CN102477098A - 融合蛋白及其在制备人白血病抑制因子中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合蛋白及其在制备人白血病抑制因子中的应用。所述融合蛋白自氮端至碳端依次包括序列1自N端第1至110位氨基酸残基所示Trx蛋白、序列1自氮端第152至156位氨基酸残基所示肠激酶特异识别位点和序列1自氮端第157至336位氨基酸残基所示huLIF成熟核心蛋白;肠激酶特异识别位点的碳端与huLIF成熟核心蛋白的氮端连接。本发明利用Trx作为融合伙伴,在兼顾高效表达同时,成功解决了原核表达huLIF时易形成无活性包涵体的瓶颈问题,通过巧妙引入重组肠激酶识别位点,实现了氮端无多余氨基酸残基重组huLIF的生产。本发明有助于满足人白血病抑制因子日趋增大的临床应用需求,解决当前生产过程中存在的关键技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其在制备人白血病抑制因子中的应用。
背景技术
一、人白血病抑制因子的应用价值
白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)最早由小鼠KrebI I腹水瘤细胞的条件培养液中分离获得,对小鼠髓细胞样白血病(myeloid leukemia)M1细胞系表现出抑制增殖和促进分化的生物学活性(Hilton DJ,Nicola NA Metcalf D.Purification of a murine leukemia inhibitory factor from Krebs ascites cells.Anal Biochem,1988,173(2),p:359-67.),并因此得名。随后,众多的研究结果纷纷表明:LIF不仅能够抑制小鼠白血病,更是一种具有广泛生物学功能的细胞因子(Kurzrock R,Estrov Z,Wetzler M,et al.LIF:not just a leukemia inhibitoryfactor.Endocr Rev,1991,12(3),p:208-17.),能够在造血(Verfaillie C McGlaveP.Leukemia inhibitory factor/human interleukin for DA cells:a growth factorthat stimulates the in vitro development of multipotential human hematopoieticprogenitors.Blood,1991,77(2),p:263-70.)、生殖(Smith SK,Charnock-JonesDS Sharkey AM.The role of leukemia inhibitory factor and interleukin-6in humanreproduction.Hum Reprod,1998,13Suppl 3,p:237-43;discussion 244-6.;Shellard J,Perreau J Brulet P.Role of leukemia inhibitory factor duringmammal ian development.Eur Cytokine Netw,1996,7(4),p:699-712.)、成骨(Cornish J,Callon K,King A,et al.The effect of leukemia inhibitory factoron bone in vivo.Endocrinology,1993,132(3),p:1359-66.)、免疫(PattersonBK,Behbahani H,Kabat WJ,et al.Leukemia inhibitory factor inhibits HIV-1replication and is upregulated in placentae from nontransmitting women.J ClinInvest,2001,107(3),p:287-94.;Linker RA,Kruse N,Israel S,et al.Leukemiainhibitory factor deficiency modulates the immune response and limitsautoimmune demyelination:a new role for neurotrophic cytokines inneuroinflammation.J Immunol,2008,180(4),p:2204-13.)、神经发育(TurnleyAM Bartlett PF.Cytokines that signal through the leukemia inhibitory factorreceptor-beta complex in the nervous system.J Neurochem,2000,74(3),p:889-99.)以及脂肪代谢(Moran CS,Campbell JH Campbell GR.Human leukemiainhibitory factor upregulat es LDLreceptors onliver cells and decreases serumcholesterol in the cholesterol-fed rabbit.Arterioscler Thromb VascBiol,1997,17(7),p:1267-73.)等过程中参与正常的生理功能以及某些疾病病理进程的调节。1987年,Gearing等人从T淋巴细胞的cDNA文库中克隆获得了小鼠的LIF基因,并实现了体外重组表达(Gearing DP,Gough NM,King JA,et al.Molecular cloning andexpression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor(LIF).EMBO J,1987,6(13),p:3995-4002.)。目前,小鼠的LIF蛋白(Murine l eukemiainhibitory factor,mLIF)已经被普遍用于小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)的体外培养。迄今,国内外研究者已经在人、大鼠、猪和羊等组织或细胞中证实了不同种属来源的LIF基因的存在和LIF蛋白的表达,其中,人源LIF(Human leukemiainhibitory factor,huLIF)最为受到关注。近年来,随着研究的不断深入,huLIF正逐渐呈现出良好的临床应用前景。