CN102460154B - 整体决策液份分级 - Google Patents

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Abstract

除了其他方面，此处提供的是用于从含有生物颗粒的悬浮液中分级液份的方法和装置。在特定实施例中，生物颗粒可以是细胞、细胞器官、蛋白质、DNA、生物起源物质的碎片、覆有生物复合物的微珠或者病毒颗粒。这样，可使用此处提供的方法和装置来量化稀有细胞，诸如循环癌症细胞、胎细胞和出现在体液中其他稀有细胞，用于疾病诊断、预后或治疗。

Description

整体决策液份分级
相关申请的交叉引用
本申请要求临时申请号61/168,892、在2009年4月13日申请的美国专利的权益，为所有目的此处直接地通过参考合并其整体。
联邦赞助的研究或研发下做出的关于发明权利的声明
不适用
对于“顺序表”、表格或以光盘提交的计算机程序列表附录的参考
不适用
发明背景
体液是生物颗粒在液体中的复杂的悬浮物。例如，血液，包括血浆和细胞(红血细胞、白血细胞、血小板)，且细胞占有血液的大约55％。血浆大部分是水，且血浆转移蛋白质、离子、维生素、酶、荷尔蒙和其他化学物质到身体中的细胞。
血红细胞的尺寸大约6到8μm，且用作为提供氧气给细胞。白细胞直径为约10到13μm，且它们通过对抗外来病毒和细菌作为免疫系统的一部分来保护身体免受疾病。血小板是最小的细胞，1.5到3μm，它们通过形成血凝块来停止流血。
除了血液之外，液体诸如有唾液、眼泪、尿液、脑脊液以及其他与各种器官(如，肺)相接触的含有细胞与生物颗粒的混合物的其他体液。呈现在特定体液(如，血液)中的细胞和生物颗粒的类型和量表现出有关生物体的健康的信息，且在伤口被感染的个体的情况下，表现出与疾病的诊断、预后有关的信息。
相比血液细胞的标称浓度，一些细胞和生物颗粒的量很稀少。尽管它们稀少，这些细胞或生物颗粒可能杂乱地联系到体内所发生的改变个体健康状态的重要的事件。这些细胞一般被称为“稀有细胞”。
例如，从原发性肿瘤处的癌细胞的扩散是主导癌症病人的复发可能性和存活率的重要因素。由于癌细胞不规律地生长且丢失了彼此粘附的能力，它们可能进入血液、淋巴循环并在整个全身循环。这些细胞一般被称为循环肿瘤细胞(CTC)、播散肿瘤细胞(DTC)、循环癌细胞(CCC)、循环上皮细胞(CEC)、潜伏肿瘤细胞(OTC)或者其他类似的改变，来指示这些细胞的移动的本质，这与固体肿瘤的直接活组织切片检查获得的样本相反。CTC已经在经受所有主要癌症的病人的血液中探测到，主要癌症有：前列腺、乳腺、胃、结肠直肠、肾、肺、胰腺及其他。
以此方式，已经研发了计算体液中呈现的CTC的测试来辅助提供对于癌症病人的预后。还可使用“CTC测试”来监测病人对于特定治疗(如，放射或化学疗法)草案(protocol)的反应。基于CTC测试的结果，癌症病人可通过最小化附加的不必要的以及昂贵的诊断测试和治疗来避免很大的花费，而这些花费经常不被健康保险所覆盖，例如计算机断层照相法(CT)或者正电子发射计算机断层显像(PET)扫描，或者可缩短无效的药物治疗。
然而，CTC在周边血中呈现出极其低的浓度，估计数量级为每106到107单核细胞中有一个肿瘤细胞，这等于每0.5ml到5ml周边血中有一个肿瘤细胞。以这样低的浓度，必须筛选带有约100百万单核细胞的样本来以99.995％的确定度探测到至少一个CTC。使用传统技术，诸如以一般800细胞/秒扫描的自动数字显微镜(ADM)，需要18个小时来完成这样大小的样本，表现出其用于医疗用途在费用上和时间上的不实际。
例如，可采用传统的流式细胞计数仪来确定血液样本中CTC的出现或量。然而，流式细胞计数仪需要将细胞按行线性地组织，并单个地探测每一个细胞，因为使用现有技术并不能正确地说明两个细胞的同时探测。在流式细胞计数仪中，聚焦激光束，以使它们在任何给定的时间仅照亮单个颗粒。例如，如果一个无荧光的细胞与被设置为可由流式细胞计数仪探测的到的荧光细胞同时流过探测体(detection volume)，不能被流式细胞计数仪察觉到的这个非荧光细胞，可被引导到与荧光细胞一样的轨迹中。为了防止流式细胞计数仪的误解，通常将细胞悬浮液冲淡或减缓速度来容许细胞之间的充分的间距而防止探测体中两个细胞的重叠。当前现有技术的流式细胞计数仪具有上限为：整理100,000对象/秒。
