KR20120041247A

KR20120041247A - 글리코실화의 분석을 위한 당펩티드의 ｅｓ-ｍｓ

Info

Publication number: KR20120041247A
Application number: KR1020127005857A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠스 하베르거; 디트마르 로이쉬; 마우리케 셀만; 만프레트 부흘러
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2012-04-30
Also published as: EP2475991A1; JP2013504043A; AU2010291498A1; US20120172255A1; CA2770243A1; CN102483408A; BR112012002249A2; MX2012002030A; IL217397A0; SG178973A1; WO2011026640A1

Abstract

본원에는 면역글로불린의 소화 후 및 질량 분광분석 전에 크로마토그래피 정제 단계를 필요로 하지 않는 전기분무 질량 분광분석으로 면역글로불린의 글리코실화를 측정하는 방법이 보고되어 있다.

Description

글리코실화의 분석을 위한 당펩티드의 ＥＳ-ＭＳ {ES-MS OF GLYCOPEPTIDES FOR ANALYSIS OF GLYCOSYLATION}

본 발명은 크로마토그래피 분리 단계를 필요로 하지 않는 면역글로불린의 글리코실화 분석을 위한 질량 분광분석법에 관한 것이다.

폴리펩티드의 글리코실화는 많은 재조합적으로 제조된 치료적 폴리펩티드에 대해 중요한 특징이다. 또한 당단백질로도 불리는 글리코실화 폴리펩티드는 촉매작용, 신호, 세포-세포 의사소통, 면역계의 활성, 분자 인지 및 회합을 비롯해 진핵 유기체, 예를 들어 인간, 및 일부 원핵생물에서 많은 필수적인 기능을 매개한다. 당단백질은 진핵 유기체의 비-세포질 단백질의 대부분을 차지한다 (Lis, H., et al., Eur. J. Biochem. 218 (1993) 1-27). 글리코실화의 도입은 번역과 동시 및 번역-후 개질이며, 그러므로 유전적으로 통제되지 않는다. 올리고당의 생합성은 기질에 대해 서로 경쟁하는 여러 효소가 포함되는 다단계 공정이다. 따라서, 글리코실화 폴리펩티드는 미세불균일한 배열의 올리고당을 포함하며, 동일한 아미노산 골격을 함유하는 상이한 당형태 세트를 발생시킨다. 글리코실화 폴리펩티드의 말단 시알릴화는 예를 들어 치료제의 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 보고되었고, 말단 갈락토오스 잔기를 갖는 올리고당 구조를 함유하는 글리코실화 폴리펩티드는 순환으로부터 증가된 제거를 보였다 (Smith, P.L., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 795-802). 그러므로, 치료적 폴리펩티드, 예를 들어, 면역글로불린의 생물기술학적 제조시, 올리고당 미세불균일성 및 이의 배치-대-배치 일관성의 평가가 중요한 과제이다.

면역글로불린은 다른 재조합 폴리펩티드와 글리코실화에 있어 크게 상이하다. 면역글로불린 G (IgG) 는 예를 들어, 대략의 분자 질량이 150 kDa 인 대칭성, 다기능성 글리코실화 폴리펩티드이다. 이것은 항원 결합을 담당하는 2 개의 동일한 Fab 부분 및 효과기 기능을 담당하는 Fc 부분으로 이루어져 있다. 글리코실화는 Asn-297 에서 IgG 분자에 크게 보존되는 경향이 있고, 이것은 중쇄의 CH2 도메인 사이에 매장되어, CH2 도메인 내 아미노산 잔기와 광범위한 접촉을 형성한다 (Sutton, B.J. and Phillips, D.C., Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132). 코어 올리고당 구조에 연결된 Asn-297 은 특이적 IgG 가 다중 당형태로 존재하는 것과 같이, 불균질하게 가공된다. 변이는 Asn-297 부위의 부위 점유 (거대불균일성) 에 존재하거나, 글리코실화 부위에서 올리고당 구조 내 변이 (미세불균일성) 에 의해 존재하며, 예를 들어, 문헌 [Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981] 을 참조한다. 일반적으로, IgG mAb 내의 더욱 풍부한 올리고당 기는 주로 비-갈락토실화 (G0), 1-갈락토실화 (G1), 또는 2-갈락토실화 (G2) 유형의, 아시알로 (asialo) 2-안테나구조 복합체 유형 글리칸이다 (Ghirlandaio, R., et al., Immunol. Lett. 68 (1999) 47-52).

