CN102483408A - 用于糖基化分析的糖肽的es-ms - Google Patents

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Abstract

本文报告了用电喷射质谱确定免疫球蛋白糖基化的方法，所述方法在免疫球蛋白的消化之后和质谱分析之前不需要层析纯化步骤。

Description

用于糖基化分析的糖肽的ES-MS
本文报告了用于免疫球蛋白糖基化分析的质谱方法，所述方法不需要层析分离步骤。
发明背景
对于很多重组产生的治疗多肽，多肽的糖基化是重要的特征。糖基化多肽，也称作糖蛋白，在真核生物例如人和一些原核生物中介导许多必需的功能，所述功能包括催化、信号转导、细胞-细胞间的通讯、免疫系统的活动、分子识别和关联。在真核生物中糖蛋白占非胞质蛋白质的大多数(Lis，H.，等人，Eur.J.Biochem.218(1993)1-27)。糖基化的引入是共翻译和翻译后修饰并且，因此不是遗传控制的。寡糖的生物合成是涉及一些酶的多步骤过程，所述酶为底物彼此之间竞争。因此，糖基化的多肽包含寡糖的微多相系列，产生一套含有相同的氨基酸主链的不同的糖形。已经报告了例如糖基化多肽的末端唾液酸化来增加治疗剂的血清半寿期，并且含有末端半乳糖残基的寡糖结构的糖基化多肽显示从循环中增加的清除(Smith，P.L.，等人，J.Biol.Chem.268(1993)795-802)。因此，在治疗多肽，例如免疫球蛋白的生物技术生产中，寡糖微多相性和它的批次与批次之间的一致性的评估是重要的任务。
免疫球蛋白在它们的糖基化上明显地与其他的重组多肽不同。例如免疫球蛋白G(IgG)是分子量约150kDa的对称的多功能的糖基化多肽。它由两个相同的负责抗原结合的Fab部分和负责效应功能的Fc部分组成。IgG分子在Asn-297处的糖基化倾向于高度保守，所述Asn-297埋藏在重链的CH2结构域之间，与CH2结构域内的氨基酸残基形成广泛的接触(Sutton，B.J.和Phillips，D.C.，Biochem.Soc.Trans.11(1983)130-132)。Asn-297连接的核心寡糖结构是多相加工的，以致特定的IgG存在多种糖形。在Asn-297位的位点占据上存在变化(宏多相性)或者在糖基化位点处的寡糖结构存在变化(微多相性)，见例如Jenkins，N.，等人，Nature Biotechnol.14(1996)975-981。通常，在IgG单克隆抗体中更丰富的寡糖组是无唾液酸双触角复杂类型聚糖，主要是无半乳糖基化(G0)，单-半乳糖基化(G1)，或双半乳糖基化(G2)类型(Ghirlandaio，R.，等人，Immunol.Lett.68(1999)47-52)。
考虑到糖基化在重组的糖基化多肽的功能性质上的重要性和成熟的并且一致的产品生产方法的必要性，在发酵过程中在线或者ad-line分析重组产生的糖基化多肽的糖基化谱是非常期望的。
Kuhlmann(Kuhlmann，F.E.，等人，J.Am.Soc.Mass Spec.6(1995)1221-1225)报告了后反相高效液相层析柱，其中将75％的丙酸溶液和25％的2-丙醇按照1∶2的比例加入到柱体流中。具有电喷射电离质谱(LCIMS)的高效液相层析和具有串联质谱(LC/MS/MS)的液相层析被应用到促红细胞生成素(EPO)中位点特异性的糖类多相性分析中(Kawasaki，N.，等人，Anal.Biochem.285(2000)82-91)。
在US 2006/0269979中报告了用于诊断和监测类风湿性关节炎和其他的自身免疫性疾病的高通量的聚糖分析。在WO 2009/048196中报告了糖蛋白的鉴定方法。在US 7,351,540中报告了蛋白质的分离和分析。Shaw等人报告了用于人激肽释放酶15的免疫荧光测定的发展(Clin.Biochem.40(2007)104-110)。
发明概述
一方面本文报告了确定免疫球蛋白的糖基化的方法，其包括以下步骤：
-酶促消化免疫球蛋白，
-将免疫球蛋白片段吸收到琼脂糖(Sepharose)珠上，
-用包含三氟乙酸的溶液洗涤具有吸收的免疫球蛋白片段的琼脂糖珠，
