CN102475711B

CN102475711B - 丁香苦苷制药新用途

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Publication number: CN102475711B
Application number: CN2010105665963A
Authority: CN
Inventors: 李永吉; 吕邵娃; 王艳艳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102475711A

Abstract

本发明的目的在于公开一种化合物的新制药用途，即丁香苦苷在制备治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等治疗乙型肝炎药物、肝损伤药物中的新制药用途。本发明公开了丁香苦苷对乙型肝炎病毒复制的抑制作用、对肝功能的改善作用、对肝脏病理改变的恢复作用以及抗肝损伤等作用。

Description

丁香苦苷制药新用途

发明领域

本发明涉及一种化合物的新制药用途，特别涉及丁香苦苷的新制药用途。

背景技术

丁香叶(Folium syringae)来源于木犀科丁香属植物的干燥叶，是一种具有广谱抗菌、抗病毒、免疫增强、抗耐药性作用的中药，以其为原料生产的胶囊、片剂治疗急性黄疸性肝炎、痢疾，均收到较好疗效。丁香苦苷(见图1)为环烯醚萜苷类化合物，为从丁香叶中分离出的单体化合物，是丁香叶发挥抗菌作用的主要有效成分之一。因此进一步研究丁香苦苷单体的活性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于公开一种化合物的新制药用途，特别涉及丁香苦苷的新制药用途。

丁香苦苷是一种具有药物活性的物质，因此，可以按照常规的制剂方法，将其制备成临床上可适用的任何一种药剂，例如，片剂、胶囊剂、注射剂、口服液体制剂、颗粒剂等。

在制备上述制剂的过程当中，可以将丁香苦苷与任何一种适用于制备成临床药剂的赋形剂混合使用，制备成药物制剂。

对本发明药物丁香苦苷抗乙肝病毒的实验研究，结果表明丁香苦苷在体内具有抗乙肝病毒的作用和对于DHBV引起的肝损伤具有保护作用。本发明药物丁香苦苷对CCL₄致小鼠急性肝损伤、CCL₄致大鼠慢性肝损伤的实验研究，结果表明丁香苦苷具有保肝、降酶、降低肝纤维化程度等抗肝损伤的综合作用。

附图说明

图1是丁香苦苷结构图

图2是荧光定量PCR的标准曲线图

图3是治疗前鸭肝脏病理切片图

图4是治疗后拉米夫定组鸭肝脏病理切片图

图5是治疗后丁香苦苷高剂量组鸭肝脏病理切片图

下述实验例用于进一步说明本发明：

实验例1丁香苦苷抗鸭乙肝病毒的实验研究

1材料与方法

1.1实验动物

同日孵化2日龄浙江麻鸭120只，购自浙江缙云县孵化场，雌雄不分，体重(40-50)g。

1.2主要试剂与主要仪器

PCR RealSYBR Misture试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。根据Genbank中DHBV-DNA序列，用Primer5软件设计引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成，上游引物：5’-GCA ATC ACT AGA CCA ATCCA-3’；下游引物：5’-GAG ATC TAT GGT GGC TGC TC-3’；目的产物211bp。多功能DNA纯化回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；ALT和AST试剂盒(南京建成生物研究所)；荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；微量移液器(大龙合资)；MP2000电子天平(上海第二天平仪器厂)。

1.3主要药物

丁香苦苷(自制，经面积归一化法计算含量＞95％)；拉米夫定，由苏州葛兰素史克生产，含量：一片0.1g。

1.4动物模型的建立

采用荧光定量PCR筛选先天感染DHBV雏鸭，120只2日龄鸭雏适应性饲养4天后，分别在腿胫静脉抽血0.1-0.2mL静脉血，对应编号后用10000r/min离心5min，取上游血清。取40μL血清，加入20μL辛酸钠，在99℃加热10min，然后10000r/min离心5min，取上清液进行荧光定量PCR检测，筛选出D-HBV阳性鸭子。

