CN102492755A - 一种玻璃酸钠的酶解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法，首先，将玻璃酸钠溶解在pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中；然后将所得的溶液中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，快速升温至70-85℃使酶失活，加热时间为8-12min；最后，将所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。该方法比传统的玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的方法条件更温和，且在同等酶活力的前提下，可大大降低生产成本。
Description
技术领域：
本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法。
背景技术：
玻璃酸(hyaluronic acid，HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，其重均分子量一般为10万～1000万Da，分子中两种单糖的摩尔比为1∶1。
目前，酶解法制备低分子量HA和寡聚HA主要采用玻璃酸酶，其最适反应条件是：底物浓度为10g/L，酶浓度为150000U/L，反应液的pH值为5.0，反应温度为50℃；如需制得分子量为1×104的HA，酶解时间为3h。控制反应时间，可制得不同分子量的HA，但是，目前酶活力为50万u/g的医药级产品市场价为60万元/Kg，致使用玻璃酸酶酶解玻璃酸的成本过高。
另外，不同微生物来源的乳糖酶糖苷键键型作用存在特异性，实验研究表明米曲霉乳耱酶的水解优先顺序是β-l-6键＞β-1-4键＞β-1-3键.乳酸克鲁维酵母乳糖酶的水解顺序则是β-l-4键＞β-1-6键＞β-1-3键，而环状芽孢杆菌对β-1-4键具有高度的键专一性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种反应条件温和，生产成本低的玻璃酸钠的酶解方法。
为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：
一种玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玻璃酸钠溶解在pH值为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中得溶液A；
(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，加热至70-85℃使酶失活，加热时间为8-12min得酶解液；
(3)将步骤(2)所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤(1)中，1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g，更优选为1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。
在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液pH值为6.4。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤(2)中，1L溶液A中加入酶的量为100000-2500000U，更优选为1500000U。
在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(2)，酶解温度为50℃。
在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(2)，快速加热至75℃使酶失活，加热时间为10min。
在本发明的一优选实施例中，所述的β-半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤(3)中，用氯代烷基十六吡啶进行络合。
本发明与玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的最佳酶解条件：反应液pH值5.0，反应温度50℃相比，β-半乳糖苷酶的酶解条件：反应液pH值6.0-7.0，反应温度35-50℃更温和。
此外，虽然制得相同分子量玻璃酸钠，所需β-半乳糖苷酶的酶用量要大于玻璃酸酶，但是同级别酶，每单位酶活力(U)的价格，玻璃酸酶价格为β-半乳糖苷酶的百倍以上，(医药级产品市场价：β-半乳糖苷酶，酶活力5万u/g，500元/Kg；玻璃酸酶，酶活力50万u/g，60万元/Kg)。因此，本发明能够大大降低制备低分子量玻璃酸钠及其寡糖的生产成本。
具体实施方式：
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。
实施例1
取0.2g玻璃酸钠，分子量为118万Da，溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为2000000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解210min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例2
取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为100000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解180min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例3
取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为150000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解280min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例4
取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为750000U/L，于温控为50℃的水浴振荡器内酶解60min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例5
取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为7.0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为500000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解320min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例6
取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为1000000U/L，于温控为50℃的水浴振荡器内酶解120min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例7
取1g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为750000U/L，于温控为50℃的水浴振荡器内酶解60min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例8
取1g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为1500000U/L，于温控为50℃的水浴振荡器内酶解150min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例9
取1g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌)酶用量为1500000U/L，于温控为50℃的水浴振荡器内酶解210min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例10
取1g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β-半乳糖苷酶其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为1500000U/L，于温控为45℃的水浴振荡器内酶解240min，反应结束后，快速升温至75℃，使酶失活10min，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。
实施例检测数据汇总如下如表1所示：
表1
由上表可得出结论，β-半乳糖苷酶酶解玻璃酸钠的反应条件是：底物浓度为2-10g/L，磷酸盐缓冲液PH值为6-7，加入酶活力为10-200万U/L，酶解温度为35-50℃，酶解时间为60-320min。通过调节酶用量和反应时间，可得到不同分子量的玻璃酸钠。
Claims (9)
1.一种玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玻璃酸钠溶解在pH值为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中得溶液A；
(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，加热至70-85℃使酶失活，加热时间为8-12min得酶解液；
(3)将步骤(2)所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。
2.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g。
3.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。
4.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液pH值为6.4。
5.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(2)中，1L溶液A中加入酶的量为100000-2500000U，更优选为1500000U。
6.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(2)，酶解温度为50℃。
7.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(2)，快速加热至75℃使酶失活，加热时间为10min。
8.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述的β-半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。
9.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用氯代烷基十六吡啶进行络合。
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