CN102475750B - 一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物及其制备方法与应用。该中药提取物是从大黄、马齿苋和丁香组成的中药组合物中提取得到的；所述中药组合物中大黄、马齿苋和丁香的质量比为30-60∶20-50∶10-30。制备方法如下：将大黄、马齿苋和丁香按照比例混合，加水，煮沸提取，提取结束后冷却，过滤、离心，抽滤，取上清液，得到所述中药提取物。本发明提供的中药提取物的提取分离方法简便，所得产品纯度较高，产品质量有了很大的改进。功能测试结果表明，该提取物具有较强的抑制基质金属蛋白酶的能力，同时具有延缓皮肤衰老、改善皮肤粗糙度的功效。

Description

一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物及其制备方法与应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMPs)是一类生物活性依赖于锌离子、有降解细胞外基质(Extra-Cellar Matrix，ECM)能力的内肽酶家族。MMPs的主要作用是降解真皮中的胶原蛋白及弹性蛋白，MMPs分泌增加可使细胞内胶原蛋白降解增加，造成皮肤中胶原蛋白流失，皮肤松弛，弹性下降，细纹增多且不断加深，使皮肤呈现出衰老的迹象。

基于MMP-1在皮肤衰老过程中的重要作用，人们逐渐将抑制MMP-1活性，抑制异常的胶原降解，减少皮肤炎症反应及防止皮肤光老化产生的皱纹，做为延缓衰老的新途径。

随着衰老研究的深入，研究者们对衰老的认识越来越全面，通过研究MMP-1降解ECM，胶原蛋白被分解流失的机理，揭示出MMP-1的过度表达是导致皮肤衰老的重要原因之一。筛选MMP-1抑制剂并利用其解决皮肤衰老的问题，将是以后延缓衰老研究的新途径。同时，人们对抗皱、抗氧化等活性成分的安全性也越来越重视，如何从天然植物中筛选MMP-1抑制成分，得到安全高效的延缓衰老功效成分是今后研究的重点和方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物及其制备方法。

本发明所提供的中药提取物是从大黄、马齿苋和丁香组成的中药组合物中提取得到的；所述中药组合物中大黄、马齿苋和丁香的质量比为30-60∶20-50∶10-30。

所述中药组合物中大黄、马齿苋和丁香的质量比可进一步为40-60∶25-35∶15-25。

所述中药提取物的制备方法如下：

将大黄、马齿苋和丁香按照上述质量比混合，得到中药组合物；向所述中药组合物加水，煮沸提取，得到所述中药提取物。

所述提取过程中，中药组合物与水的质量比可为1∶(10-15)，优选为1∶10；所述煮沸提取的时间可为45-60分钟，优选60分钟。

本发明的方法还包括下述纯化步骤：提取结束后，冷却、过滤、离心、收集上清液，所述上清液即为纯化后的中药提取物。

此外，还可对所述上清液进行抽滤，进一步除去其中的不溶性杂质。

在纯化步骤中，所述冷却的终温度可为45-50℃，优选50℃。所述过滤采用纱布进行过滤，所述纱布为100-200目，优选200目。所述离心的离心转速可为4000-5000r/min，优选为4000r/min；离心的时间可为10-15分钟，优选10分钟。所述抽滤中采用助滤剂硅藻土进行抽滤。

本发明的再一个目的是提供上述中药提取物的应用。

本发明所提供的中药提取物的应用是其在制备具有基质金属蛋白酶抑制功效的产品中的应用；或在制备化妆品中的应用，尤其是在制备具有基质金属蛋白酶抑制功效的化妆品中的应用。

含有本发明中药提取物的化妆品以及含有该中药提取物的组合物也属于本发明的保护范围。

本发明提供的制备中药提取物的方法，不需要有机试剂，提取分离方法简便，所得产品纯度较高，产品质量有了很大的改进。对本发明得到的中药提取物进行功能测试，结果表明该提取物具有较强的抑制基质金属蛋白酶的能力，同时具有延缓皮肤衰老、改善皮肤粗糙度的功效。故本发明得到的提取物可作为基质金属蛋白酶抑制剂，在制备化妆品中，尤其是制备具有基质金属蛋白酶抑制功效的化妆品，具有广泛应用。

