CN102465183B - 用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents
用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102465183B CN102465183B CN 201110396831 CN201110396831A CN102465183B CN 102465183 B CN102465183 B CN 102465183B CN 201110396831 CN201110396831 CN 201110396831 CN 201110396831 A CN201110396831 A CN 201110396831A CN 102465183 B CN102465183 B CN 102465183B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- probe
- jak2
- primer
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title abstract description 5
- 101100233766 Homo sapiens JAK2 gene Proteins 0.000 title abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 101000997832 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 claims description 18
- 101150009057 JAK2 gene Proteins 0.000 abstract description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 102200087780 rs77375493 Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000037437 driver mutation Effects 0.000 abstract 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 230000008859 change Effects 0.000 description 30
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 11
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 108091082332 JAK family Proteins 0.000 description 4
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000042838 JAK family Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 229940100514 Syk tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 208000017733 acquired polycythemia vera Diseases 0.000 description 2
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003476 primary myelofibrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 2
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDOQBOJDRPLBQU-QMMMGPOBSA-N 5-chloro-2-n-[(1s)-1-(5-fluoropyrimidin-2-yl)ethyl]-4-n-(5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound N([C@@H](C)C=1N=CC(F)=CN=1)C(N=1)=NC=C(Cl)C=1NC=1C=C(C)NN=1 PDOQBOJDRPLBQU-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108010019437 Janus Kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000006503 Janus Kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102000000887 Transcription factor STAT Human genes 0.000 description 1
- 108050007918 Transcription factor STAT Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010441 gene drive Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于检测人类JAK2基因驱动突变的引物、探针及试剂盒，涉及到基因突变的检测。本发明的方法包括(1)提供7条引物和探针；(2)检测样品DNA模板的提取；(3)配制检测JAK2基因驱动突变的荧光PCR反应体系；(4)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强度判定结果。本发明的方法可以检测JAK2基因V617F驱动突变，该方法具有灵敏度高，特异性强，检测速度快，检测方便等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及JAK2基因驱动突变的检测试剂盒。
背景技术
JAK2基因属于JAK基因家族，编码JAK一种酪氨酸蛋白激酶，属于非受体型酪氨酸蛋白激酶。JAK2蛋白激酶与JAKs家族具有相同结构功能区，其结构由4部分组成，分别为C端激酶区、假激酶区、假SH2区和N端FERM区。JAK2蛋白酪氨酸激酶激活的信号通路是细胞分化的主要细胞因子信号传导通路之一。受体信号转导起始于JAK2，通过活化JAK2，进一步活化其下游的STAT蛋白，活化的STAT将信号直接导入细胞核内，调节基因表达，从而参与包括造血和免疫系统在内的多条信号通路。JAK2可以介导多种细胞因子和生长因子信号转导，包括红细胞生成素(EPO)，白细胞介素(IL-3)、生长因子(GH)、血小板生成素(TPO)，粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，从而调节细胞生长、增值和分化。JAK2激酶的持续活化，会激活JAK介导的下游STAT的持续活化，其持续活化可诱发包括骨髓增殖性肿瘤在内的多种肿瘤。
骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPN)是骨髓里一种血细胞恶变导致的肿瘤，主要包括真性红细胞增多症(Polycythemia vera，PV)、原发性血小板增生多症(Essential thrombocythemia，ET)、特发性骨髓纤维化(Idiopathicmyelofibrosis，IMF)、慢性骨髓细胞性白血病(Chronic myelogenous，CML)。研究发现，骨髓增殖性肿瘤发生通常伴有JAK2基因第1849位突变，导致第617位的缬氨酸(V)变为苯丙氨酸(F)。JAK2 V617F突变率在PV患者中约有90％(Lippert，Boissinot et al.Blood 108(6)：1865-1867.2006)，在ET和IMF的突变率为50-60％(Sazawal，Bajaj etal.Indian J Med Res 132：423-4272010)。JAK2基因V617F突变在MPN的发现，使2008年世界卫生组织(WHO)修订MPN的诊断标准，将JAK2V617F的突变作为MPN主要诊断指标之一。因此，检测JAK2基因V617F突变的对临床MPN患者的诊断和筛查有重要意义。
针对JAK2基因V617F突变靶点设计药物已经成为治疗ET，PV，IMF等疾病的最重要的靶点之一。目前的临床药物TG101348和AZD1480是特异性作用于JAK2激酶开发的一类治疗肿瘤的药物，其可以阻断肿瘤细胞JAK2下游的STAT3信号通路的传导，抑制肿瘤的生长和增值，从而达到治疗肿瘤目的。因此，检测JAK2基因是否存在V617F突变，不但可以帮助临床医生进行MPN的诊断，而且可以为临床医生的科学用药提供参考依据。
目前检测JAK2基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。包括JAK2基因在内的驱动性基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点，而且多数驱动性突变的检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的JAK2基因驱动突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对JAK2基因驱动性突变的检测，从而为临床个体化用药方案提供科学参考依据。
针对上述问题，本发明开发一种高灵敏，快速、操作简便的JAK2基因突变检测方法和检测试剂盒。本检测方法设计运用一种新型“双环探针”技术，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构，通过与特异性引物相结合，阻止了非特异性扩增。该检测方法的灵敏度可达到0.1％，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于JAK2基因突变检测的引物和双环探针，通过对其驱动性突变的检测实现骨髓增殖性肿瘤的早期筛查和化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列：
