CN102511395B - 一种牡丹胚珠的离体培养方法 - Google Patents

Abstract

一种牡丹胚珠的离体培养方法，取受精后15—90天的牡丹子房，用氯化汞消毒后取出胚珠，将胚珠分为15—48天胚珠组和49—90天胚珠组；将15—48天胚珠组接种到MS培养基避光培养3—15d后接种到MS培养基Ⅱ，避光培养10天，后见光培养7—27天；之后将其再次接种到MS培养基Ⅱ中见光培养8—28天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；对49—90天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养7—27天，然后再次接种到MS培养基Ⅱ中进行8—28天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ。可用于牡丹胚胎发育的离体研究，解决观赏性好而胚发生早期败育及牡丹远缘体细胞杂交败育的问题，通过胚珠培养，还可进行牡丹品种的改良研究。

Description

一种牡丹胚珠的离体培养方法

技术领域

    本发明涉及一种牡丹胚珠的培养方法，具体的说是一种牡丹胚珠的离体培养方法。

背景技术

牡丹为芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，是我国传统名花，富丽堂皇，国色天香，自古就有富贵吉祥、繁荣昌盛的寓意，不仅是中国人民喜爱的花卉，而且也受到世界各国人民的珍爱。并且牡丹不仅有观赏价值，还具有很高的药用价值。

牡丹品种作为整个产业发展的基础，需要不断的推陈出新，培育出具有不同花色、花型、花香、花期的新品种。牡丹新品种的传统育种方法繁殖率低，周期长，品种选育定向性差，育种有效性低，很多观赏性好的牡丹品种都存在胚的早期败育现象；而通过组织培养从营养器官获得牡丹完整植株或移栽也都存在技术瓶颈，这成为采用生物技术进行牡丹育种的障碍。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供一种牡丹胚珠的离体培养方法，其培育方法简单，易于操作，提高牡丹的培育性能，增加牡丹的经济效益。

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：一种牡丹胚珠的离体培养方法，其具体步骤为：

步骤一、取受精后15—90天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒，后取出胚珠，将胚珠分为两组，即15—48天胚珠组和49—90天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅰ中，培养温度为15—25℃，避光培养3—15d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，培养温度为15—25℃，避光培养10天，后将含有15—48天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养7—27天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养7—27天后的15—48天胚珠组，将其再次接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养8—28天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的49—90天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养7—27天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养7—27天后的49—90天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行8—28天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有1—10mg的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1—1mg的6-苄基腺嘌呤、40—60g的蔗糖和6.5g的琼脂；

所述MS培养基中Ⅱ的组成成分：每升MS培养基中Ⅱ中含有为0.1—1.5mg的6-苄基腺嘌呤、0.1—1.0mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。

有益效果

本发明提供了一种牡丹胚珠的离体培养方法，可用于牡丹胚胎发育的离体研究，解决一些观赏性好而胚发生早期败育及牡丹远缘体细胞杂交败育的问题，而且通过胚珠培养，还可进行牡丹品种的改良研究。本发明通过胚珠培养进行牡丹多倍体的育种研究，为牡丹育种提供一条新的途径，从而避开牡丹再生和移栽困难的问题。

具体实施方式

一种牡丹胚珠的离体培养方法，其具体步骤为：

步骤一、取受精后15—90天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒，后取出胚珠，将胚珠分为两组，即15—48天胚珠组和49—90天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅰ中，培养温度为15—25℃，避光培养3—15d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，培养温度为15—25℃，避光培养10天，后将含有15—48天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养7—27天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养7—27天后的15—48天胚珠组，将其再次接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养8—28天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的49—90天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养7—27天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养7—27天后的49—90天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行8—28天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有1—10mg的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1—1mg的6-苄基腺嘌呤、40—60g的蔗糖和6.5g的琼脂；

所述MS培养基中Ⅱ的组成成分：每升MS培养基中Ⅱ中含有为0.1—1.5mg的6-苄基腺嘌呤、0.1—1.0mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。