재조합 글리코실화 폴리펩티드의 기능적 특성에 대한 글리코실화의 중요성 및 잘 정의되고 일정한 생산물 생산 방법의 필요성을 제시하여, 발효 공정 동안 재조합으로 제조된 글리코실화 폴리펩티드의 글리코실화 프로파일의 온라인 또는 애드-라인 (ad-line) 분석이 매우 바람직하다.

Kuhlmann (Kuhlmann, F.E., et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 6 (1995) 1221-1225) 은 컬럼 흐름에 1:2 비의 75% 프로피온산 및 25% 2-프로판올 용액의 후-역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 첨가를 보고하였다. 전기분무 이온화 질량 분광분석으로의 고성능 액체 크로마토그래피 (LCIMS) 및 탠덤 질량 분광분석으로의 액체 크로마토그래피 (LC/MS/MS) 가 에리트로포이에틴 (EPO) 중의 부위-특이적 탄수화물 불균일성의 분석에 적용되었다 (Kawasaki, N., et al., Anal. Biochem. 285 (2000) 82-91).

US 2006/0269979 에는 류마티스 관절염 및 기타 자가면역 질환을 진단하고 모니터링하기 위한 고 처리량 글리칸 분석이 보고되어 있다. 당단백질의 확인 방법은 WO 2009/048196 에 보고되어 있다. US 7,351,540 에는 단백질 단리 및 분석이 보고되어 있다. 인간 칼리크레인 15 에 대한 면역형광측정 어세이의 개발이 Shaw et al. (Clin. Biochem. 40 (2007) 104-110) 에 의해 보고되어 있다.

본원에서 하나의 양상으로서 하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 글리코실화의 측정 방법이 보고된다:

- 면역글로불린을 효소적으로 소화시키는 단계,

- 면역글로불린 절편을 세파로오스 비이드에 흡수시키는 단계,

- 흡수된 면역글로불린 절편이 있는 세파로오스 비이드를 트리플루오로아세트산을 포함하는 용액으로 세정하는 단계,

- 세파로오스 비이드로부터 면역글로불린 절편을 회수하는 단계,

- 회수된 면역글로불린 절편의 전기분무 질량 분광분석을 수행하는 단계, 및

- 질량 분광분석 데이터로부터 면역글로불린의 글리코실화를 측정하는 단계.

본 발명은 면역글로불린의 효소 소화 후 및 질량 분광분석 전에 크로마토그래피 정제 단계를 필요로 하지 않는 ES-MS 으로 면역글로불린의 글리코실화를 측정하는 방법에 관한 것이다.

인간 면역글로불린은 코어 푸코실화 2-안테나구조 복합체 올리고당 (Kabat 에 따른 넘버링) 으로 위치 297 (Asn297) 에서 아스파라긴 잔기에 주로 글리코실화된다. Asn297 은 면역글로불린의 Fc 영역 내 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링) 에 위치한 아스파라긴 잔기를 말한다. 그러나, Asn297 은 또한 면역글로불린에서 발생하는 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297 의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 내지 300 에 위치할 수 있다.

포유류 세포에 의해 생성되는 면역글로불린은 전형적으로는, 일반적으로 N-연결에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 부착된 분지된, 2-안테나구조 올리고당을 포함한다 (예를 들어, Wright, A. and Morrison, S.L., Trend. Biotechnol. 15 (1997) 26-32 참조). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐 아니라, 2-안테나구조 올리고당 구조의 "줄기" 내에 GlcNAc 에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 2-안테나구조 당구조, 즉, 2-안테나구조 올리고당은 각각의 분지에 2 개 이하의 갈락토오스 잔기에 의해 종결된다. 분지는 중심 만노오스 잔기에 대한 결합에 따라 (1,6) 및 (1,3) 으로 표시된다. G0 로 표시되는 당구조는 말단 갈락토오스 잔기를 포함하지 않는다. G1 로 표시되는 당구조는 하나의 분지 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다. G2 로 표시되는 당구조는 각각의 분지 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다 (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 인간 불변 중쇄 영역은 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991); Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; 및 Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 158 (1989) 515-527] 에 상세히 보고되어 있다. 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어, 문헌 [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 기재되어 있다.

