CN102517315A - 一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 - Google Patents
一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102517315A CN102517315A CN2011103823007A CN201110382300A CN102517315A CN 102517315 A CN102517315 A CN 102517315A CN 2011103823007 A CN2011103823007 A CN 2011103823007A CN 201110382300 A CN201110382300 A CN 201110382300A CN 102517315 A CN102517315 A CN 102517315A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reporter gene
- pbelobac11
- plasmid vector
- gene plasmid
- poly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种报告基因质粒载体以及提供该报告基因质粒载体的转化子。本发明还公开了该报告基因质粒载体的构建方法。本发明构建的报告基因质粒载体用于真核生物的10～300kb的DNA片段表达调控活性研究。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种报告基因质粒载体、构建方法和用途。
背景技术
报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。目前商用的人类和哺乳动物细胞的报告质粒载体，如pGL3系列，因载体容量小，难以容纳10 kb以上的DNA片段，常用于核心启动子，或小于10 kb的DNA片段调控活性研究。
目前，人类基因启动活性的研究主要集中在启动核心区域，但是多个基因不具有强启动子典型的序列特征。生物信息分析显示人类基因的一些调控机制是新近进化而来的。比如一些低复杂度重复仅存在于灵长类基因而不存在于哺乳动物。引人注意的是人类核心启动子与灵长类相似，而人类远端启动子区域是独特的。对非人类基因远端启动区域调控的研究不能反应人类基因远端启动区域的调控活性。
对远端启动区域的调控研究，需要在完整启动区域背景下进行，人类完整启动区域片段通常大于10 kb，而目前商用的人类和哺乳动物细胞的报告质粒载体，如pGL3系列，因载体容量小，难以容纳10 kb以上的DNA片段。
故目前对人类远端启动区域的调控研究，通常是通过逐段分割的手段进行研究，而缺乏在完整启动区域背景的调控研究，所以研究得出的结论往往是错误的。
目前由于大片段DNA（>10 kb）研究在技术上比较困难，长期限制了对人类基因核心启动区域上游的调控作用研究。因此，迫切需要大片段DNA的启动调控研究工具，用以在完整启动区域水平上进行基因启动子远端调控活性研究。
发明内容
本发明公开了一种报告基因质粒载体，以克服现有技术存在的问题。
也就是说，本发明目的是提供一种报告基因质粒载体，并明确该载体在大片段DNA启动调控研究中的用途。
所述的大片段DNA是指序列长度为10~300 kb的DNA片段。
本发明所述的报告基因质粒载体，其特征在于可以稳定克隆10～300
kb的 DNA片段。
本发明所述的报告基因质粒载体，其特征在于可以用于真核生物的大片段DNA启动活性研究。
本发明提供了一种报告基因质粒载体，其特征在于包含2个SV40
late poly(A)，合成poly (A)，报告基因，氯霉素抗性基因，多克隆位点和重组选择标记LacZa。
本发明所述的报告基因质粒载体，其上的SV40 late poly(A)和合成poly (A)，其功能可以关闭来自上游的任何转录活性。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于构建步骤包括①把含合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40 late poly(A)的片段，插入pBeloBAC11载体，得到pBeloBAC11-M，（M＝Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ或Ⅳ）备用；②把SV40 late poly(A)，插入pBeloBAC11-M，即得报告基因质粒载体pBeloBAC11-MN（M＝Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ或Ⅳ，N＝1或2或3或4）。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于构建步骤中的合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40 late poly(A)可以从市售报告基因质粒获得。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于市售报告基因质粒可以是pGL3，pGL2系列萤火虫荧光素酶报告基因质粒，荧光蛋白系列报告基因质粒，分泌性碱性磷酸酶系列报告基因质粒。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40
late poly(A) 的获得方法包括酶切和PCR扩增。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于步骤①中的合成poly(A)，多克隆位点，报告基因和SV40 late poly(A)的片段，插入pBeloBAC11载体的位点在LacZa和氯霉素抗性基因之间（350～790 bp）。