-从琼脂糖珠中回收免疫球蛋白片段，
-对回收的免疫球蛋白片段进行电喷射质谱，并且
-从质谱数据中确定免疫球蛋白的糖基化。
发明详述
本发明涉及用ES-MS确定免疫球蛋白糖基化的方法，所述方法不需要在免疫球蛋白的酶促消化之后和质谱分析之前的层析纯化步骤。
人免疫球蛋白主要在297位的天冬酰胺残基(Asn297)处糖基化，所述Asn297具有核心岩藻糖基化的双触角复杂寡糖(根据Kabat编号)。Asn297指的是位于免疫球蛋白的Fc区域(Fc区域残基的Eu编号)约297位的天冬酰胺残基。然而，由于免疫球蛋白中出现的微小的序列变化，Asn297也可能位于297位的上游或者下游的约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。
哺乳动物细胞产生的免疫球蛋白通常包含分支的双触角的寡糖，所述寡糖通常通过N-连接附着到Fc区域的CH2结构域的Asn297上(见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，Trend.Biotechnol.15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着到GlcNAc的岩藻糖。每支臂中双触角糖结构，即双触角寡糖以多达两个半乳糖残基结束。根据与中央的甘露糖残基的键将臂表示为(1，6)和(1，3)。表示为G0的糖结构不包含末端半乳糖残基。表示为G1的糖结构在一支臂中包含一个或者多个半乳糖残基。表示为G2的糖结构在每支臂中包含一个或者多个半乳糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。Kabat，E.A.，等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，和Brueggemann，M.，等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；以及Love，T.W.，等人，MethodsEnzymol.178(1989)515-527详细报告了人恒定重链区。例如Routier，F.H.，Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述了抗体Fc部分的CHO类型的糖基化。
术语“免疫球蛋白”包含多种形式的免疫球蛋白如人免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或者T-细胞抗原缺失的免疫球蛋白(见例如WO 98/33523，WO 98/52976，和WO 00/34317)。例如在Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US5,204,244；Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327；Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268-270；Lonberg，N.，Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125中描述了免疫球蛋白的基因改造。
通常免疫球蛋白包含两个所称作的全长轻链多肽(轻链)和两个所称作的全长的重链多肽(重链)。每个全长重链多肽和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(一般全长多肽链的氨基末端部分)，所述可变结构域包含与抗原相互作用的结合区。每个全长重链和轻链多肽包含恒定区(一般羧基末端部分)。全长重链的恒定区介导抗体与i)具有Fcγ受体(FcγR)的细胞(FcγR)，如吞噬细胞结合，或者与ii)具有新生的Fc受体(FcRn)(也已知为Brambell受体)的细胞结合。它也介导与一些因子的结合，所述因子包括经典的补体系统因子如成分(C1q)。