CN102498213A - 使用aav载体的全身给药向视网膜递送广泛的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合物和方法，特别是基于scAAV的全身给药的方法，用于将基因递送至哺乳动物的视网膜的细胞，并且特别是递送至感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞、内核层细胞或视网膜色素上皮的细胞。

Description

使用AAV载体的全身给药向视网膜递送广泛的基因
技术领域
本发明涉及用于将基因递送至哺乳动物的视网膜细胞的组合物和方法。本发明还涉及通过表达治疗基因来治疗哺乳动物的眼睛的病症、特别是视网膜的病症的方法。本发明源于意外的发现，即尽管有血-视网膜屏障，但双链AAV载体的全身给药仍导致严重和广泛的视网膜细胞感染。本发明可以使用在任何哺乳动物、包括人类对象中。
背景技术
视网膜是眼睛内部的感光层。其由若干细胞类型形成，包括感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞。光感受器接受光并将其转变成经由视神经输送至大脑的信号。小比例的视网膜神经节细胞(约2％)也是感光的，其经由视网膜下丘脑束向大脑传输信息。这些细胞在调整瞳孔大小并控制昼夜节律中发挥作用。位于视网膜神经感觉层外部并与下面的脉络膜相连的色素细胞层(六角形细胞)相当于视网膜色素上皮(RPE)。RPE参与感光细胞外段的吞噬作用。它还参与维生素A循环(反式视黄醇至11-顺式视黄醛的异构化)。
涉及视网膜营养不良的绝大部分基因(诸如利伯先天性黑矇(Lebercongenital amaurosis，LCA)中的AIPL1、CRB1、CRX、GUCY2D、RPE65、LCA5和RPGRIP1(对于视网膜色素变性而言，有56个以上的相关基因，不能检查每个基因...从而除去该疾病，因为不能穷尽并且留下作为利伯黑矇的实例))在RPE或光感受器中表达。因此，视网膜疾病的有效基因疗法必需靶向光感受器和/或RPE，但其它细胞类型诸如双极细胞和Müller细胞(视网膜的主要神经胶质细胞类型)也是有价值的靶细胞(参见下文)。
对动物模型中视网膜细胞的转基因递送通常需要视网膜下或玻璃体内注射病毒载体。该程序可相对有效地将转基因表达引导至感光细胞或RPE细胞中。
然而，腺相关载体(rAAV)或慢病毒载体的视网膜下注射致使视网膜在注射的位点处脱离，并且可能导致诱发视网膜变薄和细胞破坏的后续局限性创伤，特别是在受感染的动物中(Le Meur等人，2007年；Pang J.等人，2008年，Cheng L等人，Retina 2005)。此外，视网膜下载体注射仅在受治疗眼的注射区域中引导转基因表达，向未治疗眼的扩散很有限；在AAV注射的新生小鼠中一般仅20％至30％的视网膜可以转导，虽然载体的扩散通常有赖于实验者。
虽然玻璃体内rAAV注射可有效将转基因表达引导至视网膜细胞中，但直接用药途径的有创性质可能表示对患者的风险。可能在接受慢病毒载体的玻璃体内注射的眼睛中未观察到转基因表达。
用于对视网膜进行基因转移的替代性的有效且无创的方法在于病毒基因载体的全身递送。这可能是临床应用的最佳策略，但其受到血-视网膜屏障的紧密连接的妨碍，所述血-视网膜屏障的紧密连接阻止病毒载体从血流中进入视网膜下腔，尤其是在成人中。
重组AAV属于将基因转入视网膜中的最强有力的基因递送工具。它们对人并非病原性的，显示低免疫原性，并且可在有丝分裂后的细胞中实现高水平且稳定的转基因表达。
然而，考虑到与玻璃体内或视网膜下注射相关的缺点，则需要替代性给药方法用于基因疗法。Daly等人(PNAS，1999)和Bostick等人(Gene Therapy，2007)在新生小鼠中静脉注射了分别编码人GUSB(β-葡糖醛酸酶)基因或碱性磷酸酶(AP)报道基因的常规的、单链的AAV载体。在许多器官中发现转基因产物，包括在视网膜中。然而，仅在新生小鼠中转导视网膜，所述新生小鼠中血-视网膜屏障并未成熟。
在上述的Daly等人(1999)和Bostick等人(2007)的研究中，未提供有关视网膜细胞中转基因表达水平(DNA或RNA)的信息。由于AP和GUSB均为分泌的酶，它们在视网膜内的存在可能是由于它们作为循环酶输送而非它们在视网膜细胞内表达。
因此，需要发展替代性策略，允许用基因转移载体有效靶向不同的视网膜层，特别是RPE、感光细胞和视网膜神经节细胞。此外，到目前为止，尚不存在用于有效靶向视网膜的内细胞诸如双极细胞或Müller细胞(视网膜的主要神经胶质细胞类型)的有效方法。然而，将基因转入双极细胞也可以具有巨大的治疗潜力，这由在双极细胞中的光触发通道表达之后失明小鼠视觉的恢复而证实(Lagali等人，NatureNeuroscience，2008，11卷(6)，667-675页)。类似地，Müller细胞(视网膜的主要神经胶质细胞类型)也可以是有极高价值的靶标细胞，因为发现致病基因(诸如利伯先天性黑矇中的CRB1)不仅在光感受器中表达，而且还在这些特定的神经胶质细胞中表达。因此，提供将基因递送到双极细胞和Müller细胞中的方法将是非常有利的。
下文所示结果证实，重组的自身互补型双链AAV载体(scAAV)，特别是血清型9，能够在成年小鼠中静脉内用药之后对视网膜进行转基因递送。发现分泌蛋白(mSEAP，鼠类分泌的碱性磷酸酶)和非分泌蛋白(GFP，绿色荧光蛋白)在视网膜中表达，表明成年视网膜细胞的有效转导。通过使用定量PCR检测视网膜中的转基因DNA，进一步确认转导的视网膜细胞中的转基因表达。该研究首次表明，有可能在将包含目的基因的scAAV载体(特别是scAAV9载体)单次全身给药(特别是通过静脉内注射)之后，使所述目的基因有效转移至视网膜细胞，实现视网膜中广泛的转基因表达。这些发现因此提供了用于治疗眼病、且更具体来说用于治疗视网膜病症的新方法。
发明内容
本发明的目的涉及一种包含目的治疗基因的双链自身互补型AAV(scAAV)载体，通过将所述scAAV载体向所述对象全身给药，用于治疗眼睛的病症、优选是视网膜的病症。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其通过将治疗基因递送至视网膜细胞诸如感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞，用于治疗病症。scAAV载体的全身注射还可以将基因转移引导至睫状体。这代表一种将治疗性蛋白(诸如抗VEGF因子)分泌到眼中的特别有价值的方法。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其用于将治疗性蛋白或RNA产生到视网膜的细胞中、或者从所述视网膜的细胞中产生出。例如，该治疗性蛋白或RNA的产生可以在视网膜细胞中发生，诸如在感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞中。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其通过腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、动脉内或静脉内(i.v.)注射、优选是i.v.注射来用药。