在疾病的治疗方面,huLIF能够控制神经元的分化和表型的选择,诱导交感神经元分泌神经肽,加强感觉神经元的存活以及延长人多能神经干细胞在体外增殖时间,其在临床治疗神经损伤,恢复神经功能等方面具有良好的应用前景(Ng YP,He W Ip NY.Leukemia inhibitory factor receptor signalingnegatively modulates nerve growth factor-induced neurite outgrowth in PC12cells and sympathetic neurons.J Biol Chem,2003,278(40),p:38731-9.;DowsingBJ,Romeo R Morrison WA.Expression of leukemia inhibitory factor in human nervefollowing injury.J Neurotrauma,2001,18(11),p:1279-87.;CaffertyWB,Gardiner NJ,Gavazzi I,et al.Leukemia inhibitory factor determines thegrowth status of injured adult sensory neurons.J Neurosci,2001,21(18),p:7161-70.;Bauer S Patterson PH.Leukemia inhibitory factor promotes neural stemcell self-renewal in the adult brain.J Neurosci,2006,26(46),p:12089-99.)。同时,由于在胚胎着床、生长、发育和分化等方面具有重要的作用,重组huLIF正越来越多的被尝试用于解决多种女性生殖问题(Aghajanova L.Update on the role ofleukemia inhibitory factor in assisted reproduct ion.Curr Opin Obstet Gynecol,2010,22(3),p:213-9.;Paiva P,Menkhorst E,Salamonsen L,et al.Leukemiainhibitory factor and ihterleukin-11:critical regulators in the establishmentof pregnancy.Cytokine Growth Factor Rev,2009,20(4),p:319-28.;AghajanovaL.Leukemia inhibitory factor and human embryo implantation.Ann N Y Acad Sci,2004,1034,p:176-83.;郭晓霞.白血病抑制因子(LIF)在生殖医学中的研究进展.中国优生与遗传杂志,1999,7(6).;Lass A,Weiser W,Munafo A,et al.Leukemiainhibitory factor in human reproduct ion.Fert il Steril,2001,76(6),p:1091-6.),包括:治疗不孕症、习惯性自发流产,以及提高辅助生育过程中体外受精和胚胎移植成功率,提供节育新思路等等。近年来,huLIF还被广泛认为与机体的免疫功能的调节具有密切的关系,Patterson等人发现在胎盘内分泌的huLIF是一种内源性的I型人免疫获得性缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的抑制因子,能够抑制病毒的复制和垂直转播,显示出通过免疫途径治疗HIV感染的潜在价值;近来,huLIF还被证明与怀孕、异体移植耐受和肿瘤逃逸等免疫调控过程密切相关(Nasef A,Mazurier C,Bouchet S,et al.Leukemia inhibitory factor:Rolein human mesenchymal stem cells mediated immunosuppression.Cell Immunol,2008,253(1-2),p:16-22.;Duluc D,Delneste Y,Tan F,et al.Tumor-associated leukemiainhibitory factor and IL-6skew monocyte differentiation into tumor-associatedmacrophage-like cells.Blood,2007,110(13),p:4319-30.),将在免疫相关疾病的治疗中扮演重要角色。
依上述可见,由于具有良好的诊断和治疗价值,随着研究和开发的不断进展,huLIF的需求量将会大幅提高。研究制备出大量纯度高、活性好的huLIF是加快huLIF的研究及其应用的基础。然而,目前我国应用的人白血病抑制因子主要依赖于国外进口,价格昂贵,供应不足,无法满足将来潜在的大规模临床应用。因此,建立一种能够高效、简便并且廉价的生产纯度高、活性好的huLIF的技术方法非常必需,具有重要的实用价值和经济效益。
二、人白血病抑制因子的分子结构及生物学功能
编码huLIF的基因位于人第22号染色体上,由三个外显子和两个内含子组成(Sutherland GR,Baker E,Hyland VJ,et al.The gene for human leukemiainhibitory factor(LIF)maps to 22ql2.Leukemia,1989,3(1),p:9-13.),经转录、剪切、翻译和修饰的过程,分泌表达约为38-67kDa大小的糖蛋白。其中,huLIF所包括的核心蛋白为去除了N-端信号肽的由180个氨基酸残基组成的成熟多肽链(GenBank:AAA51699.1),分子量约为20kDa。huLIF的核心蛋白与mLIF(GenBank:AAA37211.1)在氨基酸组成有近80%的同源性,其生物学活性具有种属向下兼容的特征。与同属于白介素-6(Interleukin-6,IL-6)家族的其他细胞因子(包括IL-6、IL-11、OSM、CNTF和CT-1等)相同,huLIF的多种生物学功能是通过与细胞表面特异的受体相结合而实现的(Ni shimoto N,Ogata A,Shima Y,et al.Oncostatin M,leukemia inhibitory factor,and interleukin 6induce the proliferation of humanplasmacytoma cells via the common signal transducer,gp130.J Exp Med,1994,179(4),p:1343-7.;Zhang XG,Gu JJ,Lu ZY,et al.Ci l iary neurotropic factor,interleukin 11,leukemia inhibitory factor,and oncostat in M are growth factorsfor human myeloma cell lines using the interleukin 6signal transducer gp130.J Exp Med,1994,179(4),p:1337-42.)