CN102464603A - 吲哚满二酮衍生物及其在制备抗超级耐药菌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及吲哚满二酮类衍生物及其在制备抗耐药菌药物中的用途。本发明的吲哚满二酮衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有很强的抑制作用，可用于制备新型的有效抗菌药物。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮，静脉或肌肉注射。所述的吲哚满二酮衍生物的化学结构式如式(I)所示，式中其中R₁为H、phenyl(苯基)或p-fluorophenyl(对氟苯基)；R₂为F、Cl、Br、I或H；R₃为F、Cl、Br、I或H；R₄为H、CH₃、o-fluorobenzyl(邻氟苄基)、m-fluorobenzyl(间氟苄基)和p-fluorobenzyl(对氟苄基)。

Description

吲哚满二酮衍生物及其在制备抗超级耐药菌药物中的用途

技术领域

本发明涉及吲哚满二酮类(isatin)衍生物及其在制备抗耐药菌药物中的用途，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)等超级细菌有很强的抑制效果。

背景技术

自1961年英科学家Jevons首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)以来，MRSA感染以惊人的速度在世界范围内蔓延，其致病性强，呈多重耐药，死亡率较高，成为临床治疗的一大难题，医院和社区感染以致院内感染流行的频率越来越高，成为名副其实的“超级细菌”。Rice曾报道(J.Infect.Dis.，2008，197，1079-1081)“ESKAPE”是目前非常重要的致命耐药菌，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)名列其中，造成了美国医院大部分的感染疾病，数据显示，MRSA在美国引起的死亡率大于HIV和结核病感染的总和。我国也是耐药菌最为严重的国家之一，目前我国MRSA临床分离率也呈显著增高趋势，据2007年中国细菌耐药监测网(Ministry of Health NationalAntimicrobial Resistance Investigation Net，Mohnarin)细菌耐药监测项目统计，我国的500万感染病患者中，超过一半是由于感染MRSA所致。

令人担忧的是，MRSA对多种抗生素的抗药性在不断增强。10年前只有10％的MRSA对医院使用的抗生素有抗药性，然而现在此比例已经上升到50％。目前对MRSA真正起效的抗生素已为数不多，临床常用的仅万古霉素(vancomysin)、达托霉素(daptomycin)、利奈唑胺(linezolid)、替加环素(tigecycline)和头孢吡普(ceftobiprole)等药物。这些抗生素本身也存在某些问题，如有的存在毒性，有的价格较贵，有的结构复杂，现在甚至部分病例报道有对这几种抗菌药也产生抗性的MRSA菌株。2010年9月，Walsh TR等人(Lancet Infect Dis.2010，10(9)，597-602)报道了一种含有NDM-1酶的新型超级细菌，对几乎所有的抗生素都不敏感，引起了世界范围的广泛不安和高度关注。

近四十年来，全球药物公司在新型抗生素的研发方面投入大量研究成本，但是仅仅推出以达托霉素和利奈唑胺为代表两类新结构的抗生素。随着耐药菌的抗药能力越来越强，研究开发化学结构新颖，毒性较低，特别是能够成为我国自主知识产权的新型抗耐药菌药物成为刻不容缓的历史使命。

近年来，我国在此方面的研究虽取得了一定的进展，但是总体来说数量较少。发明人通过专利检索找到以下几项有原创性的专利：CN101195627A，CN100586433C，CN100441580C，CN1308047A，CN101428026A，CN101074235A，CN100519533C，CN101584694A，CN101786979A。这其中，目前只有CN101441580C报道的活性化合物在工业上进一步开发方面有较好的前景。

吲哚满二酮类是一类具有广泛生物活性的有机化合物，表现在抗衰老、抗老年性震颤麻痹、降血脂、抗氧化、维持脑血管正常功能、抗癌活性、杀菌抗炎等方面(Pandeva，S.N.，et al.Acta Pharm.，2005，55，27-46；Varma，R.S.，et al.Def.Sci.J.，1978，28(4)，191-201；Joaquim F.M.S.，et al.J.Braz.Chem.Soc.，2001，12(3)，273-324)。我们在前期的研究中曾经发现吲哚满二酮类化合物还可以抑制拟南芥乙酰乳酸合成酶AHAS(CN 101243793B)。有研究发现该类化合物还可作为甲壳动物胚胎免于遭受病原真菌侵犯的MAO抑制剂(汪开冶，生物技术通报，2006(3)，104-106)。