本发明所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于步骤②中SV40 late poly(A)片段，插入上述pBeloBAC11-M的位点在sopC和cos之间（9000～9500 bp）。
本发明通过构建报告基因质粒载体pBeloBAC11-MN，建立新的评价基因活性表达系统。目前市售的报告基因载体，其上含报告基因，主要作用是为了在宿主细胞中容易检测其表达，来代表目的片段的启动调控活性。但目前市售的报告基因载体容量小，难以容纳10 kb以上的DNA片段。pBeloBAC11载体特点：可以稳定克隆大片断DNA（10～300 kb）。但其不含报告基因和多克隆位点。pBeloBAC11-MN载体集合了商业用报告基因和BAC质粒的优点，可以稳定克隆大片断DNA，其上报告基因的表达可以代表目的片段的启动调控活性，是大片段DNA启动调控研究的非常有价值的研究工具，填补了启动子远端活性研究在完整启动区域水平上的空白。
在本发明的报告基因质粒构建中，把从市售报告基因载体上得到包括合成poly (A)，多克隆位点，报告基因的片段，插入pBeloBAC11载体的位点设计在LacZa和氯霉素抗性基因之间（350～790 bp），以及把SV40 late poly(A)片段，插入pBeloBAC11-M的位点设计在sopC和cos之间（9000～9500 bp）。使得本发明构建的载体pBeloBAC11-MN上的SV40
late poly(A)和合成poly (A)，可以关闭来自上游的任何转录活性，使pBeloBAC11-MN荧光素酶表达近似背景值。本发明的报告表达系统稳定，成功用于18 kb完整人多巴胺转运体（human Dopamine transporter，hDAT）启动子区活性研究，包含从-16672 bp [hDAT上游基因溶血磷脂胆碱酰基转移酶1（lysophosphatidylcholine
acyltransferase 1，LPCAT1 ）3’端位于-15993 bp]到＋2223 bp（hDAT 翻译起始编码子ATG），填补了hDAT启动子远端活性研究的空白。通过比对不同长度启动子区的启动活性大小，可以鉴定位于第二个外显子上游-16672～-8331 bp的区域，-8331～-3477 bp，以及-3477 kb~2 kb的区域存在的调控元件。确证了hDAT远端启动区（-13220~-8331
bp）的增强子作用，为hDAT调控研究注入新的概念和内容。总之，本发明为大片段DNA启动活性调控研究提供了非常有价值的研究工具。
附图说明
图1 是pGL3-enhancer载体结构示意图，其上含有荧光素酶（luc+）基因，luc+基因为报告基因。
图2 是pBeloBAC11载体结构示意图。
图3是pBeloBAC11-MN载体结构示意图。载体大小为10 kb。其中mini-F
质粒元件包括复制子Ori2，repE，sopA，sopB 和sopC。SV40
late poly(A)和合成poly (A)，其功能可以关闭来自上游的任何转录活性。luc+，荧光素酶基因； SV40增强子，增强luc+表达；氯霉素抗性基因；多克隆位点。包括7个：NotI，ApaLI，BamHI，HindIII，SrfI，MluI，和 NheI，可以克隆目的启动子片段。NotI 和HindIII可以失活重组选择标记LacZa 。
图4是完整18,909 hDAT启动子区克隆进入pBeloBAC11-Ⅰ1的构建流程图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。
本发明实施例中所使用的质粒载体pGL3-enhancer载体购自Promega公司；pBeloBAC11载体购自New
England Biolabs公司。所使用的电转感受态购自Invitrogen公司。
实施例
1
：
pBeloBAC11-
Ⅰ质粒构建
1）从pGL3-enhancer载体上NotI/BamHI位点酶切下包括合成poly (A)，多克隆位点，荧光素酶报告基因（luc+）的片段。酶切体系如下：
pGL3-enhancer载体 0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
NotI
0.5 μl
BamHI
0.5 μl
10×NEBBuffer 3
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
2）1.5%琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
3）T4DNA聚合酶，使步骤2）得到的包括合成poly (A)，多克隆位点，荧光素酶报告基因（luc+）的DNA片段形成平端。
4）1.5%琼脂糖凝胶电泳，QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
5）SrfI酶切pBeloBAC11，酶切体系为
pBeloBAC11载体 0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
SrfI
0.5
μl
10×Stratagene Buffer 5 μl
H2O
43 μl
37℃，2 h。
6）回收步骤5）得到的SrfI线性化pBeloBAC11载体。加5 M
NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h；14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
7）T4DNA连接酶连接步骤4）和步骤6）DNA片段，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶2 μl，16℃过夜。
8）大质粒（10～300kb）的转化：冰上操作。
①在冰冷的1.5 ml试管里，步骤7）连接产物1 μl与10 μl ddH2O混合，加10 μl电转感受态（One Shot® TOP10 Electrocomp™ E.
