一种玻璃酸钠的酶解方法
技术领域:
本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法。
背景技术:
玻璃酸(hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖,其重均分子量一般为10万~1000万Da,分子中两种单糖的摩尔比为1∶1。
目前,酶解法制备低分子量HA和寡聚HA主要采用玻璃酸酶,其最适反应条件是:底物浓度为10g/L,酶浓度为150000U/L,反应液的pH值为5.0,反应温度为50℃;如需制得分子量为1×104的HA,酶解时间为3h。控制反应时间,可制得不同分子量的HA,但是,目前酶活力为50万u/g的医药级产品市场价为60万元/Kg,致使用玻璃酸酶酶解玻璃酸的成本过高。
另外,不同微生物来源的乳糖酶糖苷键键型作用存在特异性,实验研究表明米曲霉乳耱酶的水解优先顺序是β-l-6键>β-1-4键>β-1-3键.乳酸克鲁维酵母乳糖酶的水解顺序则是β-l-4键>β-1-6键>β-1-3键,而环状芽孢杆菌对β-1-4键具有高度的键专一性。
发明内容:
本发明的目的是提供一种反应条件温和,生产成本低的玻璃酸钠的酶解方法。
为实现本发明的目的,本发明所采用的技术方案是:
一种玻璃酸钠的酶解方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将玻璃酸钠溶解在pH值为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中得溶液A;
(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶,于35-50℃酶解60-320min后,加热至70-85℃使酶失活,加热时间为8-12min得酶解液;
(3)将步骤(2)所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。
在本发明的一优选实施例中,所述步骤(1)中,1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g,更优选为1L磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。
在本发明的一更优选实施例中,所述步骤(1)中,磷酸盐缓冲液pH值为6.4。
在本发明的一优选实施例中,所述步骤(2)中,1L溶液A中加入酶的量为100000-2500000U,更优选为1500000U。
在本发明的一更优选实施例中,所述步骤(2),酶解温度为50℃。
在本发明的一更优选实施例中,所述步骤(2),快速加热至75℃使酶失活,加热时间为10min。
在本发明的一优选实施例中,所述的β-半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。
在本发明的一优选实施例中,所述步骤(3)中,用氯代烷基十六吡啶进行络合。
本发明与玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的最佳酶解条件:反应液pH值5.0,反应温度50℃相比,β-半乳糖苷酶的酶解条件:反应液pH值6.0-7.0,反应温度35-50℃更温和。
此外,虽然制得相同分子量玻璃酸钠,所需β-半乳糖苷酶的酶用量要大于玻璃酸酶,但是同级别酶,每单位酶活力(U)的价格,玻璃酸酶价格为β-半乳糖苷酶的百倍以上,(医药级产品市场价:β-半乳糖苷酶,酶活力5万u/g,500元/Kg;玻璃酸酶,酶活力50万u/g,60万元/Kg)。因此,本发明能够大大降低制备低分子量玻璃酸钠及其寡糖的生产成本。
具体实施方式:
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明,但它们不是对本发明的限定。
实施例1
取0.2g玻璃酸钠,分子量为118万Da,溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为2000000U/L,于温控为45℃的水浴振荡器内酶解210min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例2
取0.5g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.0磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为100000U/L,于温控为45℃的水浴振荡器内酶解180min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例3
取0.5g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为150000U/L,于温控为45℃的水浴振荡器内酶解280min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例4
取0.5g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为750000U/L,于温控为50℃的水浴振荡器内酶解60min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例5
取0.5g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为7.0磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为500000U/L,于温控为45℃的水浴振荡器内酶解320min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例6
取0.5g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为1000000U/L,于温控为50℃的水浴振荡器内酶解120min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例7
取1g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为750000U/L,于温控为50℃的水浴振荡器内酶解60min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例8
取1g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为1500000U/L,于温控为50℃的水浴振荡器内酶解150min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例9
取1g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶,其微生物来源为环状芽胞杆菌)酶用量为1500000U/L,于温控为50℃的水浴振荡器内酶解210min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例10
取1g玻璃酸钠,分子量为100万Da,溶解于装有100ml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中,待完全溶解后,加入β-半乳糖苷酶其微生物来源为环状芽胞杆菌,酶用量为1500000U/L,于温控为45℃的水浴振荡器内酶解240min,反应结束后,快速升温至75℃,使酶失活10min,然后,经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品,采用HPGPC法检测其分子量。
实施例检测数据汇总如下如表1所示:
表1
由上表可得出结论,β-半乳糖苷酶酶解玻璃酸钠的反应条件是:底物浓度为2-10g/L,磷酸盐缓冲液PH值为6-7,加入酶活力为10-200万U/L,酶解温度为35-50℃,酶解时间为60-320min。通过调节酶用量和反应时间,可得到不同分子量的玻璃酸钠。