。LIF受体(LIF recptor,LIFR)复合物广泛分布在胚胎干细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、肝细胞、成骨细胞和神经细胞等效应细胞的细胞膜上,是由LIFR(也被成为LIFR-α或gp190)和gp130构成的异源二聚体复合物。当huLIF与细胞膜表面的跨膜LIFR-α识别并发生低亲和力结合之后,LIFR-α与细胞内的“转换器”分子gp130相互作用,而形成LIF亲和力结合的LIF-LIFR-gp130复合物,进而激活包JAK/STAT、MAPK、PI3K/AKt或SHP-2/Ras/ERK的多条细胞信号通路,并最终表现出其多样的生物学活性(Kondera-Anasz Z,Sikora JMielczarek-Palacz A.Leukemia inhibi tory factor:an important regulator ofendometrial function.Am J Reprod Immunol,2004,52(2),p:97-105.)。
对LIF的分子构效关系进行的相关性研究进一步揭示出:虽然在LIF核心蛋白多肽链中存在多个糖基化位点并且细胞产生的天然LIF确实为糖蛋白,但是脱去糖基的LIF蛋白在体内外仍然表现出相同的生物学活性(Aikawa J,Sato E,Kyuwa S,et al.Asparagine-linked glycosylation of the rat leukemia inhibitory factorexpressed by simian COS7cells.Biosci Biotechnol Biochem,1998,62(7),p:1318-25.;Sasai K,Aikawa J,Saburi S,et al.Functions of the N-glycans of ratleukemia inhibitory factor expressed in Chinese hamster ovary cells.J Biochem,1998,124(5),p:999-1003.),LIF蛋白糖基化与否并非其行使生物学功能的必要条件。与之相反,LIF核心蛋白多肽链是否能够有效的折叠形成由4个长链α-螺旋束构成的高级结构则是决定是否能够与LIFR识别、结合并表现出多样生物学活性的关键因素。因此,不具备糖基化修饰作用的原核表达系统非常适用于huLIF的高效重组生产,但如何保证和提高重组蛋白的可溶性表达则是此类制备技术的瓶颈。
三、人白血病抑制因子的制备技术概况
虽然机体内的多种细胞(包括神经元细胞、巨核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、肝细胞、成骨细胞、成肌细胞、肾细胞和胸腺上皮细胞等)均能表达huLIF,但是其生理性表达量很低,通过体外细胞培养直接分离纯化huLIF的生产能力远远无法满足日趋增大的研究和临床需求。因此,国内外均致力于采用基因工程策略重组表达huLIF。至今,huLIF已经在细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等多种表达体系中成功表达,但表达量仍不乐观。1995年,Samal等人(Samal BB,Arakawa T,Boone TC,et al.High level expression of human leukemia inhibitory factor(LIF)from asynthetic gene in Escherichia coliand the physical and biologicalcharacterization of the protein.Biochim Biophys Acta,1995,1260(1),p:27-34.)通过改造huLIF编码基因有效地提高了重组大肠杆菌对该细胞因子的表达能力。然而,令人失望的是,在缺乏有效的折叠辅助机制的原核系统中,过度表达的huLIF形成了无生物学活性的包涵体蛋白,最终导致生产步骤复杂(需要蛋白质复性操作),生产效率下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白及其在制备人白血病抑制因子中的应用。
本发明提供一种融合蛋白,自氮(N)末端至碳(C)末端依次包括Trx蛋白(TRX蛋白)、肠激酶特异识别位点和huLIF成熟核心蛋白;所述肠激酶特异识别位点的碳末端与所述huLIF成熟核心蛋白的氮末端连接;所述Trx蛋白如序列表的序列1自氮末端第1至110位氨基酸残基所示;所述肠激酶特异识别位点如序列表的序列1自氮末端第152至156位氨基酸残基所示;所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸残基所示。
所述融合蛋白还可包括组氨酸标签;所述组氨酸标签位于所述Trx蛋白和所述肠激酶特异识别位点之间;所述组氨酸标签如序列表的序列1自N末端第117至122位氨基酸残基所示。
所述融合蛋白具体可为如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且含有所述huLIF成熟核心蛋白的由序列1衍生的蛋白质。
所述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述huLIF成熟核心蛋白的编码基因可如序列表的序列2自5’末端第469至1011位核苷酸所示(Samal等人进行改造的优化基因)。
所述肠激酶特异识别位点的编码基因可如序列表的序列2自5’末端第454至468位核苷酸所示。
所述融合蛋白的编码基因具体可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子:
(1)序列表中序列2所示的DNA分子;
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且可以表达所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子;