此外，本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其中所述scAAV载体是人血清型AAV载体，优选选自血清型6、8和9，最优选是血清型9。
scAAV9为代表性scAAV，其可以根据本发明来使用。因此，本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其中所述scAAV载体包含AAV9衣壳。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其中所述scAAV载体是假型scAAV载体，优选是scAAV2/9载体。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其中该scAAV载体(例如scAAV9或scAAV2/9载体)包含缺乏编码病毒序列的功能性Rep和Cap的复制缺陷型scAAV基因组。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，其中该基因编码治疗性RNA、或治疗性蛋白，所述治疗性RNA或治疗性蛋白已知在眼睛的病理学病症中、优选在病理学病症中是突变的或缺陷的，特别是在涉及视网膜细胞诸如感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞中是突变的或缺陷的。
本发明还涉及一种如上所述的scAAV载体，用于治疗选自遗传眼病(例如利伯氏先天性黑矇)和散发眼病(例如糖尿病性视网膜病)的视网膜病症，特别是包括脉络膜和视网膜的病症。代表性病症包括：色素性视网膜炎(Retinitis pigmentosa)、黄斑变性(Macular degeneration)、视锥-视杆营养不良(Cone-rod dystrophy)、视网膜脱离(Retinaldetachment)、高血压性视网膜病(hypertensive retinopathy)、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)、利伯氏先天性黑矇(Leber′s congenital amaurosis)、黄斑水肿(Macular edema)、鸟枪弹样脉络膜视网膜病(Birdshotchorioretinopathy)、卵黄形黄斑营养不良(Vitelliform maculardystrophy)、青光眼(Glaucoma)、玻璃体和球体的病症等等。本发明还提供了通过分泌治疗性蛋白的基因转移来治疗眼睛的某些其它病症的方法，所述其它病症包括巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症、视神经和视路的病症(不包括利伯氏遗传视神经病)、眼肌的病症等等。
本发明的另一目的涉及包含目的治疗基因的scAAV载体用于制造一种药物的用途，该药物通过将所述scAAV载体向所述对象全身给药来治疗眼睛的病症、特别是视网膜的病症。
本发明还涉及一种跨越血-视网膜屏障递送基因的方法，该方法包含以下步骤：将包含所述基因的scAAV载体通过全身途径向需要其的哺乳动物用药。
本发明的另一个目的涉及一种将基因、特别是治疗基因递送至需要其的哺乳动物中视网膜的细胞的方法，该方法包含通过全身途径将包含所述基因的scAAV载体对哺乳动物用药。所述用药使得视网膜的细胞、特别是感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞被所述scAAV载体感染并因此将所述基因和表达的蛋白递送至视网膜的所述细胞中。
本发明的另一个目的涉及一种将基因、特别是治疗基因递送至需要其的哺乳动物中眼睛的睫状体或视神经的方法，该方法包含通过全身途径将包含所述基因的scAAV载体用药于该哺乳动物。本发明因此还涉及一种下文更详细描述的scAAV载体，通过将所述scAAV载体全身给药于需要其的对象，从而感染睫状体或视神经的细胞，用于治疗眼睛的病症。
本发明还涉及一种在哺乳动物对象中跨越血-视网膜屏障进行基因疗法的方法，该方法包含将scAAV载体全身给药于对象。具体来说，可以使用、而是不仅可使用scAAV9(或scAAV2/9)载体。
本发明的另一个目的是一种基因修饰哺乳动物对象中眼睛的细胞、更具体而言是视网膜的细胞、特别是感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞的方法，该方法包含将scAAV载体全身给药于对象。在具体实施方式中，被修饰的眼睛细胞为睫状体细胞。
本发明还在于一种向对象的视网膜进行基因递送的方法，该方法包括将包含所述基因的scAAV载体全身给药于对象。可被本发明scAAV载体靶向的视网膜细胞的说明性实例包括感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞、或睫状体的细胞。
本发明的其它目的和应用提供在以下详细说明中。
附图说明
图1.在来自I.V.AAV-mSEAP注射的成年小鼠的眼组织样本中的mSEAP表达。
(A)在尾静脉中注射了ssAAV1、ssAAV9、scAAV1和scAAV9的小鼠的眼组织样本中载体基因组拷贝数。在每一组中，2个小鼠注射1x10e12vg，1个小鼠注射3x10e11vg。值为平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。
(B)在尾静脉中注射ssAAV9和scAAV9的小鼠的眼睛组织样本中mSEAP活性数。在每一组中，2个小鼠注射1x10e12vg，1个小鼠注射3x10e11vg。值为平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。
图2.用scAAV9-GFP载体-I-进行IV注射的成年小鼠的视网膜的代表性横截面