"면역글로불린" 이라는 용어는 다양한 형태의 면역글로불린, 예컨대 인간 면역글로불린, 인간화 면역글로불린, 키메라성 면역글로불린, 또는 T 세포 항원 결핍 면역글로불린을 포함한다 (예를 들어, WO 98/33523, WO 98/52976, 및 WO 00/34317 참조). 면역글로불린의 유전 조작은 예를 들어, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125] 에 기재된다.

면역글로불린은 일반적으로 2 개의 소위 전장 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 전장 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 각각의 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인 (가변 영역) (일반적으로 전장 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 각각의 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 불변 영역 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 을 포함한다. 전장 중쇄의 불변 영역은 i) Fc 감마 수용체 (FcgR) 를 가진 세포, 예컨대 식세포에 대한, 또는 ii) 또한 Brambell 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 가진 세포에 대한 항체의 결합을 매개한다. 이것은 또한 보체 (C1q) 와 같은 고전적인 보체계의 인자를 포함하여 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 전장 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 분절, 즉, 4 개의 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (CDR) 을 포함한다. "전장 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경첩 영역, 항체 불변 도메인 2 (CH2), 항체 불변 도메인 3 (CH3), 및 서브계열 IgE 의 항체의 경우에는 임의로 항체 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전장 항체 사슬은 CL-도메인과 CH1 도메인 사이의, 및 전장 항체 중쇄의 경첩 영역 사이의 사슬내 디술피드 결합을 통해 함께 연결된다.

최근 면역글로불린의 글리코실화, 즉, 당류 조성 및 다수의 부착된 당구조가 생물학적 특성에 큰 영향을 준다는 것이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16] 참조). 포유류 세포에 의해 생성되는 면역글로불린은 2-3 질량% 올리고당을 함유한다 (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). 이것은 예를 들어, 계열 G 의 면역글로불린 (IgG) 에서 마우스 기원의 IgG 내 2.3 올리고당 사슬 (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) 및 인간 기원의 IgG 내 2.8 올리고당 사슬 (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457) 과 동등하며, 일반적으로 2 개는 Asn²⁹⁷ 의 Fc-영역에, 나머지는 가변 영역에 위치한다 (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).

"글리코실화" 라는 용어는 면역글로불린의 모든 아미노산 잔기에 부착된 모든 올리고당의 합을 나타낸다. 세포의 글리코실화 불균일성으로 인해, 재조합으로 제조된 면역글로불린은 특이적 아미노산 잔기에 단일한, 규정된 N- 또는 O-연결 올리고당을 포함할 뿐 아니라, 각각 동일한 아미노산 서열을 갖지만 각각의 특정화된 아미노산 위치에 상이하게 구성된 올리고당을 포함하는 폴리펩티드의 혼합물이다. 그러므로, 상기 용어는 재조합으로 제조된 면역글로불린의 특정화된 아미노산 위치에 부착된 올리고당의 그룹, 즉, 부착된 올리고당의 불균일성을 나타낸다. 본 출원에서 사용되는 "올리고당" 이라는 용어는 2 개 이상의 공유 연결된 단당류 단위를 포함하는 중합체성 당류를 나타낸다.

상이한 N- 또는 O-연결된 올리고당의 표기를 위해, 개개의 당 잔기가 올리고당 잔기의 비-환원성 말단에서 환원성 말단까지 열거된다. 최장 당 사슬이 표기를 위한 기본 사슬로서 선택되었다. N- 또는 O-연결된 올리고당의 환원성 말단은 면역글로불린의 아미노산 골격의 아미노산에 직접 결합된 단당류 잔기인 반면, 기본 사슬의 환원성 말단으로서 반대 말단에 위치하는 N- 또는 O-연결된 올리고당의 말단이 비-환원성 말단으로 불린다.