有关吲哚满二酮类化合物对MRSA的抑制活性报道很少，目前通过查询仅发现以下两篇文献：1)Rodríguez-Argüelles MC等人(J.Inorg.Biochem.2007，101(1)，138-147)曾报道某些含有金属的复杂结构吲哚满二酮衍生物(A)有抗MRSA生物活性，其最小抑制浓度MIC为6μg/mL。2)专利WO2009139870公布了结构式(B)的吲哚满二酮衍生物，其抑制MRSA的MIC约为30μM。这两个吲哚满二酮衍生物抑制MRSA的活性总体来说不是太高。

甲吲噻腙(C)是一个早期常用的抗病毒药物，其通过抑制mRNA译制蛋白质而防碍病毒复制，可用于治疗天花，牛痘性湿疹，带状疱疹等(Bauer，D.J.，Ann.NY Acad.Sci.，1965，130，110-117；Borysiewicz，J.et.Al.，Arch.Virol.，1979，62，83-86；Quenelle，D.C.，Antivir.Res.，2006，71，24-30)，但是没有任何文献表明该化合物及其类似物有抗耐药菌的用途。

硫脲类化合物具有广泛的生物活性，许多硫脲类化合物都是医用的抗生素。但是在耐药菌方面活性报道较少。Kriushnapriya S等人(Bri.J.Biomed.Sci.，2009，66(1)，14-19)发现某些结构通式如(D)的缩氨基硫脲类化合物对25种MRSA菌株表现出活性，最好的化合物MIC值为16μg/mL，但是该文献并没有给出所研究化合物的具体结构信息。

Pervez H等人(J.Enzyme Inhib.Med.Chem.，2008，23(6)，848-854)报道了结构通式如(E)的化合物，该类化合物的毒性较低，在200μg/mL浓度下表现出一定的抗真菌活性，在10000μg/mL(10mg/mL)浓度下表现出较微弱的抗细菌活性，该研究发现其中某些化合物对尿素酶urease表现出一定的抑制。

Hall M.D.等人(J.Med.Chem.，2009，52(10)，3191-3204)报道了结构式如(F)的化合物，其对多种抗药性的癌细胞有很强的抑制效果，正在进行临床前研究，但是该文献没有指出这类化合物对耐药细菌有抑制效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的吲哚满二酮类衍生物及其在制备抗耐药菌药物中的用途，特别是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)药物中的应用。

本发明的吲哚满二酮衍生物如下式(I)所示：

其中R₁为H、phenyl(苯基)或p-fluorophenyl(对氟苯基)；

R₂为F、Cl、Br、I或H；

R₃为F、Cl、Br、I或H；

R₄为H、o-fluorobenzyl(邻氟苄基)、m-fluorobenzyl(间氟苄基)和p-fluorobenzyl(对氟苄基)。

本发明的吲哚满二酮类衍生物是通过以下反应通式获得：

将等物质的量的氨基硫脲II(或取代氨基硫脲)和取代吲哚满二酮III在乙酸中混合，在乙醇-水(5∶1)溶液中回流6h，然后冷却至室温，经过重结晶得到目标化合物I。

通过体外抑菌实验表明，本发明的吲哚满二酮衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有很强的抑制作用，有的比对照药万古霉素的效果(MIC＝1μg/mL)还要好，因此本发明的吲哚满二酮衍生物可用于制备治疗抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的活性化合物。

本发明还提供一种用于治疗耐药菌感染的药物，特别是治疗抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的药物；该药物含有上述的吲哚满二酮衍生物以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮，静脉或肌肉注射。