在IV注射2x1012vg的scAAV9载体之后4周经处理用于GFP免疫荧光法的视网膜切片显示若干视网膜层(a至b)的转导，所述视网膜层包括(a至d)神经节细胞(GCL，箭号)、(a，b，e)内核层(INL，箭号)、(f)罕见感光细胞(箭号)和(a，f)视网膜色素上皮细胞(RPE，箭头)。GCL：神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层；RPE：视网膜色素上皮。
图3.用scAAV9-GFP载体-II-进行IV注射的成年小鼠的视网膜的代表性横截面
在IV注射2x1012vg的scAAV9载体之后4周进行的GFP免疫荧光分析显示视神经(来自GCL)中的视网膜神经纤维(a，b)与睫状体(c，d)的强烈GFP着色。比例尺50μm。
图4.成年小鼠在静脉内递送scAAV9之后视网膜中的GFP表达。
小鼠8周龄时尾静脉递送2.1012vg的scAAV9-CMV-GFP之后4周的GFP免疫荧光(A，C，E，G)、和用Dapi核标志物复染的相同视图(B，D，F，H)。在睫状体(A和B中的CB)中和在RGC层(A至D，G，H)的许多细胞中，以及在INL的不同细胞类型、包括具有双极细胞(C至F中的箭头)和Müller细胞(G和H中的箭号)的形态的细胞中存在GFP表达。还检测到零散的光感受器(C、D、G和H中的星号)和RPE细胞(E和F中箭号)。(I，J)为视神经(来自GCL)中的GFP阳性的视网膜神经纤维。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：内核层；RGC：视网膜神经节细胞层。
图5.全身scAAV9注射介导对成年小鼠视网膜中RCG和双极细胞的基因转移
视网膜的(A至C)GFP/Brn-3a(RCG-特异性标志物)和(D至F)GFP/Chx10(双极细胞特异性标志物)双重免疫染色显示神经节和双极细胞的有效转导。在成年小鼠中尾静脉注射scAAV-CMV-GFP载体(每只小鼠2.1012vg)之后4周获得的视网膜的横向恒冷切片上进行双重标记。在(A至C)中：箭头指示双重标记的RGC而箭号指示仅表达GFP的细胞；转导的光感受器由星号突出显示。在(D至F)中：箭号指出表达高水平GFP的Chx10阳性双极细胞；由于上游RGC的转导，视网膜神经纤维层(星号)呈现GFP阳性。ONL：外核层；INL：内核层；RGC：视网膜神经节细胞层。
具体实施方式
对视网膜的广泛基因递送对于眼睛疾病、特别是对视网膜疾病的治疗是重大挑战，所述视网膜疾病诸如视网膜营养不良，包括利伯先天性黑矇(LCA)或色素性视网膜炎(RP)。在此，我们描述一种基于重组自身互补型双链AAV载体(scAAV)的全身给药的眼睛基因转移新方法。
发明人已证实，在成年小鼠中单次静脉内(IV)注射重组scAAV载体可以在双眼中、包括在视网膜的不同层中、睫状体中、神经纤维层中和脉络膜中实现广泛的转基因表达。这是在IV注射编码鼠分泌型碱性磷酸酶报道基因(mSEAP)的scAAV载体之后，在DNA和蛋白水平上首次观察的。然后，在将表达绿色荧光蛋白(GFP)的scAAV IV注射并且免疫检测转基因产物之后，在眼组织切片上确认IV基因转移至成年小鼠的眼睛中的scAAV载体的优势。发现视网膜的不同层被转导(虽然效率不同)。这些转导的层包括脉络膜、RPE、光感受器层和外核层(视杆/视锥)、外丛状层和内核层(双极、水平和无长突细胞)、内丛状层和神经节细胞层(神经节细胞)、神经纤维层(来自神经节细胞的轴突纤维)、最内层(Müller细胞)。还发现睫状体高度转导。
重要的是，这种基因递送程序未导致任何视网膜损伤，诸如视网膜脱离或变薄。发明人因此首次证实，scAAV载体的无创全身递送可以在成年动物中引导视网膜细胞的广泛转导。
这种对成年视网膜进行的无先例的全身AAV介导基因转移为绝大部分眼病、优选视网膜疾病的基因疗法提供了有希望的应用。
AAV载体
在本发明的范围内，术语″AAV载体″是指包含或衍生自AAV的组份并且适于感染哺乳动物细胞、优选人细胞的任何载体。术语AAV载体一般是指包含至少一种编码治疗性蛋白的核苷酸分子的AAV型病毒粒子(或毒粒)。如下文论述，AAV可衍生自各种血清型，包括血清型的组合(即″假型″AAV)，或衍生自各种基因组。另外，AAV载体可为复制缺陷型和/或靶向型。
腺相关病毒(AAV)是依赖性细小病毒，大小为约二十纳米。如其它细小病毒一样，AAV是单链的非包膜DNA病毒，具有长度为约5000个核苷酸的基因组，含有两个开放读码框。左边开放读码框编码负责复制(Rep)的蛋白，而右边开放读码框编码衣壳(Cap)的结构蛋白。所述开放读码框两侧为两个ITR序列，它们用作病毒基因组的复制起点。此外，该基因组还含有包装序列，允许将病毒基因组包装至AAV衣壳中。
AAV需要共辅助(co-helper)功能(其可例如通过腺病毒、或通过适宜的包装细胞或辅助质粒提供)以经历在培养细胞中的增殖性感染。在缺乏这种辅助功能的情况下，AAV毒粒基本上进入细胞，作为单链DNA分子迁移至细胞核，并且整合至细胞基因组中。AAV具有宽宿主范围的感染力，包括人细胞，普遍存在于人类中，并且是完全非致病性的。
AAV载体已被设计、产生以及用于介导人对象中的基因递送，包括用于治疗性目的。目前各国正在使用AAV载体进行临床试验。一般而言，用于基因转移的AAV载体包含缺乏编码病毒序列的功能性Rep和Cap的复制缺陷型AAV基因组。这种复制缺陷型AAV载体更优选缺乏大多数或所有Rep和Cap编码序列，并基本上保留一个或两个AAV ITR序列和包装序列。
产生这种AAV载体的方法已公开于文献中，包括使用包装细胞、辅助病毒或质粒、和/或杆状病毒系统(Samulski等人，(1989)J.Virology 63，3822；Xiao等人，(1998)J.Virology 72，2224；Inoue等人，(1998)J.Virol.72，7024；WO98/22607；WO2005/072364)。应注意，这些方法中有几种涉及无辅助AAV产生，其在本发明范围之内为优选的产生方法。还报道了产生假型AAV载体的方法(例如WO00/28004)，以及AAV载体的各种修改形式或制剂，用于降低它们在体内用药之后的免疫原性(参见如WO01/23001；WO00/73316；WO04/112727；WO05/005610；WO99/06562)。