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且可以表达所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子。
含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在pET-32a(+)的BglII和SacI酶切位点之间插入序列表的序列3所示的DNA得到的重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*。
所述重组菌具体可为将所述重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到的重组菌。
所述融合蛋白,所述编码基因,所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种均可用于制备所述huLIF成熟核心蛋白。
本发明还保护一种制备huLIF成熟核心蛋白的方法,包括如下步骤:
(1)将所述重组菌进行诱导表达和纯化;
(2)用肠激酶处理步骤(1)得到的溶液,
(3)将步骤(2)得到的溶液进行纯化,得到huLIF成熟核心蛋白。
步骤(1)中,所述诱导表达优选为用L-D-乳糖(诱导剂)诱导表达10h。
步骤(1)中,所述纯化优选为进行所述诱导表达后,裂解菌体,取裂解上清依次进行亲和层析和阴离子交换层析。所述亲和层析包括如下步骤:①使用镍亲和纯化结合缓冲液(pH8.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度如下:20mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、20mmol/L Tri s-Cl,)充分平衡5ml的Hi sTrap FF crude预装层析柱(GEhealthcare,产品目录号为17-5286-02);②将50mL裂解上清上样,上样流速为0.5ml/min;③用镍亲和纯化结合缓冲液充分洗涤,洗涤流速为1ml/min;④用20mL洗脱液甲(pH8.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度如下:60mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、20mmol/L Tris-Cl)充分洗脱非特异性结合的杂质蛋白,洗脱流速为1ml/min;⑤用20mL洗脱液乙(pH8.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度如下:300mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl)洗脱目的融合蛋白,洗脱流速为1ml/min,收集自洗脱开始第1-6mL的洗脱液。所述阴离子交换层析包括如下步骤:①用起始缓冲液(20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)充分平衡1ml的HiTrap Q HP预装层析柱(购自GE Healthcare,产品目录号为17-1153-01,柱长为2.5cm,内径为0.75cm,凝胶介质为Q-sehparose high performance);②将2mL亲和层析收集的所述洗脱液脱盐处理后上样,上样流速为0.5ml/mi n;③用3mL所述起始缓冲液洗涤;④采用NaCl浓度范围为0mmol/L至500mmol/L的洗脱液进行线性梯度洗脱,起始洗脱液为所述起始缓冲液,终止洗脱液为含500mmol/L NaCl的缓冲液(pH8.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度如下:500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl),洗脱总体积为10mL,洗脱流速为0.5mL/min,收集自洗脱开始第6-9mL的洗脱液。
步骤(3)中,所述纯化优选包括如下步骤:将步骤(2)得到的溶液透析置换为起始缓冲液(pH7.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度为:20mmol/L NaCl、20mmol/LTris-Cl),然后进行阳离子交换层析;所述阳离子交换层析包括如下步骤:①用所述起始缓冲液充分平衡5ml的HiTrap SP HP预装层析柱(GE healthcare,产品目录号为17-1151-01,柱长为2.5cm,内径为0.75cm,凝胶介质为SP-sehparosehigh performance);②将2mL透析置换后的溶液上样,流速为0.5ml/min;③用5mL所述起始缓冲液洗涤,洗涤流速为1ml/mi n;④用3mL含500mmol/L NaCl的缓冲液(pH8.5,由水和溶质组成;溶质及其浓度如下:500mmol/L NaCl、20mmol/LTris-Cl)进行洗脱,洗脱流速为1ml/min,收集自洗脱开始第2-3mL的洗脱液,得到所述huLIF成熟核心蛋白。
本发明提供的含有重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*的工程菌,可以实现huLIF的可溶性高效表达,经过提取与分离纯化获得了高纯度的融合蛋白Trx-His6-Erk-huLIF。将融合蛋白Trx-His6-Erk-huLIF进行重组肠激酶室温消化和阳离子交换层析后,可以得到与天然huLIF相同免疫学和生物学性质的重组huLIF。每1L的工程菌培养体系可获得5mg重组huLIF。
硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)能够帮助重组huLIF蛋白二硫键折叠,并提高表达效率。LIF属于IL-6细胞因子家族,与同家族的其他细胞因子具有相对保守的空间折叠模式,在二硫键的帮助下,共同呈现出由4个长链α-螺旋束构成的高度同源的高级结构。可以预见,能够创造利于LIF二硫键形成的氧化-还原环境的Trx蛋白同样有望辅助其他高级结构同源的IL-6家族细胞因子的这确折叠,因此,本发明建立的huLIF高效可溶性表达策略将很有可能成为一种该族细胞因子的通用技术。
要制备重组huLIF蛋白(rhuLIF蛋白),需要将其从融合蛋白Trx-Hi s6-Erk-huLIF中有效地释放并分离出来。本发明中将肠激酶特异识别位点(D-D-D-D-K)与huLIF成熟核心蛋白N-端第一位氨基酸残基(Ser,S)紧接,该设计对于后续rhuLIF蛋白的释放及天然氨基酸序列的保留意义重大。肠激酶特异性识别的氨基酸残基序列与huLIF成熟核心蛋白N-端的直接连接并不影响肠激酶的切割效率,在室温下孵育20h以上就能够成功的将重组huLIF蛋白从融合蛋白中完全释放出来。通过蛋白酶的特异性加工最终可以释放氨基酸组成与天然huLIF完全相同的具有生物学活性的可溶性rhuLIF。
