4.2mg的mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入15ml氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)水合顺铂制备
将3mg的顺铂置于西林瓶中，加入4ml的双蒸水，在50℃，转速为300rpm条件下恒温磁力搅拌器中搅拌4h。
c)顺铂长循环脂质体的制备
将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
实施例1-实施例5的包封率和载药量测定按如下方法进行：通过葡聚糖G-50柱分离制备的顺铂长循环脂质体中的脂质体与游离药物。收集游离药物。脂质体破乳剂选用5％的Triton X-100。按照中国药典2010版二部附录VB高效液相色谱法，在220nm波长处测定顺铂的峰面积，另精密称取对照品适量，同法测定，以外标法计算顺铂的包封率和载药量。
实施例1顺铂长循环脂质体的包封率为50％，载药量为4.3％。说明当DPPG用量为22％，SPC用量为46％，胆固醇用量为12％，mPEG-DSPE用量为12％时，载药量较高，载药量高于SPI-077(文献报道载药量为1％)。
实施例2
a)带负电荷磷脂薄膜的制备
将11.3mg的DPPG，16mg的SPC，4mg胆固醇，4.2mg的mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入15ml氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)水合顺铂制备
将3mg的顺铂置于西林瓶中，加入4ml的双蒸水，在50℃，转速为300rpm条件下恒温磁力搅拌器中搅拌4h。
c)顺铂长循环脂质体的制备
将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
本实施例中，顺铂的包封率为51％，载药量为4.0％。说明当DPPG用量为29％，SPC用量为42％，胆固醇用量为10％，mPEG-DSPE用量为11％时载药量较高，载药量高于SPI-077(文献报道载药量为1％)。
实施例3
a)带负电荷磷脂薄膜的制备
将15mg的DPPG，16mg的SPC，4mg胆固醇，4.2mg的mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入15ml氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)水合顺铂制备
将3mg的顺铂置于西林瓶中，加入4ml的双蒸水，在50℃，转速为300rpm条件下恒温磁力搅拌器中搅拌4h。
c)顺铂长循环脂质体的制备
将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
本实施例中，顺铂的包封率为56％，载药量为4.0％。说明当DPPG用量为36％，SPC用量为38％，胆固醇用量为9％，mPEG-DSPE用量为10％时载药量较高，载药量高于SPI-077(文献报道载药量为1％)。
实施例4
a)带负电荷磷脂薄膜的制备
将30mg的DPPG，32mg的SPC，8mg胆固醇，8.4mg的mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入15ml氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)水合顺铂制备
将6mg的顺铂置于西林瓶中，加入4ml的双蒸水，在50℃，转速为300rpm条件下恒温磁力搅拌器中搅拌4h。
c)顺铂长循环脂质体的制备
将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
本实施例中，顺铂的包封率为73％，载药量为5.2％。说明当DPPG用量为36％，SPC用量为38％，胆固醇用量为9％，mPEG-DSPE用量为10％时，适当提高磷脂和顺铂的浓度，包封率和载药量提高。
实施例5
a)带负电荷磷脂薄膜的制备
将30mg的DPPG，32mg的SPC，8mg胆固醇，8.4mg的mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入15ml氯仿∶甲醇＝2∶1的混合溶液使磷脂材料溶解，将茄形瓶接入旋转蒸发仪，最大转速旋转蒸发除去有机溶剂，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥过夜，除尽有机溶剂。
b)水合顺铂制备
将10mg的顺铂置于西林瓶中，加入10ml的双蒸水，在50℃中溶解，再将153mg硝酸银溶于10ml双蒸水中，配置浓度为90mM的硝酸银溶液，取720μl的硝酸银溶液加入上述顺铂溶液中，50℃条件下充分反应，弃去沉淀，即得水合顺铂。
c)顺铂长循环脂质体的制备
将上述所得水合顺铂溶液加入磷脂膜中，50℃水化30min得顺铂长循环脂质体。
本实施例中，顺铂的包封率为80％，载药量为9.0％。说明当DPPG用量为34％，SPC用量为36％，胆固醇用量为9％，mPEG-DSPE用量为10％时，应用硝酸银沉淀法制备水合顺铂可使包封率和载药量提高。
用激光散射法测定实施例5中顺铂长循环脂质体的粒径和粒径分布。测定条件：波长633nm，温度25℃，角度为90°。
从测定结果可知，顺铂长循环脂质体的平均粒径为118nm。
实施例5中，测得顺铂长循环脂质体的表面带负电荷，大小为-44mv。
图1是实施例5制备的顺铂长循环脂质体和顺铂注射剂的体外释放曲线。体外释放测定方法：精密移取新鲜制备的经过纯化的顺铂脂质体2ml于透析袋中(30KD)。放入20ml释放介质中，分别于0、1、2、4、8、16、24、36、48、72h取样1ml，同时补充新鲜介质1ml，按中国药典2010顺铂含量测定方法测定顺铂峰面积，计算累计释放百分率。
试验结果表明：顺铂长循环脂质体体外具有缓释效果。
图2是实施例5制备的顺铂长循环脂质体和顺铂注射剂体外细胞毒性试验数据曲线。测定方法：将A549肺癌细胞用胰酶消化稀释后接种到96孔板，每孔接种90μL含细胞5000个，培养24h；细胞贴壁后，将不同浓度的脂质体依次加到96孔板上，每孔10μL，终浓度为100、50、10、2、1、0.1mg/L，每个浓度设为5个复孔，每块板设一组正常对照组(加10μL纯净水，不含脂质体)和空白凋零孔(只加培养液，不含细胞和脂质体)，在培养箱内培养48h。之后弃去上清液，然后每孔加MTT溶液20μL继续孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，再每孔加100μL溶解液，振荡使结晶物充分溶解，最后进行比色。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。细胞生长抑制率＝(1-A实验/A对照)*100％。实验结果表明：顺铂注射剂的IC50值为0.00212mg/ml，顺铂长循环脂质体的IC50值为0.00214mg/ml。
说明顺铂长循环脂质体有不低于顺铂注射剂的杀死肿瘤细胞的能力。
Claims (8)
1.一种顺铂长循环脂质体的制备方法，其特征在于先得到带有负电荷的磷脂材料，再制备带正电荷的水合顺铂溶液，最后在水相体系中，将带正电的水合顺铂和带负电荷的磷脂材料通过静电作用，制得顺铂长循环脂质体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于带负电荷的磷脂材料中含有带负电荷的磷脂酰甘油脂质衍生物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于磷脂酰甘油脂质衍生物选自于以下一种或几种的组合：二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二癸酰基磷脂酰甘油(DCPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于磷脂酰甘油脂质衍生物用量为20％～50％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于磷脂材料中还包含电中性组分：胆固醇、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于胆固醇用量为7％～15％，SPC用量为30％～60％，mPEG-DSPE用量为7％～15％。
7.如权利要求1所述的方法，带正电荷的水合顺铂的制备，其特征在于将顺铂溶解于双蒸水中，搅拌使其充分反应，得水合顺铂。
8.如权利要求1所述的方法，带正电荷的水合顺铂的制备，其特征在于将顺铂与硝酸银溶解于双蒸水中，反应后弃去沉淀，得水合顺铂。
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