本发明实施双链AAV载体，即AAV基因组为双链的自身互补型(scAAV)核酸(McCarty等人，Gene Therapy，2003)。通过从一个AAV末端重复序列上删除末端分解位点(trs)产生scAAV载体。这些修饰的载体，其复制基因组为野生型的长度的一半，具有包装DNA二聚体的倾向(McCarty等人，Gene Therapy，2003)。简单来说，在AAV的复制周期期间，Rep内切核酸酶对trs切口以引发产生单体基因组的第二次DNA复制过程。当Rep未能对trs切口时，产生scAAV的二聚体基因组(McCarty，Molecular Therapy 2008)。复制继续经过ITR以产生二聚体模板，该模板引发新一轮的DNA合成，产生二聚体单链基因组(二聚体逆向重复基因组)。两条链因此作为单分子包装至AAV毒粒中。该单链DNA分子的两半然后可以折叠，并且碱基配对以形成dsDNA分子。上文提及的McCarty等人的文章详细描述scAAV的产生过程，并可按照其来获得根据本发明的载体。
AAV载体可由各种血清型的AAV制备或衍生，所述各种血清型的AAV甚至可混合在一起或者与其它类型的病毒混合以产生嵌合型(例如假型)AAV病毒。在具体实施方式中，本发明中使用的scAAV载体衍生自人AAV病毒。这种人AAV(衣壳和ITR)可衍生自任何已知血清型，例如衍生自血清型1至11的任一种，优选衍生自AAV2、AAV4、AAV6、AAV8和AAV9，更优选衍生自AAV6、AAV8和AAV9，更甚优选衍生自AAV9。这种AAV载体的特定实例为：在AAV2衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组(一种核酸分子，其包含AAV2衍生的ITR和AAV2衍生的包装序列，操作性连接至编码治疗性蛋白的核酸，优选包含两个AAV2衍生的ITR位于AAV2衍生的包装序列和编码治疗性蛋白的核酸的两侧)的载体；在AAV4衍生的衣壳中包含AAV4衍生的基因组的载体；在AAV6衍生的衣壳中包含AAV6衍生的基因组的载体；在AAV8衍生的衣壳中包含AAV8衍生的基因组的载体；在AAV9衍生的衣壳中包含AAV9衍生的基因组的载体。
在另一具体实施方式中，AAV载体为假型AAV载体，即该载体包含源自至少两个不同AAV血清型的序列或组份。在具体实施方式中，假型AAV载体包含衍生自一个AAV血清型(例如AAV2)的AAV基因组和至少部分衍生自不同AAV血清型的衣壳。这种假型AAV载体的特定实例包括但不限于在AAV6、AAV8或AAV9衍生的衣壳中包含衍生自任何AAV血清型(例如自AAV1至AAV11)的基因组的载体。优选地，scAAV基因组衍生自AAV2基因组。这种其基因组衍生自AAV2基因组的假型scAAV的特定实例包括但不限于包含AAV6、AAV8或AAV9衍生的衣壳的载体。在另一具体实施方式中，假型scAAV载体在AAV9衍生的衣壳中包含衍生自任何上文提及的AAV血清型(例如血清型1至11)的基因组。在本发明的优选实施方式中，scAAV载体为在AAV9衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体(也称作scAAV2/9)。
在可与任何上述实施方式组合的另一具体实施方式中，scAAV载体可包含修饰的衣壳，包括非病毒来源或结构性修饰的蛋白或肽，以改变载体(衣壳突变体或″杂化″血清型)的向性。这些载体的重定向可以基于不同类型的修饰，诸如转衣壳、特异性抗体吸附至衣壳表面(包括具体受体的配体、具体配体的受体，以将载体靶向至分别表达所述受体或配体的细胞类型)、镶嵌型衣壳、嵌合型衣壳(Vivian W.Choi，CurrGene Ther.2005)。
如上文所论述，AAV衍生的基因组包含特别编码治疗性蛋白的治疗基因。一般在该实施方式中，该核酸还包含允许表达并优选分泌编码蛋白的调控序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、内核糖体进入位点(IRES)、编码蛋白转导域(PTD)的序列等等。就此而言，该核酸最优选包含与编码序列可操作连接的启动子区，以促使或提高在感染细胞中治疗性蛋白的表达。这种启动子可以是普遍存在的、组织特异性的、强的、弱的、受调控的、嵌合型的、可诱导的等等，以允许在感染组织中有效且适宜地产生蛋白。该启动子可以与编码蛋白同源或异源，包括细胞的、病毒的、真菌的、植物的或合成的启动子。本发明中使用的最优选的启动子应当在细胞或视网膜中、更优选在视网膜的感光细胞或神经节细胞中或在RPE的细胞中为功能性的。这种调控的启动子的实例包括但不限于含有Tet开/关元件的启动子、纳巴霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。普遍存在的启动子的实例包括病毒启动子，特别是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等等，以及细胞启动子，诸如PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子。启动子也可以是神经特异性启动子，诸如突触蛋白或NSE(神经元特异性烯醇酶)启动子(或位于普遍存在的PGK启动子上游的NRSE(神经元限制性沉默子元件)序列)，或者是各种视网膜细胞类型的特异性启动子，诸如RPE65、VMD2、视紫红质或视锥抑制蛋白启动子。
如果治疗基因编码治疗性RNA，则经典RNA聚合酶pol III启动子可以用于shRNA表达(例如人或鼠H1或U6启动子)。核酶和反义序列通常由标准聚合酶II启动子表达。如本领域已知，诱导型表达盒还可以适合于AAV介导的shRNA表达。
核酸也可包含在非目标细胞中实现抑制转基因表达的miRNA的靶序列。例如，在造血谱系中抑制表达(“去靶向”)能够通过降低转基因特异性免疫应答的发生率和程度来稳定转导细胞中的基因转移(Brown BD，Nature Medicine 2008)。
在具体实施方式中，核酸包含允许分泌编码蛋白的前导序列。目的转基因与编码分泌信号肽的序列(通常位于分泌多肽的N末端)的融合能允许产生可从转导细胞分泌的形式的治疗性蛋白。这种信号肽的实例包括白蛋白、β葡糖醛酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽。
根据另一特定实施方式，转基因与PTD序列诸如Tat或VP22序列融合，以便促使或提高治疗性蛋白从转导细胞分泌和被相邻转导细胞再摄取。
在具体实施方式中，核苷酸包含可操作地连接的启动子和前导序列，以允许表达和分泌编码蛋白。
在另一具体实施方式中，核酸包含可操作地连接的启动子、前导序列和PTD序列，以允许表达和分泌编码蛋白。
在最优选实施方式中，启动子在视网膜的细胞中、特别是在视网膜的感光细胞或神经节细胞中或在RPE中为特异性或功能性的，即，允许(优先)在所述细胞中表达转基因。