coli, Cat# C404050, Invitrogen, CA,USA)。
②混合物转到冰冷的2 mm电转杯(Cat# 4307
000.593, Eppendorf, Hamburg, Germany)。
③电转装置Gibco BRL Cell Porator Electroporation System (cat#
71600-050 和 11609-039, Gibco BRL)。设置：4 k欧，330 μF，fast charge 400
kV电击。
④电击后，混合物转入LB培养液0.5 ml，225 rpm，37℃ 1 hr，接种在氯霉素抗性平皿。37℃培养12-16 h。
9）鉴定。菌落PCR粗步鉴定插入方向，取正向插入克隆，细菌扩增，提取质粒，测序验证。得到pBeloBAC11-Ⅰ。
10）保存转化pBeloBAC11-Ⅰ菌种。
实施例
2
：
pBeloBAC11-
Ⅰ
1
报告基因质粒载体构建
1）以pGL3-enhancer载体为模板， PCR扩增含SV40 late
poly(A)片段。引物F: 5’-CCCCCACATGTCAGACATGATAAGATACATTGAT
(PciI site下划线 ), 引物R: 5’-TTTTTTGGTAACCTACCACATTTGTAGAGGTTTTAC
(BstEII site 下划线)。PCR反应体系：
H2O
42 μl
10X Pfu Buffer 5 μl
10mM dNTP 1 μl
Template 100 ng
Primers 0.2μl
Pfu
1 μl
Total 50 μl
PCR 条件采用程序：
95℃ 5 min； 95℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，30循环；72℃ 2min延伸。PCR产物取2 μl凝胶电泳，条带清晰单一。
2）纯化步骤1）PCR产物。PCR产物加5 M NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h，14,000 rpm， 4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
3）PciI/BstEII双酶切步骤2）纯化的DNA片段。酶切体系为
步骤2）纯化的DNA片段 0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
PciI
0.5
μl
BstEII
0.5 μl
10×NEBBuffer 3
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
4）1.5%琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
5）PciI/BstEII双酶切实施例 1得到的pBeloBAC11-Ⅰ质粒，酶切体系为
pBeloBAC11-Ⅰ
0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
PciI
0.5
μl
BstEII
0.5 μl
10×NEBBuffer 3
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
6）回收步骤5）得到的PciI/BstEII线性pBeloBAC11-Ⅰ质粒。加5 M
NH4Ac 5 μl,混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h；14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
7）T4DNA连接酶连接步骤4）和步骤6）DNA片段，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶1 μl，16℃过夜。
8）连接产物1μl电转化电转感受态，转入LB培养液0.3 ml中，225 rpm，37℃ 1 hr 37℃。取适量，接种氯霉素抗性培养皿，37℃，12－16h。得到含pBeloBAC11-Ⅰ1报告基因质粒载体转化子菌落。
9）鉴定。菌落PCR粗步鉴定含正确插入子菌落，细菌扩增，提取质粒，测序验证。
10）保存转化pBeloBAC11-Ⅰ1菌种。
实施例
3
：
pBeloBAC11-
Ⅱ质粒构建
1）从pGL3-enhancer载体上BglI/SalI位点酶切下包括合成poly (A)，多克隆位点，荧光素酶报告基因（luc+）的片段。酶切体系如下：
pGL3-enhancer载体 0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
BglI
0.5 μl
SalI
0.5 μl
10×NEBBuffer 3
5 μl
H2O
42.5 μl
温度 37度，2小时。
2）1.5%琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
3）T4DNA聚合酶，使步骤2）得到的包括合成poly (A)，多克隆位点，荧光素酶报告基因（luc+）的DNA片段形成平端。
4）1.5%琼脂糖凝胶电泳，QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