本发明实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

具体实施方式

实施例1：化合物WJG-1的合成

将3.0g(20mmol)吲哚满二酮加入40mL冰乙酸中，室温下滴加9.8g Br₂(61mmol)溶于10mL乙酸的溶液，搅拌0.5h，后加热升温回流1.5h，析出红色晶体，抽滤，烘干，得产物5，7-二溴吲哚满二酮5.8g，产率约94％。

将2.0g(6.6mmol)5，7-二溴吲哚满二酮和0.9g(6.6mmol)无水碳酸钾加入到装有45mLDMF的100mL三口瓶中，加热至65℃，1h后加入1.9g(13.2mmol)间氟取代氯化苄，反应2h完毕，加入2倍体积的水，抽滤水洗得到红色固体，干燥得N-间氟苄基-5，7-二溴吲哚满二酮2.4g，产率89％。

将6.17g(37mmol)30％水合肼加入反应瓶中，冷却下用35％盐酸酸化至pH值接近3，再加入50mmol硫氰化铵，在30℃以下加入3mL丙酮，回流5h，冷却，过滤，用5％氢氧化钠10mL洗固体一次，除去双硫脲副产物，再用10mL水洗一次，干燥，得2.8g氨基硫脲白色晶体，收率83％。

将2.1g(5mmol)N-间氟苄基-5，7-二溴吲哚满二酮，0.45g(5mmol)氨基硫脲和2.5mL乙酸混合，在50mL乙醇-水(5∶1)溶液中回流6h，然后冷却至室温，重结晶得到WJG-1橙色固体2.2g，产率88％。

同样，可以合成本发明的化合物WJG-2和WJG-3。

实施例2：化合物WJG-4的合成

水合氯醛4.0mL(40mmol)，无水硫酸钠45.9g(324mmol)加至120mL水中，内温升至40℃后搅拌至澄清，于10～15min内滴加由7.9g(36.0mmol)邻碘苯胺和50mL 5％盐酸组成的溶液，该温度下继续反应0.5h，析出大量白色沉淀，快速加7.5g(108mmol)盐酸羟胺并将内温升至75℃，有絮状固体生成，继续反应4h后停止反应，冷至室温，过滤并烘干，得2-碘-1-异亚硝基-乙酰苯胺棕色粉末8.9g，产率85％。

将25mL浓硫酸预热至75℃，控制反应温度在75～80℃，充分搅拌下于0.5h内分批加入7.3g(25mmol)2-碘-1-异亚硝基-乙酰苯胺，加毕后维持80～85℃继续反应1h停止反应，冷至室温，将反应液小心地倾入30g碎冰中并于0℃环境下充分搅拌0.5h，过滤得7-碘-吲哚满二酮红棕色固体5.5g，产率80％。

取4.7g(50mmol)苯胺溶于25mL 95％乙醇中，搅拌下滴加11mL浓氨水(25％)，反应混合物保持30℃以下在15min内慢慢滴加4.5mL二硫化碳(变为浅黄色溶液)，放置1h然后加入5.8g(50mmol)氯乙酸钠在室温下搅拌30min，再滴加6mL 85％的水合肼，搅拌至溶液析出晶体，过滤，得到苯基氨硫脲白色晶体4.7g，产率56％。