表1EGFR驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列
本发明另一方面提供一种用于检测JAK2基因驱动突变检测试剂盒，其PCR反应扩增体系如下：
本发明另一方面提供一种用于检测JAK2基因驱动性突变方法，其方法包括以下步骤：
(1)根据COSMIC数据公布的人类JAK2为野生型基因序列，针对JAK2的驱动性突变点，来设计特异性简并引物和特异性双环探针。
(2)提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、全血和血浆等组织中的DNA。
(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。
(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞16)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和双环探针技术，可以特异性地检测人类JAK2基因驱动性突变。此方法：(1)建立了实时PCR体系实现对JAK2基因V617F驱动突变快速检测；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(3)特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(4)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
附图说明
图1为实施例1阴性对照PCR图。
图2为实施例1检测JAK2基因V617F突变的PCR图。
图3为实施例1灵敏度分析试验结果PCR图。
图4为实施例1选择性试验结果PCR图。
图5为实施例2检测临床样本JAK2突变阳性PCR图。
具体实施方式
本发明以野生型细胞系SW480的基因组为DNA野生型为检测模板，以基因工程构建的质粒为突变模板，建立实时荧光PCR检测JAK2反应体系，针对突变位点设计特异引物和双环探针，检测JAK2基因V617F驱动突变的方法包括以下步骤：
(1)针对突变位点设计特异性引物和双环探针：
根据COSMIC数据库公布的JAK2基因序列为野生型序列，针对JAK2基因V617突变位点设计特异性引物和特异性双环探针。通过特异性引物和双环探针的优化，实现JAK2基因V617F突变高灵敏、特异性检测。
基本原理：
本发明设计探针的基本原理是利用双环探针为一条寡核苷酸，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。如序列JAK-P，5-FAM：GTCATGCTTGCAGT 
GCTTGC-3-BHQ1，其中，带下划线的部分结合成环，带方框的部分结合成另一环，双环探针环形结构的消失引起荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序列检测出来。只有突变的DNA扩增产物可以与双环探针结合，发出荧光信号而被检测出来。该技术与“特异引物技术”相结合，可以阻止非特异性扩增，使检测基因突变的灵敏度和准确性得到大幅度提高，运用上述基本原理，设计JAK2基因V617F突变位点的双环探针。
应用Premier 6.0引物设计软件设计双环探针和特异引物核苷酸序列，设计的特异性引物和双环探针的序列如表1所示。
(2)检测样本处理与DNA的提取：
检测样本包括全血和血浆，对于全血、血浆其体积不少于200μL，按如下操作步骤提取DNA。加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μLBuffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。
所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量，要求所提DNA的OD260/OD280在1.8～2.0之间。然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(3)建立PCR扩增反应体系：
应用上述设计合成的双环探针和特异引物，取5μL提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为：
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准：
检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞16)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
本实施例以质粒和细胞系检测本发明体系，经基因工程构建的突变质粒模板1株(含V617F)，细胞系2株，分别为H1650(JAK2基因野生型)和SW480(JAK2基因野生型)。利用本发明实时荧光PCR检测JAK2基因V617F突变的方法包括如下步骤：
(1)样本DNA提取
将蛋白酶K和Buffer ATL，加入到800μl的细胞液中，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量，要求所提DNA的OD260/OD280在1.8～2.0之间。然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL 作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)荧光PCR扩增反应体系
将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR扩增体系进行扩增，JAK2荧光PCR扩增体系为：
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测结果判定
采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。细胞系和质粒的PCR检测结果分别见图1和图2。
灵敏度分析：将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出，见图3。
选择性分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将野生型细胞系(SW480)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。然后将105拷贝/μL的突变质粒DNA用20ng/μL和2ng/μL的SW480细胞系的DNA连续10倍稀释。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％，见图4。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.2个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以高灵敏、准确地检测上述混合体系的JAK2基因突变。
实施例2
运用本发明检测临床样本，取送我公司检测的临床骨髓增殖性肿瘤血液样本50例，其中PV患者14例，IMF患者25例，ET患者11例。年龄为30-72岁，平均年龄为56岁。利用本发明双环探针和荧光PCR体系检测50例临床样本的JAK2基因驱动突变步骤如下。
(1)临床病理样本DNA提取
将上述样本各取800μl的血液，按如下步骤进行DNA提取。加入蛋白酶K和BufferATL，56℃消化裂解1小时，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μLBuffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL BufferATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。所提DNA经紫外分光光度计检测提取质量，要求所提DNA的OD260/OD280在1.8～2.0之间。然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)荧光PCR扩增反应体系
将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR扩增体系进行扩增，JAK2荧光PCR扩增体系为：
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测结果判定
采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
在所检测的50例骨髓增殖性肿瘤的临床样本中，包括PV患者14例、IMF患者25例、ET患者11例。同时，在足够量样本下，采用直接测序法进行对比检测，结果表明本发明体系与直接测序法的符合率达到100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表2。
本发明荧光PCR反应体系可检测JAK2基因V617F驱动性突变，检测方便快捷，准确性高，可满足JAK2基因驱动性突变的快速检测。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力均远高于传统测序方法。
表1：引物和探针序列
表2本发明检测结果与DNA直接测序结果比较
Claims (1)