5）T4DNA连接酶连接步骤4）和实施例 1步骤6）得到的SrfI线性化pBeloBAC11载体，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶2 μl，16℃过夜。
6）连接产物电转化转化电转感受态，操作同实施例 1步骤8），电击后，混合物转入LB培养液0.5 ml，225 rpm，37℃ 1 hr，接种在氯霉素抗性平皿。37℃培养12-16 h。
7）鉴定。菌落PCR粗步鉴定插入方向，取正向插入克隆，细菌扩增，提取质粒，测序验证。得到pBeloBAC11-Ⅱ。
10）保存转化pBeloBAC11-Ⅱ菌种。
实施例
4
：
pBeloBAC11-
Ⅱ
1
报告基因质粒载体构建
1）PciI/BstEII双酶切实施例6得到的pBeloBAC11-Ⅱ质粒载体，酶切体系为
pBeloBAC11-Ⅱ
0.4 μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
PciI
0.5
μl
BstEII
0.5 μl
10×NEBBuffer 3
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
2）回收步骤1）得到的PciI/BstEII线性pBeloBAC11-Ⅱ质粒载体。加5 M
NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h；14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
3）T4DNA连接酶连接和步骤2）DNA片段和实施例 2步骤4）得到的DNA片段，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶1.5 μl，16℃过夜。
4）连接产物1μl电转化电转感受态，转入LB培养液0.3 ml中，225 rpm，37℃ 1 hr 37℃。取适量，接种氯霉素抗性培养皿，37℃，12－16h。得到含pBeloBAC11-Ⅱ1报告基因质粒载体转化子菌落。
5）鉴定。菌落PCR粗步鉴定含正确插入子菌落，细菌扩增，提取质粒，测序验证。
6）保存转化pBeloBAC11-Ⅱ1菌种。
实施例
5
：
pBeloBAC11-
Ⅱ
2
报告基因质粒载体构建
1）以pGL3-enhancer载体为模板，PCR扩增含SV40 late
poly(A)片段。引物F: 5’-CCCCCACCTGGTCAGACATGATAAGATACATTGAT
(SexAI site下划线 )，引物R: 5’-TTTTTTGTTAACTACCACATTTGTAGAGGTTTTAC
(HpaI site 下划线)。PCR反应体系：
H2O
42 μl
10X Pfu Buffer 5 μl
10mM dNTP 1 μl
Template 100 ng
Primers 0.2μl
Pfu
1 μl
Total 50 μl
PCR 条件采用程序：
95℃ 5 min； 95℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，30循环；72℃ 2min延伸。PCR产物取2 μl凝胶电泳，条带清晰单一。
2）纯化步骤1）PCR产物。PCR产物加5 M NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h，14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
3）SexAI/HpaI双酶切步骤2）纯化的DNA片段。酶切体系为
步骤2）纯化的DNA片段 0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
SexAI
0.5
μl
HpaI
0.5 μl
10×NEBBuffer 4
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
4）1.5%琼脂糖凝胶电泳，用QIAquick Gel
Extraction Kit，进行胶回收DNA片段。
5）SexAI/HpaI双酶切实施例 3得到的pBeloBAC11-Ⅱ质粒，酶切体系为
pBeloBAC11-Ⅱ
0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
SexAI
0.5
μl
HpaI
0.5 μl
10×NEBBuffer 4
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
6）回收步骤5）得到的SexAI/HpaI线性pBeloBAC11-Ⅱ质粒。加5 M
NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h；14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
7）T4DNA连接酶连接步骤4）和步骤6）DNA片段，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶1.5 μl，16℃过夜。