在具体实施方式中，核酸包含内含子(例如嵌合内含子)以增强mRNA和编码蛋白的表达。在该实施方式的特定变体中，本发明涉及scAAV9(或scAAV2/9)载体，其包含受到启动子(优选在视网膜细胞中为特异性或功能性的启动子)控制的目的基因(即转基因，例如如下所述的治疗基因之一)，其中在所述启动子和所述目的基因之间存在异源的或嵌合的内含子。已有报道，在启动子和转基因之间插入异源内含子可提高表达(Palmiter等人，1991，PNAS，88，478-482)。嵌合内含子可从例如Promega商购获得。本发明的载体中可用的举例说明性的嵌合内含子由人β珠蛋白内含子1的5′供体剪接位点以及分支点、和免疫球蛋白基因重链可变区的内含子衍生的3′受体剪接位点组成。
如上文所论述，scAAV载体可以通过本领域本来已知的技术产生，如在实施例中进一步说明。
全身给药
本发明是基于意外的发现，即，可通过AAV载体的全身给药来实现在视网膜的细胞中有效且广泛的基因表达。这种全身给药包括但不限于任何用药途径，其不意味直接注射至视网膜中，诸如视网膜下或玻璃体内注射。更具体来说，全身给药包括scAAV载体的全身注射，诸如肌内(i.m.)、血管内即动脉内(i.a.)或静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、皮下或经皮注射。外周用药还包括AAV载体的口服用药(WO96/40954)，使用植入物递送(WO01/91803)，或通过呼吸系统滴注(例如通过鼻内途径)用药，例如使用喷雾剂、气溶胶或任何其它适当制剂。最优选的全身给药包括scAAV载体的全身注射，最优选经由i.m.、i.p.、i.a.或i.v.注射。最优选地，scAAV载体经由i.v.注射用药。
scAAV载体一般以″治疗有效″量用药，即，所述量为足以减轻(例如减少、降低)与疾病状态相关的至少一种症状、或提供对象的病况改善的量。应当指出的是，如果需要，可以使用相同或不同的全身给药途径和/或相同或不同的scAAV血清型进行重复用药。或者，也可进行scAAV单次用药。
例如，取决于病况、对象(例如根据其体重、代谢等)、治疗计划等等，scAAV载体的剂量可以由熟练技术人员容易调适。本发明范围内的优选有效剂量为使得视网膜的细胞(感光细胞或神经节细胞或RPE的细胞)最佳转导的剂量。一般而言，小鼠每剂用药109至1014个病毒基因组(转导单位)，优选约1011至1013个。一般而言，对人用药的AAV载体的剂量范围可以是1011至1017个病毒基因组，优选1013至1016个，最优选1014至1015个。
scAAV载体可以用任何适宜形式用药，如作为液体溶液剂或悬浮剂、作为适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、作为凝胶剂或作为乳剂。scAAV载体一般用任何适当且药学上可接受的赋形剂、载剂、佐剂、稀释剂等等配制。对于注射来说，赋形剂可以是液体、等渗溶液、缓冲液，诸如无菌且无热原的水或无菌且无热原的磷酸盐缓冲盐溶液。对于吸入来说，赋形剂可以呈粒子形式。
眼睛/视网膜疾病
本发明首次表明，scAAV载体的单次全身给药致使双眼的细胞显著转导。具体来说，已观察到睫状体、神经纤维层、视神经以及视网膜的不同细胞层的转导。
具体来说，本发明表明，全身给药的scAAV载体(特别是scAAV9载体、更特别是scAAV2/9)载体可能通过跨过血-视网膜屏障而致使显著转导视网膜的细胞，特别是感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞。本文所示结果表明，从视网膜的最内层至RPE的转导是有效的，从而向视网膜中提供广泛基因递送。
本发明因此提供一种将基因递送至这些特定细胞类型中每一种的方法，所述方法包含在其基因组中携带所述基因的scAAV载体(特别是scAAV9、更特别是scAAV2/9载体)的全身给药。
本发明因此可通过将治疗性产物递送至上述细胞中、特别是视网膜的细胞中，用来治疗各种病症。治疗性产物可以是任何蛋白、肽或RNA，所述蛋白、肽或RNA能减轻或减少由于对象的细胞中蛋白的不存在、缺陷或过表达所致的症状，或者以其它方式赋予对象有益效果(例如通过从视网膜产生分泌型营养因子，其可以治疗由远离视网膜的细胞引起的病理状态)。本领域技术人员通过对其领域中的科学文献的了解而知道哪一些基因可能更适合包括在本发明的scAAV载体中以治疗特定疾病。治疗性蛋白的实例包括生长因子、细胞因子、激素、神经递质、酶、抗凋亡因子、血管生成因子或抗血管生成因子、和已知在病理学病症中突变的任何蛋白，所述病理学病症诸如色素性视网膜炎(例如，由视网膜色素上皮特异性蛋白65kDa(RPE65)或ATP结合盒的亚家族A(ABC1)的成员4(ABCA4)基因编码的蛋白)和利伯先天性黑矇(例如，由视网膜色素上皮特异性蛋白65kDa(RPE65)或鸟苷酸环化酶2D——膜(视网膜特异性)(GUCY2D)基因编码的蛋白)。
靶向双极细胞的巨大治疗潜力已通过在ON型双极细胞中表达光触发通道之后失明小鼠视觉的恢复而证实(Lagali等人，2008，NatureNeuroscience，11，6，667-675)。因此，本发明的具体实施方式涉及用scAAV载体(特别是scAAV2/9)来靶向双极细胞，所述scAAV载体包含用于恢复视觉的基因，特别是视紫红质通道-2基因(ChR2)。
本发明进一步更具体涉及如上文所定义的方法和使用，包含施用scAAV载体(特别是scAAV2/9)，所述scAAV载体包含用于治疗利伯氏先天性黑矇或色素性视网膜炎的基因，例如RPE65基因。
本发明还涉及scAAV载体、特别是scAAV9或scAAV2/9载体，其编码至少一种上述治疗性蛋白。
治疗性RNA的实例包括对任何以下所提及的疾病具有治疗性意义的反义RNA或siRNA(或shRNA)或微小RNA(miRNA)(诸如VEGFmRNA靶向性siRNA或miRNA)。本发明因此涉及scAAV载体、特别是scAAV9或scAAV2/9载体，其编码对眼病、诸如下文提及的疾病具有治疗性意义的siRNA或miRNA。在具体实施方式中，本发明涉及scAAV载体、特别是scAAV9或scAAV2/9载体，其编码VEGF mRNA靶向性siRNA(或sh-RNA)或miRNA。