此外,由于huLIF(pI=9.28)具有比融合标签Trx-His6-Erk(pI=5.63)高得多的等电点。因此,能够简单快速的将释放的huLIF进行分离和回收。联想到IL-6家族的IL-11(pI>11)、OSM(pI>9)和CT-1(pI>9)等几个细胞因子不仅具有与huLIF同源的高级折叠形式而且具有相似的更等电点特征,这些细胞因子将很有望利用本研究建立的huLIF高效可溶性表达方案和分离纯化工艺获得高效率的制备。
本研究利用Trx作为融合伙伴,在兼顾高效表达的同时,成功地解决了原核表达huLIF时易形成无活性包涵体的瓶颈问题,并通过巧妙引入的重组肠激酶识别位点,实现了N-端无多余氨基酸残基重组huLIF的生产。本发明为将来huLIF的工业生产、临床应用研究及以huLIF为靶标的新型疾病检测与诊断技术的开发奠定了基础。本发明有助于满足人白血病抑制因子(huLIF)日趋增大的临床应用需求,解决当前生产过程中存在的关键技术问题。
附图说明
图1为重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*的构建策略示意图。
图2为琼脂糖电泳检测PCR产物及菌落PCR验证;M:250bp DNA Ladder Marker(250,500,750,1000,1500,2250,3000,4500);1:PCR产物;2:菌落PCR产物。
图3为重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*的酶切鉴定;M:250bp DNA LadderMarker;1:重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*;2:pET-Trx-His6-Erk-huLIF*经XbaI和SacI双酶切产物;3:pET-Trx-His6-Erk-huLIF*经BglII和SacI双酶切产物。
图4为Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的同源性分析和结构模式示意图。
图5为采用不同诱导时间工程菌中融合蛋白的表达量;M:蛋白质分子量标准;1:未诱导;2-8分别为诱导2、4、6、8、10、12和14h。
图6为融合蛋白的可溶性表达;M:蛋白质分子量标准;1:BL21(DE3)诱导后菌体总蛋白;2:工程菌诱导后菌体总蛋白;3:工程菌诱导后菌体裂解沉淀;4:工程菌诱导后菌体裂解上清。
图7为12%SDS-PAGE检测目的融合蛋白的纯化情况蛋白质分子量标准,1为BL21(DE3)诱导后菌体总蛋白,2为工程菌诱导后菌体总蛋白,3为工程菌诱导后菌体裂解沉淀,4为工程菌诱导后菌体裂解上清,5为镍亲和柱层析的洗脱峰,6为阴离子交换柱层析的洗脱峰。
图8为融合蛋白的限制性肠激酶切割及huLIF的释放;M:蛋白质分子量标准;1:融合蛋白溶液;2-9依次为加入重组肠激酶后进行酶反应0、3、6、9、12、16、20和24h的酶切体系溶液。
图9为目的蛋白huLIF的分离纯化;M:蛋白质分子量标准;1:融合蛋白液;2:经过重组肠激酶加工的huLIF融合蛋白;3:huLIF蛋白液。
图10为融合蛋白与huLIF重组蛋白的Western-blot检测;M:预染蛋白质分子量标准;1:huLIF融合蛋白;2:huLIF重组蛋白。
图11为huLIF重组蛋白的生物学活性鉴定;实线代表吸光值,虚线代表抑制率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。亲和柱层析和离子交换柱层析都是在 100蛋白纯化工作站(GE healthcare)上完成。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。原核表达载体pET-32a(+)购自Novagen,产品目录号为69015-3。大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自Novagen,产品目录号为69386。M1细胞购自ATCC,产品目录号为TIB-192(ATCC编号)。
实施例1、重组质粒和工程菌的制备
重组质粒的构建过程见图1。
一、Erk-huLIF片段的编码DNA的制备
1、合成序列表的序列3自5’末端第16至558位核苷酸所示的DNA(huLIF片段的编码DNA,将huLIF成熟核心蛋白的编码基因优化后的DNA)。
2、以步骤1合成的DNA为模板,用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
引物1(F):5’-AAAGGATCCGGACGACGACGACAAGAGCCCGCTTCCAATTACTCC-3’;
引物2(R):5’-AAAGAGCTCCTATTAGAAGGCCTGAGCGAGAAC-3’。
引物1中引入BamHI酶切位点和紧邻huLIF成熟多肽N-末端首位氨基酸残基的肠激酶特异识别位点(Erk)的编码DNA;引物2引入SacI酶切位点。
PCR反应条件:94℃变性4min;94℃变性45sec,58℃退火45sec,72℃延伸45sec,共扩增30个循环;最后72℃延伸10min。
3、将PCR扩增产物进行1.7%琼脂糖电泳。
电泳图见图2的泳道1。从电泳图可见,PCR扩增产物大于500bp,与预期大小相符(预期为580bp左右,包括543bp的huLIF片段的编码DNA、15bp的肠激酶识别位点的编码DNA和限制性内切酶的编码序列及保护碱基)。
4、回收纯化PCR扩增产物。
5、将回收纯化的PCR扩增产物进行测序,测序结果表明PCR扩增产物的5’末端为末端保护碱基和BamHI酶切识别序列,3’末端为末端保护碱基和SacI酶切识别序列,上述两个酶切识别序列之间为序列表的序列3所示的Erk-huLIF片段的编码DNA(序列3自5’末端第1至15位核苷酸为Erk的编码DNA,第16至558位核苷酸为huLIF片段的编码DNA,其中第556至558位核苷酸为片段原有的终止密码子,第559至561位核苷酸为通过引物增加的终止密码子)。
二、重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*和工程菌的制备
1、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切步骤一回收纯化的PCR扩增产物,回收酶切片段。
2、用限制性内切酶BglII和SacI双酶切原核表达载体pET-32a(+),回收载体骨架。