8）连接产物1μl电转化电转感受态，转入LB培养液0.3 ml中，225 rpm，37℃ 1 hr 37℃。取适量，接种氯霉素抗性培养皿，37℃，12-16h。得到含pBeloBAC11-Ⅱ2报告基因质粒载体转化子菌落。
9）鉴定。菌落PCR粗步鉴定含正确插入子菌落，细菌扩增，提取质粒，测序验证。
10）保存转化pBeloBAC11-Ⅱ2菌种。
实施例
6
：
pBeloBAC11-
Ⅰ
2
报告基因质粒载体构建
1）SexAI/HpaI双酶切实施例 1得到的pBeloBAC11-Ⅰ质粒载体，酶切体系为
pBeloBAC11-Ⅰ
0.4μg(1 μl)
BSA
0.5 μl
SexAI
0.5
μl
HpaI
0.5 μl
10×NEBBuffer 4
5 μl
H2O
42.5 μl
37℃，2 h。
2）回收步骤5）得到的SexAI/HpaI线性pBeloBAC11-Ⅰ质粒载体。加5 M
NH4Ac 5 μl，混合后，加125 μl 100%乙醇，-80℃，4 h；14,000 rpm，4℃，30 min。弃上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml，14,000 rpm，4℃，15 min。弃上清，沉淀溶解在ddH2O。
3）T4DNA连接酶连接步骤2）和实施例 5步骤4）得到的DNA片段，连接反应体系20 μl，T4DNA连接酶1.5 μl，16℃过夜。
8）连接产物1μl电转化电转感受态，转入LB培养液0.3 ml中，225 rpm，37℃ 1 hr 37℃。取适量，接种氯霉素抗性培养皿，37℃，12－16h。得到含pBeloBAC11-Ⅰ2报告基因质粒载体转化子菌落。
9）鉴定。菌落PCR粗步鉴定含正确插入子菌落，细菌扩增，提取质粒，测序验证。
10）保存转化pBeloBAC11-Ⅰ2菌种。
实施例
7
：克隆完整
18 kb
hDAT
启动子区进入
pBeloBAC11-
Ⅰ
1
完整18 kb hDAT启动子区共18,895 bp，包含从-16672 bp (hDAT上游基因LPCAT1 3’端位于-15993
bp）到＋2223 bp（hDAT翻译起始编码子ATG）。依据Genbank
accession number NM_001044 (18-OCT-2009)，以转录起始位点为＋1。用细菌人工染色体（BAC，Bacterial
artificial chromosome）克隆(AC091933.2) 为模板。克隆步骤如下：
1) 构建pBAC11--hDAT7.9KB
克隆7,777 bp BsaBI/EcoRV片断（-5930 bp到+1847 bp）（AC091933.2）进入pGL3-Enhancer载体（Promega）SmaI位点，产生pGL3e-hDAT7.7KB质粒。以AC091933.2为模板，引物：5’-CGCTGCTGCTGGATCCAAAT-3’ (BamHI，下划线) ，5’-GGGGGGGATCCATGGAGGCCTCAAGACAG-3’ (BamHI，下划线) 扩增片段(+1099 bp到+1968 bp)，BamHI酶切后，869
bp片段，替换pGL3e-hDAT7.7KB上748 bp BamHI/BglII片段，得到pGL3e-hDAT7.9KB （-5930
bp 到 +1968 bp）。该质粒缺乏翻译起始编码子ATG 前255 bp。由于高拷贝pGL3-Enhancer载体很难载纳更大的插入子。
2）为了成功克隆完整18 kb启动子，首先PmlI/AatII双酶切 pBAC11--hDAT7.9KB切去5’端3.2 kb，3’端的切口（AatII）用T4
DNA聚合酶修平后自连，得到9.8 kb质粒。（见图4 第①步）
3）补齐255 bp片断。PCR扩增255 bp片断，引物F:5’-TTGGTGGCTCATGCCTGTCATCT (位于hDAT第一个内含子EcoRV位点上游414bp)，引物R: 5’- GGGGGAAGCTT GGCGCGCCGGGCACACTGGGAGTTGAGGAA
(HindIII 斜体，AscI 下划线)。PCR条件：95℃ 5 min； 95℃ 30 sec，68℃ for 1 min，30循环；68℃ 2min延伸。扩增产物819 bp。EcoRV/HindIII双酶切后，用PCR酶切后产物379 bp替换9.8 kb质粒中的124 bp
EcoRV/HindIII片断。这样，补齐255 bp的缺口，形成10 kb质粒。（见图4 第②步）
4）用pBeloBAC11-Ⅰ1载体替换pGL3-Enhancer载体。NheI/AsuII双酶切片断，包含hDATDNA和luc+基因前169 bp片断，插入pBeloBAC11-Ⅰ1载体。AsuII从Fermentas (Cat# ER0121)购买，双酶切使用TangoTM
1x Buffer (Cat# BY5, Fermentas)。（见图4 第③步）
5）完整克隆。用BAC克隆(AC091933.2)的17,043 bp MluI酶切片断代替第4）得到的质粒中的MluI/MluI (3.1 kb)片断。插入方向鉴定：SwaI/AscI双酶切得到12.5 kb片断为正确的插入方向。酶切使用1：1 NEB buffer 3和4（如果是反方向则得到8.5 kb片断）（见图4 第④步）。得到p BeloBAC11-Ⅰ1-hDAT18