取决于治疗性产物，本发明可用于治疗各种眼睛疾病，包括可通过将治疗性蛋白表达至视网膜的细胞中或从视网膜的细胞中表达所述治疗性蛋白来治疗或预防的任何疾病。这样的疾病包括遗传(例如利伯氏先天性黑矇)和散发(例如糖尿病性视网膜病)眼病，特别包括包括脉络膜和视网膜的病症。这些疾病中的一些包括色素性视网膜炎、黄斑变性、视锥-视杆营养不良、视网膜脱离、视网膜变性、高血压性视网膜病、视网膜母细胞瘤、利伯氏先天性黑矇、黄斑水肿、鸟枪弹样脉络膜视网膜病、卵黄形黄斑营养不良、青光眼、玻璃体和球体的病症等等。本发明还提供(通过分泌型治疗性蛋白的基因转移)治疗眼睛的其它病症的手段，所述其它病症包括巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症、视神经和视路的病症(不包括利伯氏遗传视神经病)、眼肌的病症等等。
本发明还可以用于感染可产生分泌产物的细胞。具体来说，包含编码分泌蛋白的目的基因的scAAV(特别是scAAV9、更特别是scAAV2/9)可用于感染上文描述的细胞、特别是睫状体的细胞。在感染之后，这些细胞可在眼睛的眼内组织中释放分泌产物(特别是分泌蛋白)并因此可以治疗范围很广的眼病。例如，本发明通过全身给药包含编码分泌型抗VEGF抗体的基因的scAAV载体(例如scAAV9或scAAV2/9载体)来治疗眼病。本发明因此还涉及scAAV载体、特别是scAAV9或scAAV2/9载体，其编码抗VEGF抗体。
本发明可用于任何哺乳动物、特别是人对象、包括成人中，以用于预防性或治愈性治疗。
本发明还可以用于诊断方法中，以检测哺乳动物对象中视网膜的细胞或亚组织切片的状态、活性或生长。对于这种情况，载体一般包含可检测的基因(荧光、发光等等)并用作标志物。
本发明还可以用于动物对象中，例如用于辅助研究治疗眼睛病症、特别是视网膜病症的候选药物，和/或用于了解视网膜的细胞生长、分化、活性等等的机制。
本发明的其它方面和优点在下面实验部分中公开，应认为该实验部分仅是说明性的，并不限制本申请的范围。
实施例
材料和方法
动物
从Charles River实验室(Les Oncins，法国)购买成年C57B1/6小鼠(6至8周龄，雌性，16个小鼠)。所有动物实验均根据护理和使用实验动物的欧洲准则进行，并通过当地伦理委员会(CREEA)批准。
载体
在巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子控制下，AAV载体表达绿色荧光蛋白(GFP)或小鼠分泌型碱性磷酸酶(mSEAP)。血清型9AAV的产生先前已有描述(Duque等人，2009)。简单来说，假型AAV2/9载体是通过将基于AAV2的重组单链(ss)或自身互补型(sc)基因组包装至AAV9衣壳中而产生的。该载体是在HEK293细胞中通过无辅助病毒的三质粒转染产生的，使用了(1)腺病毒辅助质粒(pXX6-80)；(2)编码rep2和cap1或9基因的AAV包装质粒(用于AAV1的pLTRC02和用于AAV9的p5E18-VD2/9)；(3)AAV2穿梭质粒，其含有在sc基因组中编码GFP(在巨细胞病毒立即早期(CMV IE)启动子的控制下)的基因或者在ss或sc基因组中编码mSEAP(鼠分泌型碱性磷酸酶)的基因。含有sc基因组的质粒是通过从一个反向末端重复序列上删除D序列和末端分解位点(trs)而构成。通过双重CsCl超速离心随后经磷酸盐缓冲盐水透析(五次缓冲液改变，每轮透析3小时)来净化重组载体(rAAV)。通过对注射至小鼠中的载体进行实时PCR和通过对注射至小猫中的载体进行斑点杂交，对物理粒子定量。载体滴定度表达为每毫升的病毒基因组(vg/ml)。
体内rAAV注射
12个成年小鼠用ssAAV1-mSEAP、scAAV1-mSEAP、ssAAV9-mSEAP和scAAV9-mSEAP注射至尾静脉中(4个小鼠每只小鼠注射3x1011vg，8个小鼠每只小鼠注射1012vg)。
四个成年小鼠(6周龄)用体积500μl的2x1012vg scAAV9-GFP注射至尾静脉中。与1ml注射器相连的30号针头插入尾静脉中，在约30秒内注射500μl病毒溶液。
mSEAP定量测定
将冷冻组织在700μl细胞核裂解缓冲液内裂解，该缓冲液包含在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的Wizard基因组DNA提取试剂盒(Promega公司)中。组织首先用Ultra-Turrax匀浆30秒，然后经受连续三次匀浆以实现完全裂解。细胞膜和碎片通过在4℃下以10,000g离心2分钟来沉淀。mSEAP活性在上清液中用化学发光分析来测量。简单来说，根据制造商的说明书(Tropix，Applied Biosystems)，使内源性碱性磷酸酶在65℃下热失活5分钟，并通过加入反应缓冲液和CPSD化学发光底物来测量耐热mSEAP。使用光度计(Perkin Elmer)定量化学发光。表达/活性水平根据净化的人胎盘碱性磷酸酶的标准曲线表达为每一裂解液的mSEAP ng数，并使用纳米橙蛋白定量分析
Figure BDA0000141988750000201
(nano-orangeprotein quantitation)(Invitrogen)标准化每μg蛋白。
载体基因组拷贝数定量
对眼裂解液进行基因组DNA提取(Wizard基因组DNA提取试剂盒，Promega)。通过实时PCR分析，使用对应于AAV载体基因组的反向末端重复序列区(ITR)的引物和探针来定量病毒基因组。用于引物对的序列为AAV-Fw 5’-CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3’(SEQ IDNO：1)、AAV-Rev 5’-GTAGATAAGTAGCATGGC-3’(SEQ ID NO：2)，并且用于MGB探针的序列为AAV-p5’-TAGTTAATGATTAACCCAAV-3’(SEQ ID NO：3)。使用对每一细胞归一化的肌联蛋白(titin)基因扩增反应，将数据表达为每一细胞的基因组拷贝数。用于titin扩增的引物对和Taqman探针为：Titin-Fw5’-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3’(SEQ ID NO：4)、Titin-Rev5’-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3’(SEQ ID NO：5)、Titin Vic/TAMRA探针5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’(SEQ ID NO：6)。对于分析，将72ng基因组DNA用作模板。使用rAAV载体质粒的稀释液以产生测定载体基因组拷贝的标准曲线。使用Applied Biosystems7700进行PCR，用序列检测系统(Sequence Detection System)(AppliedBiosystems)分析数据。