본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 글리코실화의 측정 방법이다:

- 면역글로불린을 효소적으로 소화시키는 단계,

흡착된 면역글로불린 절편을 트리플루오로아세트산을 포함하는 용액으로 세정함으로써, 면역글로불린의 글리코실화의 개선된 전기분무 질량 분광분석 측정이 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 하나의 구현예에서 트리플루오로아세트산의 농도는 0.01% 내지 1% (v/v) 이다. 또다른 구현예에서 트리플루오로아세트산의 농도는 0.05% 내지 0.5% (v/v) 이다. 더욱 또다른 구현예에서, 트리플루오로아세트산의 농도는 약 0.1% (v/v) 이다. 부가적으로는 크로마토그래피 정제 단계가 효소 소화 후에 수행될 수 있으나 반드시 필요한 것은 아니다. 하기 표 1 로부터 볼 수 있듯이, 트리플루오로아세트산으로의 세정은 정량 측정의 정확성을 명백하게 향상시키고, 부수적으로 분석 결과의 표준 편차 (SD) 및 변동 계수 (VK) 를 감소시킨다.

표 1: 예시적 항-CCR5 항체의 글리코실화의 측정을 위한 예시적 결과의 비교. 3 중으로 측정을 수행하였다. 참조값은 펄스 전류측정 검출로의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정되었다 (Fuc = 푸코오스).

"세파로오스 (Sepharose)" 라는 용어는 아가로오스의 가교결합된 형태를 표시한다. 아가로오스는 단량체성 빌딩 블록으로서, 글리코시드로 연결된 D-갈락토오스 및 3,6-안히드로-L-갈락토피라노오스로 이루어지는 이당류인 아가로비오스를 포함하는 선형 다당류이다.

하나의 구현예에서 효소적 소화는 트립신, 키모트립신, 파파인, IdeS, 및 엔도프로테이나아제 Arg C, Lys C 및 Glu C 로부터 선택되는 효소로 인큐베이션함으로써 수행된다. 또다른 구현예에서 효소적 소화는 트립신으로 인큐베이션함으로써 수행된다.

세정 단계의 용액을 78% 내지 88% (v/v) 의 아세토니트릴 농도로 사용하는 것이 유리하다는 것이 추가로 밝혀졌다. 하나의 구현예에서 아세토니트릴 농도는 80% 내지 85% (v/v) 이다. 또다른 구현예에서 아세토니트릴 농도는 약 83% (v/v) 이다. "약" 이라는 용어는 그 후에 이어지는 값이 상기 값의 +/- 10% 의 범위의 중심에 있는 것을 표시한다. 범위 이외의 값은 정량 측정에 부정적인 영향을 준다. 그러므로, 하나의 구현예에서, 세정 단계의 용액은 약 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 및 약 83% (v/v) 아세토니트릴을 포함한다. 하나의 구현예에서 본 방법은 세파로오스 비이드를 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어지는 용액으로 세정하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서 본 방법은 세파로오스 비이드를 80% 내지 85% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어지는 용액으로 세정하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서 세정은 약 83% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어지는 용액으로 수행된다. 추가의 구현예에서 본 방법은 효소 소화물의 용액을 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴로 조정하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서 본 방법은 효소 소화물의 용액을 80% 내지 85% (v/v) 아세토니트릴로 조정하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서 조정은 약 83% (v/v) 아세토니트릴로 수행된다. 또다른 구현예에서 본 방법은 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴로의 제 2 세정 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서 본 방법은 80% 내지 85% (v/v) 아세토니트릴로의 제 2 세정 단계를 포함한다. 또다른 구현예에서 제 2 세정은 약 83% (v/v) 아세토니트릴로 수행된다.

본 출원에서 부피비 (v/v) 를 참조하는 경우, 하기를 적용한다:

- 의도되는 최종 부피에 따라 아세토니트릴 분획의 상대적 부피, 예를 들어, 의도되는 최종 부피로부터 83% 를 계산한다,

- 계산된 상대적 부피의 아세토니트릴을 제공하고 의도되는 최종 부피가 수득될 때까지 물을 첨가한다,

- 이후 상대적 부피 분획의 트리플루오로아세트산을 첨가하고, 의도되는 최종 부피에 근거하여 계산한다.