kb，简称18 k。
实施例
8
：不同长度的
hDAT
启动区报告基因构建
18 k 完整启动区报告基因质粒经NheI酶切，自连后，切除-8331~-13220 bp得到10 k启动子区报告基因质粒，简称10 k。
18 k完整启动区报告基因质粒经PmlI酶切，自连后，切除-3477~-15596 bp得到5 k启动子区报告基因质粒，简称5 k。
所有报告基因克隆经PCR初步鉴定后，送测序确证。
实施例
9
：完整
hDAT
启动区域的启动活性研究
细胞系及细胞培养：2个来源于人的多巴胺细胞系SK-N-AS，SH-SY5Y购于ATCC。培养条件：37℃，5% CO2，湿化培养箱，培养液Dulbecco’s
modified Eagle’s medium (DMEM)添加10% (v/v) 胎牛血清, 青霉素(100 U/mL)，链霉素 (100
U/mL) (均购于Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)。SN4741来源于小鼠永生化胚胎黑质演化细胞系由Michael
J.Bannon教授（Wayne State University School of
Medicine, Detroit, USA）赠送。SN4741培养条件：33℃，5% CO2，湿化培养箱，培养液DMEM添加10% (v/v) 胎牛血清，青霉素(100 U/mL)，链霉素 (100
U/mL) 及0.6% 葡萄糖(Sigma,
St. Louis, MO, USA)。
瞬时转染：
第1天，细胞传代至24孔板，每孔0.5 ml培养液。
第2天，细胞至50％～70％融合。等摩尔质粒 DNA（18 k, 10 k, 5 k和空白载体pBeloBAC11-Ⅰ1），2.4 μl Superfect reagent(Qingen)，19 μl DMED，温和混合，静置20 min，加入150 μl完全培养液。弃细胞培养液，将混合物加入细胞培养孔。同时设立Mork（不加DNA）为对照。每次实验设置复孔。
第3天，加新鲜完全培养基500 μl。
第4天，转染后48 h，弃细胞培养液，PBS洗1篇。加入1×细胞裂解液（PLS Promega）100 μl，摇床上1 h。-20℃待测。
荧光素酶活性分析：应用荧光素酶测定试剂盒(Cat# E1500, Promega)，检测系统Bio-Tek Synergy HT/KC4。hDAT报告基因活性计算：（荧光素酶活性读值-背景读值）/蛋白量。背景为Mork的荧光读值（背景值不高于启动子报告基因测得值的1％）。转染载体 pBeloBAC11-Ⅰ1和背景值近似。
hDAT远端启动区的增强子的确证：不同长度的hDAT启动子活性研究 18 k，10 k和5 k质粒转染3个细胞系SK-N-AS，SN4741 和 SH-SY5Y，比较不同长度的hDAT启动子活性。荧光素酶报告显示长启动子18 k活性远高于短启动子（10 k和5 k）：在SK-N-AS细胞18 k启动活性是10 k的5.6倍，5 k的5.5倍，在SN4741细胞18 k启动活性是10 k的7.3倍，5 k的6.8倍，在SH-SY5Y细胞18 k启动活性是10 k的1.8倍，5 k的2.9倍。均达到显著性水平，表明远端-13220 bp~-8331 bp有增强子调控活性。
Claims (10)
1.一种报告基因质粒载体，其特征在于可以稳定克隆10～300 kb的 DNA片段。
2.权利要求1所述的报告基因质粒载体，其特征在于可以用于真核生物的10～300 kb的 DNA片段表达调控研究。
3.权利要求1和2所述的报告基因质粒载体，其特征在于包含2个SV40 late
poly(A)，合成poly (A)，报告基因，氯霉素抗性基因，多克隆位点和重组选择标记LacZa。
4.权利要求1－3所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于构建步骤包括①把含合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40 late poly(A)的片段，插入pBeloBAC11载体，得到pBeloBAC11-M，备用；②把SV40 late poly(A)，插入pBeloBAC11-M，即得报告基因质粒载体pBeloBAC11-MN。
5.权利要求4所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于构建步骤中的合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40 late poly(A)可以从市售报告基因质粒载体获得。
6.权利要求5所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于市售报告基因质粒可以是pGL3，pGL2系列萤火虫荧光素酶报告基因质粒，荧光蛋白系列报告基因质粒，分泌性碱性磷酸酶系列报告基因质粒。
7.权利要求5所述的报告基因质粒载体的构建方法，其特征在于合成poly(A)，多克隆位点，报告基因，SV40 late poly(A)的获得方法包括酶切和PCR扩增。