全长免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域依次包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。“全长的抗体重链”是由N-端至C-端方向的抗体重链可变区(VH)、抗体恒定区1(CH1)、抗体铰链区、抗体恒定区2(CH2)、抗体恒定区3(CH3)以及在IgE亚类的抗体的情况下任选地抗体恒定区4(CH4)组成的多肽。“全长的抗体轻链”是由N-端至C-端方向的抗体轻链可变区(VL)、抗体轻链恒定区(CL)组成的多肽。全长的抗体链通过CL-结构域和CH1结构域之间以及全长的抗体重链的铰链区之间的链间二硫键连接到一起。
近年来已经报告了免疫球蛋白的糖基化，即糖组成和多种附着的糖结构，对生物学性质具有强烈的影响(见例如Jefferis，R.，Biotechnol.Prog.21(2005)11-16)。哺乳动物细胞产生的免疫球蛋白包含以质量计2-3％的寡糖(Taniguchi，T.，等人，Biochem.24(1985)5551-5557)。这例如在G类(IgG)的免疫球蛋白中相当于在小鼠来源的IgG中2.3个寡糖链(Mizuochi，T.，等人，Arch.Biochem.Biophys.257(1987)387-394)和在人源的IgG中2.8个寡糖链(Parekh，R.B.，等人，Nature 316(1985)452-457)，其中一般两个寡糖链位于Fc-区的Asn297上而剩下的位于可变区(Saba，J.A.，等人，Anal.Biochem.305(2002)16-31)。
术语“羰基化”表示附着到免疫球蛋白全部氨基酸残基上的全部寡糖的总和。由于细胞糖基化的异质性，重组产生的免疫球蛋白不仅在特定的氨基酸残基上包含单个的、确定的N-或者O-连接的寡糖，还是多肽的混合物，所述多肽每种具有相同的氨基酸序列但是在各自特定的氨基酸位置上包含不同组成的寡糖。因此，上述术语表示一组寡糖，其附着到重组产生的免疫球蛋白的特定的氨基酸位置上，即附着的寡糖的异质性。在本申请中使用的术语“寡糖”表示多聚糖，其包含两个或者多个共价连接的单糖单位。
为表示不同的N-或者O-连接的寡糖，列举了从寡糖残基的非还原端至还原端的单个糖残基。为了表示，选择最长的糖链作为基本链。N-或者O-连接的寡糖的还原端是单糖残基，其与免疫球蛋白的氨基酸主链的氨基酸直接结合，然而位于作为基本链的还原端的相反末端的N-或者O-连接的寡糖的末端，被称为非还原端。
一方面本文报告了确定免疫球蛋白的糖基化的方法，其包括以下步骤：
-酶促消化免疫球蛋白，
-将免疫球蛋白片段吸收到琼脂糖珠上，
-用包含三氟乙酸的溶液洗涤具有吸收的免疫球蛋白片段的琼脂糖珠，
-从琼脂糖珠中回收免疫球蛋白片段，
-对回收的免疫球蛋白片段进行电喷射质谱，并且
-从质谱数据中确定免疫球蛋白的糖基化。
已经发现通过用包含三氟乙酸的溶液洗涤被吸附的免疫球蛋白片段可以实现免疫球蛋白糖基化的改进的电喷射质谱确定。在一个实施方案中，三氟乙酸的浓度从0.01％至1％(体积/体积)。在另一个实施方案中，三氟乙酸的浓度从0.05％至0.5％(体积/体积)。在再一个实施方案中，三氟乙酸的浓度是约0.1％(体积/体积)。此外，在酶促消化后可以进行层析纯化步骤但不是必需的。从以下的表1中可以看出用三氟乙酸洗涤明显地提高了定量确定的准确性并且同时降低了分析结果的标准差(SD)和变异系数(VK)。
表1：比较示例性的抗-CCR5抗体的糖基化测定的示例性结果。一式三份进行该测定。通过具有脉冲电流检测的离子交换层析已经确定了参考值(Fuc＝岩藻糖)。
Figure BDA0000140103770000061
术语“琼脂糖”(Sepharose)表示交联形式的琼脂糖(agarose)。琼脂糖(agarose)是包含作为单体结构单元的琼脂二糖的线性多糖，所述琼脂二糖又是由糖苷键连接的D-半乳糖和3，6-去水-L-吡喃半乳糖组成的二糖。
在一个实施方案中，酶促消化通过与酶温育进行，所述酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、IdeS和内切蛋白酶Arg C、Lys C以及Glu C。在另一个实施方案中，酶促消化通过与胰蛋白酶温育进行。