1.5荧光定量PCR反应体系

PCR反应体系为25μL.按下列组成配制PCR反应液：SYBR Misture12.5μL，上游引物1.25μL，下游引物1.25μL，血清提取物2.5μL，灭菌双蒸水7.5μL，总反应体系25μL。PGR反应条件：采用两步PCR法：95℃起始模板预变性30s、95℃PCR循环中模板变性10s、60℃退火/延伸30s；共40个循环；每个待测样本同时检测3管，取平均值作代表值。实验条件设置、荧光信号检查、数据读取和分析均由Bio-RadIQ5软件完成。以阳性标准品的对数值通过标准曲线的绝对定量读取样品初始拷贝数。

1.6阳性标准品的制备及标准曲线的建立

从阳性血清中提取DHBV DNA，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实为片段长度211bp的扩增目标产物，凝胶切割、回收并纯化(多功能DNA纯化回收试剂盒)，纯化的DHBV DNA片段再次扩增、回收、纯化，紫外分光光度计定量。取回收产物进行10倍梯度稀释，以稀释样品作为标准样本模板进行FQ-PCR检测，每个样品3个重复，建立标准曲线。

1.7动物分组与给药

筛选出的DHBV阳性麻鸭30只(雌雄不分)，体重40-50g，按随机数字表法随机分成5组，分别为空白对照组、拉米夫定组、丁香苦苷高、中、低剂量组，每组6只。空白对照组给予常规普通饲料，自由饮水；拉米夫定组将拉米夫定研碎溶解于生理盐水，按20mg/kg进行腹腔注射给药，每天1次；丁香苦苷低、中、高组分别为10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg进行腹腔注射给药，每天1次；每周复测体重一次，调整给药量。连续给药15天后停药观察5天。在用药前、用药第5天、第10天、第15天及停药后第5天从腿胫静脉抽取0.3～0.5mL静脉血，10,000r/min离心5min，取上游血清，-20℃保存待检，用荧光定量PCR检测各个血清的DHBV DNA的含量。

1.8病理学观察

用药前剖杀D-HBV阳性雏鸭2只，停药第5天剖杀丁香苦苷高剂量组和拉米夫定组鸭子各2只，对肝脏组织进行常规HE染色。

1.9肝功能检查

各组于用药第15天、停药后5天分别检测血清中天冬氨酸转氨酶(AST)水平及丙氨酸转氨酶(ALT)。取实验血清样本，参照AST、ALT试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计检测。

1.10数据处理

所有数据用平均数±标准差(X±S)表示；各治疗组的疗效比较用重复测量数据的方差分析；各时间点组间比较用单因素方差分析；所有数据用SPSS10.0软件处理。

2结果

2.1PCR筛选出DHBV阳性鸭子：

120只鸭子筛选出32只DHBV阳性鸭子，阳性率为26.7％。

2.2阳性标准品的标准曲线

对阳性标准品进行10倍梯度稀释后，用FQ-PCR对系列稀释样品进行检测，出现典型的扩增曲线，5个点具有极好的线性关系，斜率为-3.321，相关系数为0.988，表明基本上无抑制PCR反应的因素存在，所以在此范围内所测定的Ct值能准确地反映DHBV DNA的数量。以系列稀释样品的临界循环次数(Ct值)为纵坐标，以各管拷贝数的对数为横坐标，以获得标准曲线(见图2)。

2.3各组药物对血清DHBV DNA水平的影响

治疗过程中各组DHBV DNA水平变化情况：各组治疗前病毒载量差别无显著性意义，具有可比性。

拉米夫定组：用药后血清DHBV DNA含量在用药第5天就开始明显下降，第10天时就可以下降到较低水平，与用药前比较有显著性差异(P＜0.05)，停药后5天DHBV DNA含量回升至用药前水平，与同时间点空白对照组比较无显著性差异。