8.权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤①中的合成poly(A)，多克隆位点，报告基因和SV40 late poly(A)的片段，插入pBeloBAC11载体的位点在LacZa和氯霉素抗性基因之间。
9.权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤②中SV40 late poly(A)片段，插入pBeloBAC11-M的位点在sopC和cos之间。
10.权利要求1-9所述的报告基因质粒载体，其特征在于SV40 late poly(A)和合成poly (A)，可以关闭来自上游的任何转录活性，使质粒载体pBeloBAC11-MN报告基因的表达近似背景值。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110382300 CN102517315B (zh) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | 一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110382300 CN102517315B (zh) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | 一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102517315A true CN102517315A (zh) | 2012-06-27 |
| CN102517315B CN102517315B (zh) | 2013-07-10 |
Family
ID=46288381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110382300 Expired - Fee Related CN102517315B (zh) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | 一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102517315B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103484496A (zh) * | 2013-07-31 | 2014-01-01 | 新乡医学院 | 一种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途 |
-
2011
- 2011-11-28 CN CN 201110382300 patent/CN102517315B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHUWEN WANG ET AL.: "Studying human telomerase gene transcription by a chromatinized reporter generated by recombinase-mediated targeting of a bacterial artificial chromosome", 《NUCEIC ACIDS RESEARCH》 * |
| 范彦: "基于BAC同源重组高效构建小鼠胚胎干细胞Nanog基因报告体系", 《遗传》 * |
| 茆灿泉: "报告基因(lux，GFP)载体的构建和在肿瘤细胞及组织中表达的研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103484496A (zh) * | 2013-07-31 | 2014-01-01 | 新乡医学院 | 一种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102517315B (zh) | 2013-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108102940B (zh) | 一株利用CRISPR/Cas9系统敲除XKS1基因的工业酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| CN111278972B (zh) | 用于细胞遗传修饰的非整合型dna载体 | |
| CN110869498A (zh) | 经由核递送crispr/cas9导向编辑细胞rna | |
| WO2024002149A1 (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
| US20230125704A1 (en) | Modified bacterial retroelement with enhanced dna production | |
| EP1803815A2 (de) | Starker homologer Promotor aus Hamster | |