附图说明

图1为本发明提供的中药提取物的生产工艺流程图；

图2为不同浓度的中药提取物对基质金属蛋白酶抑制率的比较图；

图3为中药提取物对皮肤粗糙度降低率比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备中药提取物

中药提取物的生产工艺流程图如图1所示，具体过程如下：

取料液比1∶10，即100g丁香、大黄和马齿苋的混合物，其中丁香50克，大黄30克，马齿苋20克，之后加入1000mL去离子水；煮沸60min(加盖保鲜膜，减少蒸发)；停止加热，水循环冷却到50℃，200目纱布粗滤；4000r/min的转速下离心10分钟，取上清液；真空硅藻土滤饼抽滤，所得滤液即为中药提取物(提取物质量浓度记为100％)；之后95℃保温30分钟，水浴降温至50℃，加入0.6％LGP液体防腐剂(全称为LIQUID GERMALL PLUS，购自ISP国际特品有限公司)，得到产品。之后根据需要，可进行后续操作，如洗桶，消毒，灌装，装箱，打码，入库。

实施例2、制备中药提取物

中药提取物的生产工艺流程同实施例1，具体过程如下：

取料液比1∶15，即100g丁香、大黄和马齿苋的混合物，其中丁香40克，大黄35克，马齿苋25克，之后加入1500mL去离子水；煮沸45min(加盖保鲜膜，减少蒸发)；停止加热，水循环冷却到50℃，200目纱布粗滤；5000r/min的转速下离心10分钟，取上清液；真空硅藻土滤饼抽滤，所得滤液，即为中药提取物溶液(提取物质量浓度记为100％)；之后95℃保温30分钟，水浴降温至50℃，加入0.6％LGP液体防腐剂(全称为LIQUID GERMALL PLUS，购自ISP国际特品有限公司)，得到产品。之后根据需要，可进行后续操作，如洗桶，消毒，灌装，装箱，打码，入库。

实施例3、制备中药提取物

中药提取物的生产工艺流程同实施例1，具体过程如下：

取料液比1∶12，即100g丁香、大黄和马齿苋的混合物，其中丁香60克，大黄25克，马齿苋15克，之后加入1200mL去离子水；煮沸55min(加盖保鲜膜，减少蒸发)；停止加热，水循环冷却到50℃，200目纱布粗滤；4000r/min的转速下离心10分钟，取上清液；真空硅藻土滤饼抽滤，所得滤液，即为中药提取物溶液(提取物质量浓度记为100％)；之后95℃保温30分钟，水浴降温至50℃，加入0.6％LGP液体防腐剂，得到产品。之后根据需要，可进行后续操作，如洗桶，消毒，灌装，装箱，打码，入库。

实施例4、中药提取物的功能测定试验

下述试验中所用的中药提取物溶液，即为实施例1制备得到的浓度记为100％的中药提取物，其它浓度的提取物是将该溶液进行相应稀释得到的。

1、抑制基质金属蛋白酶活性能力的测定

该抑制基质金属蛋白酶能力测定方法按照如下文献中提供的方法进行：张红梅.基质金属蛋白酶抑制剂筛选方法的研究与应用[学位论文].山东：山东大学，2005。

实验方法：

以最优实验条件建立MMP-1酶反应实验平台，以这个平台为基础，在不破坏酶反应体系的前提下，加入中药提取物溶液，通过酶反应体系检测产物荧光强度的变化，间接反映酶活力的变化，从而反映该中药提取物对MMP-1活性的影响作用。

(1)试剂配制：

配制缓冲液(50mmol/L HEPES，0.12mol/L NaCl，10mmol/L CaCl2，20μmol/LZnSO4，0.05％Brij-35，pH＝7.5)；将MMP-1酶原用缓冲液梯度稀释至0.22μg/100μL备用；将荧光底物DQ-gelatin用缓冲液梯度稀释至0.20μg/100μL备用；在1L的0.1mol/L NaOH溶液中加入30mmol的酶原激活剂APMA，形成APMA储备液(30mmol/L)备用；将本发明的中药提取物配制成一定浓度的溶液备用；将MMP-1酶原溶液(0.22μg/100μL)和APMA溶液(30mmol/L)按10∶1的体积比(MMP∶APMA)混合，在37℃孵育45min活化。