예를 들어, 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산, 83% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어지는 1 리터 (1000 ml) 의 용액은, 830 ml 아세토니트릴 (1000 ml 의 83%) 을 제공하고, 여기에 1000 ml 의 부피에 도달할 때까지 물을 첨가한 후, 1 ml (1000 ml 의 0.1% (v/v)) 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 수득된다.

하나의 구현예에서 본 방법은 면역글로불린을 변성제로 변성시키는 제 1 단계를 포함한다. 또다른 구현예에서 변성은 pH 8.5 에서 수행된다. 하나의 구현예에서 용액은 0.1% (v/v) 트리플루오로 아세트산, 83% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어진다. 또다른 구현예에서 세파로오스 비이드는 세파로오스 CL-4B 비이드이다. 하나의 구현예에서 세파로오스 비이드에 대한 적용은 5 분 동안 수행된다.

또다른 구현예에서 본 방법은 세파로오스 비이드를 물로 세정하는 단계를 포함한다. 본 단계에서 면역글로불린 절편이 세파로오스 비이드로부터 회수된다.

25%/75% (v/v) 2-프로판올/프로피온산을 함유하는 용액을 첨가하지 않으면 정제된 당펩티드의 이온화가 매우 열악하다는 것이 추가로 밝혀졌다. 그러므로, 본 방법은 상기의 첨가 없이 수행될 수 있지만, 이것은 25%/75% (v/v) 2-프로판올/프로피온산을 함유하는 용액을 부가적으로 첨가함으로써 추가로 향상될 수 있다. 부가적으로는, 당펩티드의 상이한 당펩티드 종류의 올바른 정량화에 사용될 수 있는 당펩티드의 보다 높은 전하 상태가, 25%/75% (v/v) 2-프로판올/프로피온산을 함유하는 용액을 첨가하는 경우 증가하여 존재한다. 이것은 표 2 로부터 푸코실화 및 G(2) 형태에 대해서 볼 수 있다. 그러므로, 하나의 구현예에서 본 방법은 면역글로불린 절편을 25% (v/v) 2-프로판올 및 75% (v/v) 프로피온산으로 이루어지는 용액과 혼합하는 단계를 포함한다.

표 2: 예시적 항-CCR5 항체의 글리코실화의 측정을 위한 예시적 결과의 비교. 3 중으로 측정을 수행하였다. 참조값은 펄스 전류측정 검출로의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정되었다 (Fuc = 푸코오스).

하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 이의 참 범주는 특허청구범위에 언급된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 언급된 절차에 변형이 이뤄질 수 있는 것으로 이해된다.

도 1 도식적 방법 도표.

물질

트리스(히드록시 아미노메탄)히드로클로라이드 (TRIS-HCl) 및 구아니디늄-히드로클로라이드를 [Merck] 에서 구입하였다. 아세토니트릴 (ACN), 트리플루오로아세트산 (TFA), 염산, 2-프로판올 및 프로피온산을 [VWR International Baker] 에서 입수하였다.

트립신을 [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany] 에서 입수하였다. NAP5-Sephadex 컬럼을 [GE Healthcare] 에서 입수하였다. CL-4B 세파로오스 비이드를 [Amersham Bioscience] 에서 구입하였다. Multiscreen Solvinert 96 웰 0.45 ㎛ 공극-크기 저-결합 친수성 PTFE 필터 플레이트를 [Millipore] 에서 입수하였다.

본 발명은 항-CCR5 항체로 예시된다. 이의 제조 및 이의 코딩 서열은 예를 들어, WO 2006/103100 및 WO 2009/090032 에 보고되어 있다.

실시예 1

소화

300 ㎍ 의 정제된 항-CCR5 항체를 구아니디늄-히드로클로라이드 (pH 8.5) 로 수 분 동안 인큐베이션시켰다. Sephadex 컬럼을 사용하여 TRIS-HCl pH 8.5 로 완충액 교환 후, 항체를 트립신으로 이전 환원 없이 37℃ 에서 밤새 (16 시간) 소화시켰다.