空白对照组：血清DHBV DNA含量一直维持在一个较高水平。

丁香苦苷组：与空白对照组相比，丁香苦苷高、中剂量组服药后第10天起效，在第15天DHBV DNA含量明显下降(P＜0.05)，停药后5天DHBV DNA含量维持在相对较低水平，有持续抑制病毒复制的趋势。而丁香苦苷低剂量组在用药期间对病毒的抑制作用不明显。(如表1-1)

表1-1 各组用药前后血清DHBV DNA含量

与空白对照组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01

2.4鸭血清生化检测结果

拉米夫定组：与空白对照组相比，用药第15天拉米夫定组的ALT和AST水平都明显下降，但是停药5天后有再度升高的趋势。

空白对照组：用药第15天和停药后5天，空白对照组的ALT和AST水平都相对很高。

丁香苦苷组：与空白对照组相比，丁香苦苷高、中剂量组的ALT和AST水平都明显下降，下降的程度与给药剂量相关。停药5天以后各组ALT和AST水平未出现明显的反跳现象。低剂量组作用不明显。(如表1-2)

表1-2 用药第15天和停药5天血清转氨酶水平

与空白对照组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01

2.5治疗前后肝脏组织病理变化

治疗前HE染色可见肝细胞有点、灶状坏死，炎性细胞浸润，周边部分肝脏细胞肿胀，气球样变性；治疗后拉米夫定组、丁香苦苷高剂量组的炎症都有不同程度的减轻，点、灶状坏死及变性肝细胞减少；丁香苦苷组改善较拉米夫定组明显。治疗前如图3，治疗后拉米夫定组如图4，丁香苦苷高剂量组如图5。

3讨论

目前，鸭乙型肝炎病毒动物模型是卫生部规定的新药抗乙型肝炎病毒药效学评价的唯一动物模型。鸭乙型肝炎病毒与人类乙型肝炎病毒同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态、基因组结构及复制方式上有相似之处。先天感染的雏鸭可发展成持续性DHBV感染，其病毒血症持续时间较长且较稳定，无明显的自然转阴现象，是研究人类乙型肝炎发病机制，病毒复制过程及筛选有效治疗药物的理想动物模型。

本实验采用了快速、准确的荧光定量PCR(FQ-PCR)技术，检测丁香苦苷对浙江麻鸭血清中DHBV-DNA含量变化的影响。FQ-PCR是一种简单、敏感、特异、准确的检测DHBV的好方法，是目前国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法。实验证实了丁香苦苷具有显著的抗鸭乙型肝炎病毒作用，对感染鸭的肝脏病理损害也有一定的改善作用。拉米夫定抑制DHBV-DNA起效很快，但停药后病毒含量又立即回升；丁香苦苷起效相对较慢，但停药后仍有一定的抑制作用，抑制病毒的作用较平稳持久，提示其在体内抑制病毒DNA的机制可能与拉米夫定有所不同。

实验例2 丁香苦苷对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响

1实验材料

1.1实验药物

丁香苦苷(自制，经面积归一化法计算含量＞95％)；阳性对照药：肝加欣片(中国吉林通化方大药业有限公司)。

1.2实验试剂：

丙氨酸氨基转移酶液体试剂盒(上海长征公司生产)；草氨酸氨基转移酶液体试剂盒(上海长征公司生产)；精密试纸(上海试剂三厂生产)；四氯化碳(上海试剂三厂生产)。

1.3实验仪器：

Lisa300全自动生化分析仪(法国)；莱卡2135轮转式切片机(德国莱卡公司生产)；722型光栅分光光度计(山东高密仪器厂生产)；LXJ-II低速离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.4实验动物昆明种小鼠，18～22g，雌雄各半；由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2实验方法

2.1分组与给药

昆明种小鼠72只，体重在18～22g之间，雌雄各半，分为6组：正常对照组、模型对照组、肝加欣组、丁香苦苷高、中、低剂量组。正常对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水，肝加欣组按给药量545mg/kg进行灌胃给药，每天1次；丁香苦苷低、中、高组分别为10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg进行灌胃给药，每天1次；连续给药7天，于第6天晚间11点禁食，于第7天早6点灌胃给药，2小时后造模。