(2)加样：

取活化后的MMP-1溶液(浓度已降为0.20μg/100μL)40μL加入96孔酶标板中，再加入待测中药提取物溶液8μL，荧光底物DQ-gelatin溶液(0.20μg/100μL)52μL，使最终反应体系为100μL；将完成加样的96孔酶标板放入37℃培养箱中恒温孵育600s。实验过程加样比例见表1

表1体外抑制MMP-1实验加样表

(3)实验结果检测

反应前在激发波长为460nm，发射波长为520nm的检测条件下检测待测中药提取物的荧光强度；反应体系停止孵育后立即用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪检测整个反应体系的荧光强度，激发波长为460nm，发射波长为520nm。

(4)实验数据处理

MMP-1抑制百分数(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

A₁-代表添加中药功效成分抑制组的荧光强度

A₂-代表待测中药功效成分自身的荧光强度

A₀-代表空白对照组的荧光强度

抑制百分数越大表示该中药功效成分对MMP-1的活性抑制效果越显著。

实验结果见图2。由图2可知，中药提取物浓度在0.09％时抑制率达60％以上，抑制率且随着浓度的增加而增加。说明本发明提供的中药提取物具有非常强的基质金属蛋白酶抑制能力。

2、皮肤粗糙度相对降低率的测定

纹理度值是经检测计算后得出的一个比值，单位为1。纹理度值越大表明皮肤的皱纹越多，皱纹的深度越大。从使用化妆品前后皮肤的纹理度变化来衡量皮肤皱纹的改善程度，从而评价延缓衰老功效化妆品对皮肤的去皱抗皱作用。

实验方法：

分别在每位志愿者的左、右手臂内侧划定区域标记受测部位(4cm×4cm)，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm，测试样品和空白对照均随机分布在左右手臂上。由技术人员使用MicroSkinII多功能皮肤图像分析系统测定实验部位涂抹样品前的皮肤纹理度。每天早晚在样品测试区域使用含有中药提取物成分的啫喱，空白区域不使用任何样品，每个受测部位涂抹32mg样品，每天涂抹两次，早9点和晚8点各一次，实验期间，志愿者在实验部位不能涂抹任何其他化妆品。连续使用化妆品一周、两周、三周和四周后，每周同一时间志愿者将涂抹部位用清水洗净，由测试者使用MicroSkin II多功能皮肤图像分析系统测定涂抹部位皮肤纹理度。同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成，以减小误差。统计志愿者实验部位每次测得的数值，用SPSS系统进行t检验，分析皮肤纹理度变化规律。

皮肤粗糙度降低率计算方法：

降低率＝(样品组数据T_n-起始值T₀)/起始值T₀

实验结果如图3所示。根据人体皮肤纹理度测试结果表明，质量浓度为5％的中药提取物啫喱对皮肤粗糙度降低能力随使用时间增加而增强，验证了人体皮肤纹理度测试结果与该提取物体外抑制MMP-1实验结果具有一致性。证明本发明的中药组合物提取液具有较强的抑制基质金属蛋白酶，降低皮肤粗糙度的功效，可以用于制备化妆品，尤其是用来制备具有基质金属蛋白酶抑制功效的化妆品。

Claims (8)

1.一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物，是从大黄、马齿苋和丁香组成的中药组合物中提取得到的；所述中药组合物中大黄、马齿苋和丁香的质量比为40-60：25-35：15-25。

2.一种制备权利要求1所述具有基质金属蛋白酶抑制功效的中药提取物的方法，包括下述步骤：将大黄、马齿苋和丁香按照权利要求1所述的质量比混合，得到中药组合物；向所述中药组合物加水，煮沸提取，得到所述中药提取物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述中药组合物与加入的水的质量比为1：（10-15）；所述煮沸提取的时间为45-60分钟。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括下述的步骤：提取结束后，冷却、过滤、离心、收集上清液，对所述上清液进行抽滤，收集抽滤液即为纯化后的中药提取物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述冷却的终温度为45-50℃，；所述过滤采用纱布进行过滤，所述纱布为100-200目；所述离心的转速为4000-5000r/min，离心的时间为10-15分钟；所述抽滤中采用助滤剂硅藻土进行抽滤。

6.权利要求1所述的中药提取物在制备具有基质金属蛋白酶抑制功效的产品中的应用。

7.权利要求1所述的中药提取物在制备化妆品中的应用。

8.一种具有基质金属蛋白酶抑制功效的化妆品，其特征在于：所述化妆品含有权利要求1所述的中药提取物。

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