参考WJG-1路线的最后一步合成终产物WJG-4，产率65％。

同样，可以合成本发明的化合物WJG5-WJG8。

目标化合物的结构式和物化参数见表1，元素分析、质谱及¹H NMR见表2。

实施例3：吲哚满二酮衍生物抗MRSA活性测定。

1.试验材料

Mueller-Hinton Broth(北京奥博星生物技术有限责任公司)，胰蛋白胨(英国OXOID公司)，酵母浸出粉(英国OXOID公司)，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)，96孔细胞培养板(flat bottom)(美国康宁公司)，阳性对照药物万古霉素(美国Amresco公司)，二甲基亚砜DMSO(国药集团化学试剂有限公司)，MHB培养基(使用电子天平称取24克Mueller-HintonBroth干粉，溶解于1000毫升蒸馏水，调节pH至7.2，使用高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌20分钟制备所得)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(来自首都医科大学附属北京朝阳医院临床分离耐药菌株，以冻存甘油管方式保存于-80℃冰箱)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus ATCC6538)，枯草杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)。化合物WJG-1～WJG8，LB琼脂平板(使用电子天平称取10克Tryptone、5克Yeast extract、5克氯化钠，溶解于1000毫升蒸馏水，调节pH至7.0，加入20克琼脂粉，使用高压蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌20分钟，分装至无菌培养皿(30ml/培养皿)待冷却凝固后备用)。

2.菌液准备

测定时取出保藏MRSA菌株的甘油冻存管，在室温下解冻，划线法接种于LB琼脂平板上进行活化，于37℃培养箱培养20小时；用无菌接种环挑取3个MRSA单菌落于3ml MHB培养基中，使用涡旋振荡器充分混匀成为菌液母液，使用血球计数板检测菌浓；使用MHB培养基将菌液母液稀释至2×10⁴细胞/mL，成为待用菌液。

3.药液准备

用电子分析天平称取待测化合物，以无菌DMSO为溶剂配制为1mg/mL的化合物溶液；阳性对照药物万古霉素使用无菌DMSO配制为320μg/mL的溶液，并用DMSO依次稀释为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL等8个浓度梯度。

4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度

取无菌96孔细胞培养板，使用8道微量移液器移取40μL MHB培养基至96孔细胞培养板各孔；使用微量移液器吸取2μL步骤3中所述的8个浓度梯度的万古霉素溶液，加入96孔细胞培养板第一列的8个孔中，为阳性对照组；使用微量移液器吸取2μL无菌DMSO，加入96孔细胞培养板第十二列的8个孔中，为阴性对照组；使用微量移液器吸取2μL待检测化合物溶液，依次加入96孔细胞培养板第二列至第十一列各孔中；使用8道微量移液器移取40μL步骤2中所述的待用菌液，加入96孔细胞培养板各孔中；将上述96孔细胞培养板置于37℃培养箱，培养16小时后，观察96孔板各孔中的MRSA生长状况，呈混浊状态的孔中所加的化合物无抗MRSA活性，呈澄清状态的孔中所加的化合物初步判断具有抗MRSA活性。将所检测到的各个具有抗MRSA活性的化合物从1mg/mL的初始浓度依次进行2倍梯度稀释为1mg/ml，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，15.625μg/mL，7.8125μg/mL 8个不同浓度的化合物溶液；用同样的方法测定，使用酶标仪读取各孔的吸光值OD600。对于每个化合物，MRSA生长被完全抑制的孔所对应的化合物终浓度(化合物溶液浓度/40)即为该化合物对MRSA的最低抑菌浓度。

同样，可以测定吲哚满二酮衍生物抑制金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的生物活性。

目标化合物的抗MRSA、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生物活性数据见表3.

表1.目标化合物的物化参数

表2.目标化合物的元素分析、质谱及¹HNMR

表3.吲哚满二酮类衍生物抗MRSA、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)的生物活性测定结果

Claims (6)

1.一种吲哚满二酮衍生物，它是如式(I)所示的化合物：

其特征在于

R₁为H、phenyl(苯基)或p-fluorophenyl(对氟苯基)；

R₂为F、Cl、Br、I或H；

R₃为F、Cl、Br、I或H；

R₄为H、CH3、o-fluorobenzyl(邻氟苄基)、m-fluorobenzyl(间氟苄基)和p-fluorobenzyl(对氟苄基)。

2.权利要求1所述吲哚满二酮类衍生物及其制备方法。

3.权利要求1所述吲哚满二酮类衍生物作为制备抗菌药物中的用途。

4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述的抗菌药物是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等耐药菌的药物。

5.一种抗菌药物，其特征在于它含有权利要求1所述的吲哚满二酮衍生物以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

6.根据权利要求5所述的抗菌药物，其特征在于它是含有该药物的注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。