| CN108300671A (zh) | 一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| CN102517315B (zh) | 一种报告基因质粒载体、构建方法及其用途 | |
| CN113278635A (zh) | 一种促进环状rna成环的序列组合及其应用 | |
| CN113881678B (zh) | 一种c/ebpz基因启动子及其应用 | |
| CN103509823A (zh) | 一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统 | |
| EP4227409A1 (en) | Technique for modifying target nucleotide sequence using crispr-type i-d system | |
| CA3147863A1 (en) | Materials and methods for creating strains of saccharomyces cerevisiae that exhibit an increased ability to ferment oligosaccharides | |
| CN116218906A (zh) | 一种rna编辑器表达质粒、外泌体适配子融合表达质粒以及一种靶向基因rna编辑方法 | |
| CN110564743B (zh) | 一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用 | |
| CN103160510B (zh) | 一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子 | |
| CN102643816A (zh) | 绵羊角蛋白31皮肤毛囊特异性启动子及其克隆 | |
| CN102399810B (zh) | 一种携带attB高效定向整合假attP位点的载体及其转基因方法 | |
| CN102643817B (zh) | 绵羊k71皮肤毛囊特异性启动子及其克隆 | |
| CN105949285B (zh) | Rbbp5截短体的应用 | |
| CN110863009B (zh) | 一种牛kcnj12基因真核过表达载体的构建与应用 | |
| CN110777166B (zh) | 一种牛klf3基因真核过表达载体的构建与应用 | |
| WO2023183589A1 (en) | Rt-dna fidelity and retron genome editing | |
| CN106591311B (zh) | 核酸及其用途 | |
| CN103484496A (zh) | 一种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhao Ying Inventor after: Yang Jun Inventor after: Ma Lijuan Inventor after: Li Na Inventor after: Zhu Moli Inventor after: Di Desheng Inventor after: Yang Yuxin Inventor after: Li Hongbin Inventor after: Ding Yu Inventor after: Yuan Huifeng Inventor after: Liang Jinying Inventor after: Li Songji Inventor after: Zhao Fanrong Inventor before: Zhao Ying Inventor before: Li Songji Inventor before: Di Desheng Inventor before: Liang Jinying Inventor before: Yuan Huifeng Inventor before: Li Hongbin Inventor before: Yang Jun Inventor before: Ma Lijuan Inventor before: Li Na Inventor before: Zhu Moli |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHAO YING ZHAI DESHENG LIANG JINYING YUAN HUIFENG LI HONGBIN YANG JUN MA LIJUAN LI NA ZHU MOLI LI SONGJI TO: ZHAO YING ZHAI DESHENG YANG YUXIN LI HONGBIN DING YU YUAN HUIFENG LIANG JINYING LI SONGJI ZHAO FANRONG YANG JUN MA LIJUAN LI NA ZHU MOLI |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130710 Termination date: 20151128 |