组织学分析
在注射之后30天麻醉小鼠(10mg/kg甲苯噻嗪，100mg/kg氯胺酮)，并用0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)继以4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液进行心脏内灌注。取下眼睛，并通过在4％PFA内过夜温育来后固定。然后在4℃下15％蔗糖中温育过夜，冷冻在冷异戊烷(-50℃)内，并在恒冷器上切割(14μm切片)。
GFP免疫荧光
冷冻切片用含10％山羊血清和0.4％Triton X-100的PBS培育1小时，然后用兔多克隆抗GFP抗体(Abcam，1∶800)温育过夜。切片在PBS内清洗并随后用生物素化抗兔IgG(Vector Laboratories，1∶200)在室温下温育1小时。通过用链亲和素-A488(Molecular Probes，1∶200)温育，检测GFP免疫荧光。切片在PBS内清洗，安装在Fluoromount-G内并通过共焦显微镜(Leica，激光发射：488nm，绿色)观察。
进一步组织学处理
进一步使用以下方案来进行受处理动物的眼睛的组织学分析，特别双重免疫荧光分析。
小鼠用10mg.kg-1甲苯噻嗪和100mg.kg-1氯胺酮深度麻醉，并用0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)继以冰冷的4％多聚甲醛的PBS溶液经心脏灌注。在摘出眼睛之后，通过在相同固定剂中过夜温育将眼睛后固定，在15％蔗糖的PBS溶液中冷冻保护过夜，冷冻在冷异戊烷(-50℃)中，并在恒冷器上切割成14μm厚的切片，该切片储存在-80℃下直至进一步处理。为了免疫荧光标记，将切片在PBS中漂洗两次，在含有10％标准山羊血清(NGS)和0.2％triton X-100的PBS中封闭一个小时，与一级抗体在含有1％NGS和0.2％triton X-100的PBS中4℃下温育过夜。使用抗GFP抗体(1∶800；Abcam，Cambridge，UK)、抗Brn-3a抗体(1∶1’000；Millipore，Billerica MA，USA)和抗Chx10抗体(1∶300；Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz CA，USA)。切片随后在PBS中漂洗，用荧光标记的二级抗体(Alexa-Fluor接合物，1∶1’000；Invitrogen，Cergy-Pontoise，法国)温育，用4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)标记，并用mowiol 4-88试剂(Sigma-Aldrich，Lyon，法国)安装在盖玻片下，然后在DM6000-B落射荧光显微镜(Leica Microsystèmes，Nanterre，法国)上检查。用显微镜的20倍物镜人工计数Brn-3a和GFP阳性细胞。
结果
载体基因组拷贝数定量
为分析在成年小鼠视网膜中不同AAV载体全身性基因转移的效率，将编码mSEAP的ssAAV1、scAAV1、ssAAV9和scAAV9载体注射至12个成年小鼠的尾静脉中(每组2个小鼠注射3x1011vg，每组1个小鼠注射1x1012vg)。
在所有AAV注射小鼠的眼睛组织样本中评估每一细胞的vg粒子数。一般说来，无论衣壳的血清型如何，对于介导细胞转导而言scAAV优于ssAAV。在注射的小鼠中，相比scAAV1，scAAV9载体甚至为每一细胞介导更高数量的vg粒子(图1A)。
这些结果清楚地表明对于I.V.眼睛转导而言scAAV、且最特别是scAAV9的优势。
mSEAP活性的定量
为验证scAAV9对于全身性眼睛转导的效率，通过对ssAAV9和scAAV9注射小鼠的组织样本进行生化分析，分析mSEAP活性。
同样，与注射单链载体的小鼠的眼睛相比，注射scAAV9载体的小鼠的眼睛表现出高度转导(图1B)。
GFP免疫荧光
为了分析IV注射scAAV9载体的小鼠的视网膜中的转基因分布，4个成年小鼠用2x1012vg scAAV9-GFP注射至尾静脉中。
对处理过的小鼠的组织学切片进行的GFP免疫荧光分析显示在若干视网膜层中显著的GFP表达(图2a、b)，所述若干视网膜层包括神经节细胞层(GCL)(图2a-d)、内核层(INL)(图a、b、e)、感光细胞(图2f)和RPE(图2a)。在神经节细胞层中表达最为强烈(图2c、d)。GFP表达还发现于视神经(神经节细胞的轴突)中(图3a、b)，并且在睫状体中尤为强烈(图3c、d)。
转基因表达在接近睫状体的区域中表现最强烈，表明聚集在这些非视网膜结构中的载体可以扩散至视网膜细胞层。综上所述，scAAV9-GFP在成年小鼠中的IV用药导致视网膜和非视网膜细胞的广泛转导。
发明人还将其结果描述如下并提供双重免疫荧光实验。
为解决神经组织中载体生物分布的问题，使用在CMV启动子的转录控制下表达报道基因mSEAP(鼠碱性磷酸酶的分泌形式)的AAV构建体。比较scAAV9和ssAAV9转导眼睛组织的效率。动物接受编码mSEAP报道基因的10e12个ssAAV9或scAAV9载体基因组的静脉内注射。在注射之后四周，摘出眼睛以用于在整个眼睛上定量AAV载体基因组和mSEAP活性。通过内源性基因Titin进行的实时PCR实验的归一化证实了ssAAV注射动物(n＝3)每一细胞的载体基因组拷贝数为0.010+/-0.003，表明ssAAV9能够在全身递送之后到达眼组织。该参数在scAAV注射动物(n＝3)中增加至0.318+/-0.198，表明相比其单链对应物，自身互补型AAV载体提供了转导增进。为评价转基因表达，我们在眼组织裂解液中定量mSEAP活性。已测得ssAAV9注射小鼠每mg蛋白的mSEAP活性为1.7+/-0.9pg。按照每一细胞增加的载体基因组拷贝数，mSEAP活性在scAAV9用药之后高了6倍，导致在处理的动物中每mg蛋白10.1+/-3.4pg的mSEAP。
基于这些结果，我们将研究集中于scAAV9，并分析用在CMVie启动子的转录控制下表达GFP的scAAV9载体进行静脉注射的小鼠的视网膜中GFP蛋白的表达模式。八周龄小鼠用scAAV9-GFP以每一动物2.1012载体基因组的剂量注射至尾静脉中。在注射之后四周，通过对恒冷切片的免疫荧光标记来检测GFP表达。在所有视网膜的层中都检测到GFP表达细胞(图4)。基于细胞形态学，在光感受器中(图4C、D、4G和H)、在RPE细胞中(图4E、H)、在Müller细胞中、在内核层细胞中(图4C-H)、在神经纤维层和视神经中(神经节细胞的轴突纤维中)(图4I、J)发现GFP表达。值得注意地，视网膜神经节细胞(RGC)层表现出最大转导，显示了众多的GFP阳性细胞体(图4A-H)。