실시예 2

정제

1 ml 의 Sepharose CL-4B 비이드를 물로 3 회 세정하였다. 15 ㎕ 의 깨끗한 세파로오스 비이드를 200 ㎕ 물에 소멸시키고 (dissipated), 이후 96-웰 Multiscreen 필터 플레이트의 웰에 할당하였다. 비이드를 200 ㎕ 의 물로 각각 2 회 세정하고, < 0.1 인치 Hg 의 진공을 사용하는 진공 매니폴드 상에서 200 ㎕ 의 83% 아세토니트릴/물 용액으로 각각 2 회 조건화시켰다. 40 ㎕ 의 트립신 소화물을 83% (v/v) 아세토니트릴로 조정하였다. 이후 소화 용액을 조건화된 세파로오스 비이드에 적용하고, 5 분 동안 천천히 교반하면서 인큐베이션시켰다. 96 웰 플레이트를 적합한 뚜껑으로 덮어, 아세토니트릴이 증발하는 것을 방지하였다. 비이드를 200 ㎕ 0.1% TFA-83% ACN (v/v) 으로 각각 2 회, 200 ㎕ 83% (v/v) 아세토니트릴로 각각 2 회 세정하였다. 세정 단계 동안 비이드는 당펩티드 형태가 용리되는 것을 방지하기 위해 항상 습윤형태로 유지되어야만 한다. 당펩티드를 96 웰 v-바닥 플레이트에서 30 ㎕ 의 물로 3 회 비이드로부터 회수하였다.

실시예 3

질량 분광분석을 위한 샘플 조제

MS 나노스프레이 분석을 위해 당펩티드를 25%/75% (v/v) 2-프로판올/프로피온산을 함유하는 30 ㎕ 의 용액과 혼합하였다. 조제된 샘플을 나노스프레이 (NanoMate) 에 의해 질량 분광분석기에 직접 주입하였다.

실시예 4

질량 분광분석

측정을 위해, 보통의 ultima 나노스프레이 공급원 대신에 NanoMate 공급원 (Advion) 으로의 물로부터 보정된 q-TOF Ultima 를 사용하였다. 96 개의 샘플을 288 분 내에 완전히 자동화되어 측정할 수 있다.

Claims

하기 단계를 포함하는 면역글로불린의 글리코실화의 측정 방법:
- 면역글로불린을 효소적으로 소화시키는 단계,
- 면역글로불린 절편을 세파로오스 비이드에 흡수시키는 단계,
- 흡수된 면역글로불린 절편이 있는 세파로오스 비이드를 트리플루오로아세트산을 포함하는 용액으로 세정하는 단계,
- 세파로오스 비이드로부터 면역글로불린 절편을 회수하는 단계,
- 회수된 면역글로불린 절편의 전기분무 질량 분광분석을 수행하는 단계, 및
- 질량 분광분석 데이터로부터 면역글로불린의 글리코실화를 측정하는 단계.
제 1 항에 있어서, 세정 단계 중의 트리플루오로아세트산의 농도가 0.05% 내지 0.5% (v/v) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소적으로 소화시키는 단계가 용액 중의 면역글로불린을 트립신, 키모트립신, 파파인, IdeS, Arg C, Lys C 및 Glu C 로부터 선택되는 효소로 인큐베이션시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 소화물의 용액을 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴로 조정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 트리플루오로아세트산, 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴 및 물을 포함하는 용액 중에서 면역글로불린 절편을 세파로오스 비이드에 흡수시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 78% 내지 88% (v/v) 아세토니트릴 및 물로 이루어진 용액으로의 세파로오스 비이드의 제 2 세정 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 세파로오스 비이드를 물로 세정함으로써 면역글로불린 절편을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 회수 단계 후 면역글로불린 절편을 25% (v/v) 2-프로판올 및 75% (v/v) 프로피온산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
면역글로불린의 글리코실화의 분석에서의 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
제 9 항에 있어서, 분석이 애드-라인 (ad-line) 분석 또는 고-처리량 분석인 것을 특징으로 하는 용도.