2.2造模方法

除空白对照组外，其余各组腹腔注射0.15％四氯化碳豆油溶液0.2ml/10g体重，禁食10小时之后摘眼球取血，离心后取血清，-20℃保存待检。

2.3生化检测及病理学观察

取上述离心血清测定ALT、AST水平；将动物处死，取肝脏组织用10％甲醛固定，做病理组织学检查。

3实验结果

3.1血清生化检测结果

(1)对血清ALT来说，与模型对照组相比，各给药组血清ALT水平都明显下降(P＜0.05)，肝加欣组下降最多，丁香苦苷高、中、低剂量组表现出剂量越大，ALT水平下降越多，有剂量依赖性。

(2)对血清AST来说，与模型对照组相比，各给药组血清AST水平都明显下降(P＜0.05)，肝加欣组下降最多，丁香苦苷高、中、低剂量组表现出剂量越大，AST水平下降越多，有剂量依赖性。(如表2-1)

表2-1 各组对CCL₄致急性肝损伤的影响

注：与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

3.2病理组织检查结果

与模型对照组相比，各给药组的肝细胞均有不同程度的恢复，不同程度地减轻肝细胞的变性坏死程度，减轻炎症反应，但各给药组之间差别并不特别明显。

4结论

(1)丁香苦苷能降低CCL₄致小鼠急性肝损伤引起的ALT、AST升高，作用强弱与给药剂量有相关性。

(2)丁香苦苷对于CCL₄致小鼠急性肝损伤引起的肝脏组织病理变化具有一定的改善作用。

实验例3 丁香苦苷对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响

1实验材料

1.1实验药物

1.2实验试剂：

丙氨酸氨基转移酶液体试剂盒(上海长征公司生产)；草氨酸氨基转移酶液体试剂盒(上海长征公司生产)；精密试纸(上海试剂三厂生产)；白蛋白试剂盒(上海长征公司生产)；经脯氨酸试剂盒(南京建成生物制品有限公司生产)；四氯化碳(上海试剂三厂生产)。

1.3实验仪器：

1.4实验动物

Wistar大鼠，120～150g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2实验方法

2.1分组

取Wistar种大鼠60只，体重在120～150g之间，雌雄各半。分为6组：正常对照组、模型对照组、肝加欣组、丁香苦苷高、中、低剂量组。

2.2造模与给药

造模方法：除正常对照组之外，其余各组用30％CCL₄豆油溶液灌胃，每周二次，连续三个月。同时除正常对照组和模型对照组之外，各组灌胃给药：肝加欣组给药剂量为390mg/kg，丁香苦苷低、中、高组分别为10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg进行灌胃给药；每天一次；正常对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水，连续给药三个月，三个月后禁食24小时，将动物摘眼球取血，离心后取血清，-20℃保存待检。

2.3生化检测及病理学观察

取上述血清检测血清中的ALT、AST、TP、ALB的浓度。将动物处死，取肝脏组织用10％甲醛固定，做病理组织学检查(HE染色)。

3结果

3.1ALT和AST结果

(2)对血清AST来说，与模型对照组相比，各给药组血清AST水平都明显下降(P＜0.05)，肝加欣组下降最多，丁香苦苷高、中、低剂量组表现出剂量越大，AST水平下降越多，有剂量依赖性。(如表3-1)

表3-1 各组对CCL₄致慢性肝损伤的影响

注：与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

3.2TP和ALB结果

(1)对血清TP来说，与模型对照相比，各给药组均能明显升高CCL₄引起的TP降低，但肝加欣组为最佳，丁香苦苷高、中、低剂量组表现出剂量越大，TP水平上升越多，有剂量依赖性。

(2)对血清ALB来说，与模型组相比，各给药组均有升高ALB的趋势，但无明显差异。(如表3-2)

表3-2 各组对CCL₄致大鼠慢性肝损伤TP、ALB的影响

注：与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

3.3病理组织检查结果