实施例一

一种牡丹胚珠的离体培养方法，其具体步骤为：

步骤一、分别取受精后15天的牡丹子房和49天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒，后取出胚珠，将胚珠分为两组，即15天胚珠组和49天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的15天胚珠组，将其接种到pH为5.4的MS培养基Ⅰ中，培养温度为15℃，避光培养15d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的15天胚珠组，将其接种到pH为5.4的MS培养基Ⅱ中，培养温度为15℃，避光培养10天，后将含有15天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1600勒克斯，每天光照16小时，培养27天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养27天后的15天胚珠组，将其再次接种到pH为5.4的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1600勒克斯，每天光照16小时，培养28天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的49天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养27天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养27天后的49天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行28天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有1mg的2,4—二氯苯氧乙酸、0.1mg的6-苄基腺嘌呤、40g的蔗糖和6.5g的琼脂，余量为水；

所述MS培养基中Ⅱ的组成成分：每升MS培养基中Ⅱ中含有为0.1mg的6-苄基腺嘌呤、0.1mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。

实施例二

一种牡丹胚珠的离体培养方法，其具体步骤为：

步骤一、分别取受精后27天的牡丹子房和70天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒，后取出胚珠，将胚珠分为两组，即27天胚珠组和70天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的27天胚珠组，将其接种到pH为5.7的MS培养基Ⅰ中，培养温度为20℃，避光培养8d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的27天胚珠组，将其接种到pH为5.7的MS培养基Ⅱ中，培养温度为20℃，避光培养10天，后将含有27天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1700勒克斯，每天光照16小时，培养15天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养15天后的27天胚珠组，将其再次接种到pH为5.7的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1700勒克斯，每天光照16小时，培养15天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的70天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养15天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养15天后的70天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行15天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有5mg的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5mg的6-苄基腺嘌呤、50g的蔗糖和6.5g的琼脂；

所述MS培养基中Ⅱ的组成成分：每升MS培养基中Ⅱ中含有为0.9mg的6-苄基腺嘌呤、0.5mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。

实施例三

一种牡丹胚珠的离体培养方法，其具体步骤为：

步骤一、分别取受精后48天的牡丹子房的90天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒，后取出胚珠，将胚珠分为两组，即48天胚珠组和90天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的48天胚珠组，将其接种到pH为6.0的MS培养基Ⅰ中，培养温度为25℃，避光培养3d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的48天胚珠组，将其接种到pH为6.0的MS培养基Ⅱ中，培养温度为25℃，避光培养10天，后将含有48天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1800勒克斯，每天光照16小时，培养7天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养7天后的48天胚珠组，将其再次接种到pH为6.0的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1800勒克斯，每天光照16小时，培养8天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的90天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养7天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养7天后的90天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行8天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有10mg的2,4-二氯苯氧乙酸、1mg的6-苄基腺嘌呤、60g的蔗糖和6.5g的琼脂；

所述MS培养基中Ⅱ的组成成分：每升MS培养基中Ⅱ中含有为1.5mg的6-苄基腺嘌呤、1.0mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。

Claims (1)

1.一种牡丹胚珠的离体培养方法，其特征在于，其具体步骤为：

步骤一、取受精后15—90天的牡丹子房，利用氯化汞对牡丹子房进行消毒后取出胚珠，将胚珠分为两组，即15—48天胚珠组和49—90天胚珠组，备用；

步骤二、取步骤一中的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅰ中，培养温度为15—25℃，避光培养3—15d，备用；

步骤三、取步骤二中避光培养后的15—48天胚珠组，将其接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，培养温度为15—25℃，避光培养10天后将含有15—48天胚珠组的MS培养基Ⅱ放在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养7—27天，备用；

步骤四、取步骤三中经过见光培养7—27天后的15—48天胚珠组，将其再次接种到pH为5.4—6.0的MS培养基Ⅱ中，在光线强度为1600—1800勒克斯，每天光照16小时，培养8—28天，得到成熟的牡丹种子Ⅰ；

步骤五、依据步骤三的方法，对步骤一中的49—90天胚珠组先进行10天的避光培养，后转为见光培养7—27天，然后依据步骤四的方法，对经过见光培养7—27天后的49—90天胚珠组再次接种到MS培养基Ⅱ中进行8—28天的见光培养，得到成熟的牡丹种子Ⅱ；

所述的MS培养基Ⅰ的组成成分：每升MS培养基Ⅰ中含有1—10mg的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1—1mg的6-苄基腺嘌呤、40—60g的蔗糖和6.5g的琼脂；

所述MS培养基Ⅱ中的组成成分：每升MS培养基Ⅱ中含有0.1-1.5mg的6-苄基腺嘌呤、0.1-1.0mg吲哚乙酸、30g的蔗糖和6.5g的琼脂。