为精确确定GFP表达细胞的表现型，我们使用特异性识别不同视网膜细胞类型的抗体进行双重免疫染色分析(诸如，Brn-3a、特异性表达于视网膜神经节细胞(RGC)的细胞核中的POU结构域转录因子(Nadal-Nicolas等人，2009)或特异性表达于双极细胞的细胞核中的转录因子Chx10(Liu等人，1994))。
GFP/Brn-3a双重免疫荧光法证实了视网膜中大比例的GFP阳性细胞为神经节细胞(图5A-C)。此外，GFP/Chx10共着色分析表明在scAAV9注射的动物中的内核层内的某些GFP转导细胞为双极细胞(图5D-F)。
对位于视神经水平上的三个横切片进一步定量RGC层中的神经节细胞内的基因转移效率，并且计数GFP阳性细胞、Brn-3a阳性细胞的数量和共表达两个标志物的细胞的数量。我们的结果表明，在成年小鼠中全身scAAV9-GFP递送导致每个RCG层视网膜切片转导了平均222.4+/-20.1个GFP阳性细胞。在它们之中，122.4+/-9.1为用Brn-3a双重标记的，证实45％+/-3的转导RGC细胞为神经节细胞(六个不同眼睛的平均值+/-SD)。
总而言之，这些结果示出了scAAV在成年小鼠中全身递送之后转导视网膜细胞的效率，表明有效跨越血-视网膜屏障。还可以表明载体从高度转导的非视网膜结构诸如睫状体的扩散(图3)。
与Bostick和共同研究者的先前实验(Bostick等人，2007)相反，我们证实IV scAAV注射在成年小鼠的视网膜中有效递送转基因，所述成年小鼠中的血-视网膜屏障是成熟的。不同转染细胞类型通过形态和位置标准、或者通过双重免疫荧光分析来识别。对成年视网膜的有效基因转移对于未来在有症状患者中的临床应用具有高度价值。
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Figure IDA0000141988830000021

Claims (16)

1.一种包含目的治疗基因的双链自身互补型AAV(scAAV)载体，通过将所述scAAV载体全身给药于需要其的对象用于治疗眼睛的病症、优选视网膜的病症。
2.根据权利要求1所述的scAAV载体，其通过将治疗基因递送至感光细胞、神经节细胞、神经胶质细胞(特别是Müller细胞)、内核层(INL)细胞(包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞)、或视网膜色素上皮(RPE)的细胞，用于治疗病症。
3.根据权利要求1所述的scAAV载体，通过将所述scAAV载体全身给药于需要其的对象，从而转导睫状体或神经纤维层或视神经的细胞，用于治疗眼睛的病症。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的scAAV载体，其用于将治疗性蛋白或RNA产生在视网膜、睫状体或神经纤维层或视神经的细胞中，或者从视网膜、睫状体或神经纤维层或视神经的细胞产生治疗性蛋白或RNA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的scAAV载体，其中所述全身给药是腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、动脉内或静脉内(i.v.)注射，优选是静脉内注射。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的scAAV载体，其中所述scAAV载体是人血清型AAV载体，优选自血清型6、8和9，最优选AAV9载体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的scAAV载体，其中的scAAV载体包含来自AAV9的衣壳。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的scAAV载体，其中的scAAV载体是假型scAAV载体，优选是scAAV2/9载体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的scAAV载体，其中的scAAV载体包含缺乏编码病毒序列的功能性Rep和Cap的复制缺陷型scAAV基因组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的scAAV载体，其中的基因编码治疗性RNA或治疗性蛋白，所述治疗性RNA或治疗性蛋白已知在眼睛的病理学病症、特别是视网膜的病理学病症中为突变的或缺陷的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的scAAV载体，其中所述病症选自遗传的和散发的眼睛病症，特别包括利伯氏先天性黑矇、糖尿病性视网膜病、脉络膜和视网膜的病症、色素性视网膜炎、黄斑变性、视锥-视杆营养不良、视网膜脱离、高血压性视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜母细胞瘤、黄斑水肿、鸟枪弹样脉络膜视网膜病、卵黄形黄斑营养不良、青光眼、视神经病、玻璃体和球体的病症、巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症、视神经和视路的病症例如利伯氏遗传视神经病、以及眼肌的病症。
12.一种scAAV9载体，其编码治疗性RNA、或治疗性蛋白，所述治疗性RNA或治疗性蛋白在眼睛的病理学病症中为突变的或缺陷的。
13.根据权利要求12所述的scAAV9载体，其编码ChR2或抗-VEGF抗体。
14.根据权利要求12所述的scAAV9载体，其编码VEGF mRNA靶向性siRNA(shRNA)或miRNA。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的scAAV9，其为假型scAAV2/9。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的scAAV9，其包含启动子、特别是视网膜特异性启动子，以及嵌合型内含子，
其中所述内含子被提供在所述启动子与编码治疗性RNA或蛋白的基因之间。
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