3、将步骤1回收的酶切片段和步骤2回收的载体骨架连接后转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),筛选具有氨苄青霉素抗性的重组菌,进行菌落PCR(由上述引物1和引物2组成的引物对),并提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。
菌落PCR的结果见图2的泳道2。
质粒的双酶切鉴定结果见图3。质粒经Xba I和Sac I双酶切后可见大小约为1100bp和5300bp的两个片段,经BglII和Sac I双酶切后则现约480bp和5900bp的两个片段。
将质粒进行测序。结果表明,得到了重组质粒pET-Trx-Hi s6-Erk-huLIF*。
用GeneRunner和ClustalW软件分析测序结果显示:在N-端第一个氨基酸残基上游具有肠激酶特异性识别序列的huLIF片段的编码序列已成功克隆入表达载体的适当位置,未出现基因突变和移码。
重组质粒pET-Trx-Hi s6-Erk-huLIF*中,在骨架载体pET-32a(+)的BglII和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的DNA(Erk-huLIF片段的编码DNA),骨架载体上的TRX蛋白(Thioredoxin,硫氧还蛋白)的编码序列、His标签的编码序列和Erk-huLIF片段的编码DNA形成Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白的编码序列。
Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白如序列表的序列1所示,自N末端第1至110位氨基酸残基为TRX蛋白,第117至122位氨基酸残基为组氨酸标签(HHHHHH),第152至156位氨基酸残基为肠激酶特异识别位点(DDDDK),第157至336位氨基酸残基为huLIF蛋白。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白与天然huLIF蛋白(GenBank:AAA51699.1)的同源性比对见图4a。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的结构模式示意图见图4b。Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白利于人白血病抑制因子(huLIF)的可溶性表达、分离纯化及后续加工精制。
Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的编码序列如序列表的序列2所示,自5’末端第1至330位核苷酸为TRX蛋白的编码DNA,第349至366位核苷酸为组氨酸标签(HHHHHH)的编码DNA,第454至468位核苷酸为肠激酶特异识别位点(DDDDK),第469至1011位核苷酸为huLIF蛋白编码DNA,第1012至1014为氨基酸为增加的终止密码子。
将含有重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)命名为工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*。工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*在IPTG或乳糖的诱导下,重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*的T7启动子能够指导Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的高效表达。
实施例2、Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白的表达
一、诱导时间的优化
1、将实施例1制备的工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*接种于8ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃振荡培养过夜。
2、次日,将8ml菌液全部转接至400ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃200r/min振摇至OD600nm值达到0.6-0.8。
3、加入L-D-乳糖(诱导剂),使其终浓度为2mg/L,25℃180r/min诱导表达。
加诱导剂前取样菌体,分别于加入诱导剂后2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h取样菌体,进行12%SDS-PAGE,分析不同诱导时间下目的融合蛋白的表达情况。
电泳图见图5。结果显示:加入L-D-乳糖2h后,Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白开始表达,并且在10h后表达量达到峰值,该时间为高效生产的最佳收菌时间。
二、Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的表达形式
1、将实施例1制备的工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*(BL21(DE3)作为工程菌的对照)接种于8ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃振荡培养过夜。
2、次日,将8ml菌液全部转接至400ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃200r/min振摇至OD600nm值达到0.6-0.8。
3、加入L-D-乳糖(诱导剂),使其终浓度为2mg/L,25℃180r/min诱导表达10h。
4、4℃、5,000×g离心15min收集菌体,洗涤后每克湿菌重悬于10ml裂解缓冲液中,冰浴消化和超声破碎后,4℃、12,000r/min离心30min,分别收集上清(裂解上清)和沉淀(裂解沉淀)。
5、将经诱导表达的BL21细菌的菌体,工程菌的菌体,裂解上清和裂解沉淀分别进行12%SDS-PAGE检测,分析目的融合蛋白的可溶性表达情况。
电泳图见图6。结果显示:目的融合蛋白确实与预期相符,主要以可溶性形式表达,通过凝胶分析软件分析,表达的融合蛋白占可溶性总蛋白的22%。
三、Trx-His6-Erk-huLIF融合蛋白的表达和纯化