已经进一步发现在洗涤步骤使用含有78％至88％(体积/体积)浓度乙腈的溶液是有利的。在一个实施方案中，乙腈浓度是从80％至85％(体积/体积)。在另一个实施方案中乙腈浓度是约83％(体积/体积)。术语“约”表示其后的值是该值的+/-10％的范围中心。在该范围之外的值对定量确定具有负的影响。因此，在一个实施方案中洗涤步骤的溶液包含约0.1％(体积/体积)三氟乙酸和约83％(体积/体积)的乙腈。在一个实施方案中包括用78％至88％(体积/体积)的乙腈和水组成的溶液洗涤琼脂糖珠的步骤。在一个实施方案中方法包括用80％至85％(体积/体积)的乙腈和水组成的溶液洗涤琼脂糖珠的步骤。在一个实施方案中用约83％(体积/体积)的乙腈和水组成的溶液洗涤。在又一个实施方案中方法包括将酶促消化的溶液调整至78％至88％(体积/体积)的乙腈的步骤。在又一个实施方案中方法包括将酶促消化的溶液调整至80％至85％(体积/体积)的乙腈的步骤。在一个实施方案中调整至约83％(体积/体积)的乙腈。在另一个实施方案中方法包括用78％至88％(体积/体积)的乙腈的第二次洗涤步骤。在一个实施方案中方法包括用80％至85％(体积/体积)的乙腈的第二次洗涤步骤。在另一个实施方案中第二次洗涤是用约83％(体积/体积)的乙腈。
如果在本申请中参考的是体积比(体积/体积)，应用以下：
-取决于预期的终体积，从预期的终体积计算乙腈级分的相对体积，例如83％，
-提供计算的乙腈相对体积并且加入水直到得到预期的终体积，
-其后加入三氟乙酸的相对体积级分，所述相对体积基于预期的终体积计算。
例如，通过提供830ml乙腈(1000ml的83％)，另外加入水直到达到1000ml的体积，并且其后加入1ml(1000ml的0.1％(体积/体积))的三氟乙酸得到由0.1％(体积/体积)的三氟乙酸，83％(体积/体积)的乙腈和水组成的一升(1000ml)溶液。
在一个实施方案中方法包括用变性剂使免疫球蛋白变性的第一步骤。在另一个实施方案中在pH 8.5时变性。在一个实施方案中溶液由0.1％(体积/体积)三氟乙酸，83％(体积/体积)的乙腈和水组成。在另一个实施方案中琼脂糖珠是琼脂糖CL-4B珠。在一个实施方案中应用到琼脂糖珠持续5分钟。
在另一个实施方案中方法包括用水洗涤琼脂糖珠的步骤。在此步骤中从琼脂糖珠中回收了免疫球蛋白片段。
已经进一步发现不加入含有25％/75％(体积/体积)的2-丙醇/丙酸溶液，纯化的糖肽的离子化非常差。因此，尽管方法中没有加入，通过额外加入含有25％/75％(体积/体积)的2-丙醇/丙酸溶液可以进一步改进它。另外，如果加入含有25％/75％(体积/体积)的2-丙醇/丙酸溶液，可以增加存在更高的带电状态的糖肽，其可以用于不同的糖肽种类的正确定量。这可从表2的岩藻糖基化和G(2)形式看出。因此，在一个实施方案中，方法包括将免疫球蛋白片段与由25％(v/v)的2-丙醇和75％(v/v)的丙酸组成的溶液混合的步骤。
表2：示例性的抗-CCR5抗体的糖基化测定的示例性结果的比较。一式三份进行该确定。通过具有脉冲电流检测的离子交换层析已经确定了参考值(Fuc＝岩藻糖)。
提供以下的实施例和附图来帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了真正的范围。理解可以修饰给出的步骤而不用背离本发明的精神。
附图描述
图1方法示意图。
材料
从Merck购买Tris(羟基氨基甲烷)盐酸盐(TRIS-HCl)和盐酸胍。从VWR International Baker得到乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、盐酸、2-丙醇和丙酸。
从Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国得到胰蛋白酶。从GEHealthcare得到NAP5-Sephadex柱。从Amersham Bioscience购买CL-4B琼脂糖珠。从Millipore得到多筛选Solvinert 96孔0.45微米孔径低结合亲水性PTFE过滤板。