1.用于检测JAK2基因突变的引物及探针，包括下列的两条引物和一条探针：其序列分别为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO3所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110396831 CN102465183B (zh) | 2011-12-02 | 2011-12-02 | 用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110396831 CN102465183B (zh) | 2011-12-02 | 2011-12-02 | 用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102465183A CN102465183A (zh) | 2012-05-23 |
| CN102465183B true CN102465183B (zh) | 2013-06-19 |
Family
ID=46069302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110396831 Active CN102465183B (zh) | 2011-12-02 | 2011-12-02 | 用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102465183B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834533A (zh) * | 2017-04-12 | 2017-06-13 | 东莞市儿童医院 | 一种检测iii类错合畸形pcdhb3基因突变的pcr引物、探针及方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104004839A (zh) * | 2014-05-20 | 2014-08-27 | 苏州大学 | 一种jak2基因位点分型检测试剂盒 |
| CN105441573A (zh) * | 2016-01-11 | 2016-03-30 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类jak2基因v617f突变的引物、探针及试剂盒 |
| CN117867112B (zh) * | 2023-12-19 | 2025-02-07 | 武汉康录生物技术股份有限公司 | 一种检测jak2基因v617f突变的荧光引物及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080153097A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-06-26 | Eragen Biosciences, Inc. | Methods and kits for detecting jak2 nucleic acid |
| CN101671744A (zh) * | 2009-02-24 | 2010-03-17 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种用于核酸实时检测的探针 |
-
2011
- 2011-12-02 CN CN 201110396831 patent/CN102465183B/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834533A (zh) * | 2017-04-12 | 2017-06-13 | 东莞市儿童医院 | 一种检测iii类错合畸形pcdhb3基因突变的pcr引物、探针及方法 |
| CN106834533B (zh) * | 2017-04-12 | 2020-07-03 | 东莞市儿童医院 | 一种检测iii类错合畸形pcdhb3基因突变的pcr引物、探针及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102465183A (zh) | 2012-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103114133B (zh) | 一种用于检测c-kit基因突变的探针、引物及检测试剂盒 | |
| CN101092644B (zh) | 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测 | |
| CN106399555A (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒 | |
| CN102776286B (zh) | 用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN102465183B (zh) | 用于检测人类jak2基因突变的探针、引物及试剂盒 | |
| CN111394487B (zh) | 用于检测结核杆菌及其耐药性的方法 | |
| CN105886648A (zh) | 用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒 | |
| Van Egeren et al. | Transcriptional differences between JAK2-V617F and wild-type bone marrow cells in patients with myeloproliferative neoplasms | |
| CN110951843A (zh) | 一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法 | |
| CN110951860A (zh) | 一种检测jak2 v617f突变率的方法及其专用引物和探针 | |
| CN110904250B (zh) | 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN102719530B (zh) | 一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN102453765B (zh) | Pik3ca基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒 | |
| CN102443626A (zh) | 肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒 | |
| CN109266764B (zh) | 一种检测常见益生菌丰度的试剂盒 | |
| Hedberg et al. | Oncolytic virus-driven immune remodeling revealed in mouse medulloblastomas at single cell resolution | |
| CN106148497A (zh) | Braf基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN108728536A (zh) | 人egfr基因t790m位点检测的引物、探针、pcr反应液和试剂盒 | |
| Seah et al. | A sensitive, non-radioactive quantitative method for measuring IL-4 and IL-4δ2 mRNA in unstimulated cells from multiple clinical samples, using nested RT-PCR | |
| CN110373467A (zh) | 一种人类egfr基因突变位点t790m的检测试剂及检测方法 | |
| CN102628077A (zh) | 用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测的探针、引物及试剂盒 | |
| CN110317859A (zh) | 一种筛查脊髓性肌萎缩症的方法及其应用 | |
| CN114540524A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字pcr检测试剂盒 | |
| CN111206092B (zh) | 一种疾病筛查引物探针组合及其应用、试剂盒与检测方法 | |
| CN112831556A (zh) | 基于as-pcr检测myd88 l265p突变的试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 361000, No. 39, Ding Shan Road, Haicang District, Fujian, Xiamen Patentee after: AMOY DIAGNOSTICS CO., LTD. Address before: 361000 Fujian Province, Xiamen City Haicang Xinyang Industrial Zone Weng Kok Road No. 289 Chong Building 5 floor Patentee before: Amoy Diagnostics Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201210 Address after: Room 202, building 3, 138 xinjunhuan Road, Minhang District, Shanghai Patentee after: Shanghai Xiawei medical laboratory Co.,Ltd. Address before: No. 39, Haicang Ding Shan Road, Haicang District, Xiamen, Fujian Patentee before: Xiamen Aide Biomedical Technology Co.,Ltd. |