1、将实施例1制备的工程菌BL21/pET-Trx-His6-Erk-huLIF*(BL21(DE3)作为工程菌的对照)接种于48ml LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃振荡培养过夜。
2、次日,将48ml菌液全部转接至2.4L LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中,37℃200r/min振摇至OD600nm值达到0.6-0.8。
3、加入L-D-乳糖(诱导剂),使其终浓度为2mg/L,25℃180r/min诱导表达10h。
4、收集菌体,洗涤后重新充分悬浮于100ml裂解缓冲液(20mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl、10mg/ml溶菌酶、20mmol/L Tri s-Cl,pH8.5)中,经冰浴消化(冰浴40分钟)和超声破碎(输出功率150W,温度0~10℃,处理时间10min,每破碎15s,间歇30s)后,4℃、12,000r/min离心30min,分别收集上清(裂解上清)和沉淀(裂解沉淀)。上清即为粗蛋白液(获得100mL,蛋白质浓度为5.4mg/mL)。
5、将粗蛋白液进行亲和纯化(基于融合蛋白中部的组氨酸标签)
每次纯化50mL粗蛋白液,每次的纯化方法均如下:
(1)使用镍亲和纯化结合缓冲液(20mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/LTris-Cl,pH8.5)充分平衡5ml的HisTrap FF crude预装层析柱(GE healthcare,产品目录号为17-5286-02)。
(2)将粗蛋白液上样,上样流速为0.5ml/min。
(3)用镍亲和纯化结合缓冲液充分洗涤,洗涤流速为1ml/min。
(4)用20mL洗脱液甲(60mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)充分洗脱非特异性结合的杂质蛋白,洗脱流速为1ml/min。
(5)用20mL洗脱液乙(300mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)洗脱目的融合蛋白,洗脱流速为1ml/min,收集自洗脱开始第1-6mL的洗脱液。
将各次收集的洗脱液混合,透析除盐(透析液为20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)。
6、将脱盐处理后的溶液进行阴离子交换层析
HiTrap Q HP预装层析柱购自GE Healthcare,产品目录号为17-1153-01。柱长为2.5cm,内径为0.75cm。凝胶介质为Q-sehparose high performance。
每次纯化2mL,每次的纯化方法均如下:
(1)用起始缓冲液(20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)充分平衡1ml的HiTrap Q HP预装层析柱。
(2)将步骤5脱盐处理后的洗脱液上样,上样流速为0.5ml/min。
(3)用3mL起始缓冲液充分洗涤。
(4)用不含NaCl的缓冲液(20mmol/L Tri s-Cl,pH8.5)为起始洗脱液,用含500mmol/L NaCl的缓冲液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tri s-Cl,pH8.5)为终止洗脱液,进行盐浓度线性梯度洗脱,洗脱的盐浓度梯度范围为0mmol/L至500mmol/L,洗脱总体积为10mL,洗脱流速为0.5mL/min并收集自洗脱开始第6-9mL的洗脱液。
收集并合并目的洗脱液,混合即为融合蛋白液,-20℃保存、备用。
100mL裂解上清液可制备出67.8mg融合蛋白,回收率达57%。
7、将BL21(DE3)的菌体,诱导表达后工程菌的菌体、裂解上清、裂解沉淀、镍亲和柱层析的洗脱峰,阴离子交换柱层析的洗脱峰分别进行12%SDS-PAGE检测,结果见图7。凝胶分析表明,纯化蛋白的纯度高于95%。
实施例3、用Trx-Hi s6-Erk-huLIF融合蛋白制备人白血病抑制因子(huLIF)
一、酶切时间的优化
向2毫升实施例2制备的融合蛋白液中加入10微升重组肠激酶(购自Novagen,产品目录号为69066-3)(约含10单位肠激酶),室温孵育。
加入重组肠激酶前取样,分别于加入重组肠激酶0、3、6、9、12、16、20和24h小时后取样,进行12%SDS-PAGE检测,分析融合蛋白的水解及rhuLIF的释放情况,确定酶切反应的最佳时间。
电泳检测结果见图8。在室温孵育20小时后,融合蛋白能被重组肠激酶完全切割,且释放出约20kDa和17kDa的两个蛋白质片段,与huLIF和融合标签(Trx-His6-Erk)的理论分子量相符。结果表明,融合蛋白经过重组肠激酶的加工,可成功释放出游离的目的蛋白。
二、huLIF的制备
1、酶切
向2毫升实施例2制备的融合蛋白液中加入10微升重组肠激酶(购自Novagen,产品目录号为69066-3)(约含10单位肠激酶),室温孵育20小时。
2、通过透析将步骤1的酶切体系置换为起始缓冲液(20mmol/L NaCl、20mmol/LTri s-Cl,pH7.5)。
3、阳离子交换柱层析
HiTrap SP HP预装层析柱购自GE heal thcare,产品目录号为17-1151-01。柱长为2.5cm,内径为0.75cm。凝胶介质为SP-sehparose high performance。
根据huLIF的等电点(~9.28)远大于融合伙伴(Trx-His6-Erk,~5.36)的性质,利用阳离子交换柱层析精制huLIF。每次纯化2mL,具体步骤如下:
(1)用起始缓冲液(20mmol/L Tri s-Cl,pH8.5)充分平衡5ml的HiTrap SP HP预装层析柱。
(2)将步骤2的溶液上样,流速为0.5ml/min。
(3)用起始缓冲液充分洗涤5mL,洗涤流速为1ml/min。
(4)用3mL含500mmol/L NaCl的缓冲液(500mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-Cl,pH8.5)进行洗脱,洗脱流速为1ml/min,收集自洗脱开始第2-3mL的洗脱液。
(5)收集并合并目的洗脱液,采用透析法将huLIF蛋白置换于灭菌的PBS缓冲液(pH7.4)中,即为huLIF蛋白液,-20℃保存、备用。
将实施例2制备的融合蛋白液、重组肠激酶加工的融合蛋白液(步骤1的溶液)和huLIF蛋白液分别进行15%SDS-PAGE。电泳结果见图9。结果显示,经过HiTrap SPHP预装柱的分离,获得的纯度高于95%的huLIF。