本发明用抗-CCR5抗体作为例证。在WO 2006/103100和WO 2009/090032中报告了它的产生和它的编码序列。
实施例1
消化
将300μg纯化的抗-CCR5抗体与pH 8.5的盐酸胍温育几分钟。在使用Sephadex柱将缓冲液交换至pH 8.5的TRIS-HCl后，无事先还原的情况下用胰蛋白酶在37℃过夜(16小时)消化抗体。
实施例2
纯化
用水洗涤1ml的琼脂糖CL-4B珠三次。将15μl清洗过的琼脂糖珠分散到200μl水中并且然后将其分配到96-孔Multiscreen过滤板的孔中。每次用200μl水洗涤琼脂糖珠两次，并且每次在真空岐管中使用＜0.1英寸汞柱的真空用200μl 83％乙腈/水溶液调整两次。将40μl胰蛋白酶消化液调节到83％(体积/体积)的乙腈中。其后将消化的溶液应用到经调节的琼脂糖珠上并且轻轻摇动下温育五分钟。用合适的盖子覆盖96孔板来防止乙腈蒸发。每次用200μl 0.1％的TFA-83％ACN(体积/体积)洗涤琼珠两次，并且每次用200μl 83％(体积/体积)的乙腈洗涤两次。在洗涤步骤中琼脂糖珠必须一直保持润湿来防止糖肽的洗脱。在96孔v-底板中三次用30μl水从琼脂糖珠上回收糖肽。
实施例3
用于质谱的样品制备
为MS纳米喷射分析，将糖肽与30μl含有25％/75％(体积/体积)的2-丙醇/丙酸的溶液混合。通过纳米喷雾(NanoMate)直接将制备的样品注入到质谱仪中。
实施例4
质谱
为测定来自Waters的校准的q-TOF Ultima，使用来自Advion的NanoMate源来代替常规的ultima纳米喷雾源。在288分钟内可以完全自动化地测定96个样品。

Claims (10)

1.确定免疫球蛋白的糖基化的方法，所述方法包括：
-酶促消化免疫球蛋白，
-将免疫球蛋白片段吸收到琼脂糖(Sepharose)珠上，
-用包含三氟乙酸的溶液洗涤具有吸收的免疫球蛋白片段的琼脂糖珠，
-从琼脂糖珠回收免疫球蛋白片段，
-对回收的免疫球蛋白片段进行电喷射质谱，和
-从质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于洗涤步骤中三氟乙酸的浓度是从0.05％至0.5％(体积/体积)。
3.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于通过将溶液中的免疫球蛋白与酶温育来进行酶促消化，所述酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、IdeS、ArgC、Lys C和Glu C。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于包括将酶促消化物的溶液调节到78％至88％(体积/体积)乙腈的步骤。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于包括在包含三氟乙酸、78％至88％(体积/体积)的乙腈和水的溶液中将免疫球蛋白片段吸收到琼脂糖珠的步骤。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于包括使用由78％至88％(体积/体积)的乙腈和水组成的溶液对琼脂糖珠的第二次洗涤步骤。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于包括通过用水洗涤琼脂糖珠回收免疫球蛋白片段的步骤。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于包括回收步骤之后将免疫球蛋白片段与包含25％(体积/体积)的2-丙醇和75％(体积/体积)的丙酸的溶液混合的步骤。
9.根据前述权利要求任一项的方法在分析免疫球蛋白的糖基化中的用途。
10.根据权利要求9的用途，其特征在于所述分析是ad-line分析或者高通量分析。
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