利用BCA测定huLIF蛋白液的蛋白浓度,结果表明从每升诱导表达体系收集的工程菌菌体中,通过上述工艺可获得5mg的huLIF。
三、Western-blot鉴定
将实施例2制备的融合蛋白液和实施例3的步骤二制备的huLIF蛋白液分别进行12%SDS-PAGE,将电泳凝胶采用半干转印法转移至PVDF膜,以小鼠抗huLIF的单克隆抗体为一抗(1∶5,000稀释;购自R&D公司,产品目录号为MAB2501),以辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠IgG抗体为二抗(1∶10,000稀释;购自Pierce公司,产品目录号为32430),使用ECL显色试剂盒鉴定融合蛋白及huLIF蛋白的免疫学性质。
检测结果见图10。结果表明:融合蛋白及huLIF蛋白均能与市售的抗huLIF单克隆抗体发生特异性的免疫反应,经过ECL显色,在相应位置呈现杂交色带。
四、生物学活性(抑制小鼠髓样白血病M1细胞增殖)鉴定
mLIF在体外能够有效的抑制小鼠髓细胞样白血病(myeloid leukemia)M1细胞的增殖,由于huLIF具有生物学活性向下兼容的特性,具有mLIF相同的生物学活性,因此抑制M1细胞的增殖也被广泛的用于鉴定rhLIF的生物学活性。
1、首先使用含有5%FBS的RPMI-1640培养基体外培养M1细胞,并将生长状态良好的M1细胞以每孔1×104个细胞铺布于96孔细胞培养板中(背景孔用等体积含有5%FBS的RPMI-1640培养基代替M1细胞液,设置3个复孔)。
2、以线性浓度梯度加入0.1pg/ml~10ng/ml的步骤三制备的huLIF蛋白液,每个浓度做5个平行复孔,于37℃,5%CO2的条件孵育72h(对照孔用等体积pH7.4PBS缓冲液代替huLIF蛋白液,设置3个复孔)。
3、利用改良MTT检测法测定M1细胞的增殖情况,主要步骤为:向每个细胞培养孔中加入20μl的5mg/ml的MTT溶液,37℃5%CO2孵育4h;向每孔中加入150μl的“三联液”(10%SDS、5%异丙醇和12mol/ml HCl)孵育16h;利用酶标仪测定OD570nm,并根据以下计算公式计算huLIF对M1细胞增殖的抑制率:抑制率=(OD570nm样品平均值-OD570nm背景平均值)/(OD570nm对照平均值-OD570nm背景平均值)×100%;
各个浓度的吸光值与抑制率结果见图11。可见huLIF确实能够有效的抑制M1细胞的增殖。
4、根据抑制率计算ED50(细胞因子的半数有效量)
ED50(细胞因子的半数有效量)是指抑制M1细胞增殖的抑制率达到50%时,加入huLIF的终浓度。
huLIF蛋白液的ED50值达到5ng/mL。
5、细胞因子比活性
细胞因子比活力(U/mg)=ED50(ng/mL)/1×10-6。
huLIF蛋白液的细胞因子比活性约为0.5×107U/mg。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,自氮末端至碳末端依次包括Trx蛋白、肠激酶特异识别位点和huLIF成熟核心蛋白;所述肠激酶特异识别位点的碳末端与所述huLIF成熟核心蛋白的氮末端连接;所述Trx蛋白如序列表的序列1自氮末端第1至110位氨基酸残基所示;所述肠激酶特异识别位点如序列表的序列1自氮末端第152至156位氨基酸残基所示;所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸残基所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白还包括组氨酸标签;所述组氨酸标签位于所述Trx蛋白和所述肠激酶特异识别位点之间;所述组氨酸标签如序列表的序列1自氮末端第117至122位氨基酸残基所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白为如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且含有所述huLIF成熟核心蛋白的由序列1衍生的蛋白质。
4.权利要求1至3中任一所述融合蛋白的编码基因。
5.如权利要求4所述的编码基因,其特征在于:所述huLIF成熟核心蛋白的编码基因如序列表的序列2自5’末端第469至1011位核苷酸所示;所述肠激酶特异识别位点的编码基因如序列表的序列2自5’末端第454至468位核苷酸所示。
6.如权利要求5所述的编码基因,其特征在于:所述融合蛋白的编码基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子:
(1)序列表中序列2所示的DNA分子;
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且可以表达所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子;
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且可以表达所述huLIF成熟核心蛋白的DNA分子。
7.含有权利要求4至6中任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.如权利要求7所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体为在pET-32a(+)的BglII和SacI酶切位点之间插入序列表的序列3所示的DNA得到的重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*;所述重组菌为将所述重组质粒pET-Trx-His6-Erk-huLIF*导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)得到的重组菌。
9.权利要求1至3中任一所述融合蛋白、权利要求4至6中任一所述编码基因,权利要求7或8所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在制备huLIF成熟核心蛋白中的应用;所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸残基所示。
10.一种制备huLIF成熟核心蛋白的方法,包括如下步骤:
(1)将权利要求8所述重组菌进行诱导表达和纯化;
(2)用肠激酶处理步骤(1)得到的溶液,
(3)将步骤(2)得到的溶液进行纯化,得到huLIF成熟核心蛋白;所述huLIF成熟核心蛋白如序列表的序列1自氮末端第157至336位氨基酸残基所示。
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