因此，流式细胞计数仪并不适于探测或再现稀有细胞。在分析大量细胞的时候，(连续地)每次探测一个细胞以及确定每一个细胞的轨迹是很费时间的。例如，由于十毫升血液含有大约一百亿个细胞，以每秒100,000细胞的速度(这是现有技术的流式细胞计数仪的上限速度)，将需要100,000秒或28小时来完整地整理10mL的内容。对于稀有细胞，一般需要7-15mL的血液来收集统计学上意义重大的量的稀有细胞。使用流式细胞计数仪来再现稀有细胞是对医疗资源不切实际的浪费，且可带来非常高的测试成本。
因此，需要简单的和成本/时间-效益的技术用于探测和量化在液体样本中的稀有颗粒和细胞。本发明通过提供用于探测液体样本中稀有颗粒的方法和装置来满足这些和其他需要。
发明内容
除了其他方面，本发明提供了通过排序液份(aliquots)快速地扫描大容积液体来探测和/或量化所期望的生物颗粒的方法和装置。在一个方面中，所采用的概念，被称为整体决策液份排序(Ensemble-Decision Aliquot Ranking)(“eDAR”)，对于探测生物液体中的稀有细胞非常有用。
在一个方面中，本发明提供了用于在液体样本中探测稀有颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：探测在液体样本的液份中稀有颗粒的存在或不存在、基于稀有颗粒的存在或不存在而给液份分配一个值、且基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。
在第二个实施例中，本发明提供用于提供给对象对与生物液体中稀有颗粒的出现相关联的情况的诊断或预后的方法，所述方法包括如下步骤：探测生物液体的液份中稀有颗粒的存在或不存在、基于稀有颗粒的存在或不存在而给液份分配一个值、且基于所分配的值而向对象提供诊断或预后。
在第三个方面，本发明提供用于探测液体样本中稀有颗粒的设备，所述设备包括至少第一个输入通道、至少两个出口通道、能探测液体样本的液份中一个或多个稀有颗粒的至少一个探测器、用于引导所述液份的流动的机制、以及能基于所述液份中稀有颗粒的存在、不存在、标识、成分或量能给所述液份分配一个值的计算机，其中所述计算机与所述探测器和用于引导所述液份的流动的机制之间通信。
附图简述
图1示出对液份中多个颗粒的同时探测以及液份的方向。
图2示出用在eDAR中的带有孔的掩模，用于改进信号-噪声比。
图3示出用在eDAR中的带有很近间距的孔的掩模，用于改进信号-噪声比。
图4示出包括单个流动通道、2个激光器和三个探测器的eDAR装置。
图5示出包括三个流动通道、激光器和探测器的eDAR装置。
图6示出包括三个流动通道、激光器和三个探测器的eDAR装置。
图7示出包括五个流动通道、激光器和三个探测器的eDAR装置。
图8示出用eDAR(上面板)和商用仪器(Veridex’s CellSearch，下面板)从血液中计数循环肿瘤细胞(CTC)的比较。
图9A-C示出在各种照明环境下使用eDAR从病人血液中捕获的癌细胞的光学图像(箭头标记CTC)。图9A是在血红细胞当中的CTC的明场图像。图9B是指示泛细胞角蛋白的出现的荧光图像。图9C示出CD45的出现的荧光图像，因此排除了将白血细胞错误标识为CTC的可能性。
图10A-D示出从一般的癌细胞中辨别出来的癌干细胞的光学图像。箭头指示癌干细胞(CD44+/CD24-)。图10A是用于探测Alexa488-抗-CD44(绿色)的荧光图像(50—540nm)。图10B是用于探测Alexa647-抗-CD24(红色)的荧光图像(645-700nm)；图10C是明场图像。图10D是指示CD44+/CD24-的合成图像(箭头指示癌干细胞)。
图11A-D示出用于把悬浮液分成液份的设备1110的操作。
图12A-C示出设备1210，其被用于采用在节点处1240结合的五个液体通道(1211、1212、1213、1214和1215)把悬浮液分成液份。
图13示出从2个雪崩光电二极管(APD)收集来的荧光信号，2个雪崩光电二极管位于节点1116(或者1240)上游和上游不同位置。绘图1310示出来自一个APD的轨迹1311，所述一个APD配置为探测探测体1140(或1270)处的液份中EpCAM分子的存在，而绘图1320示出来自配置为探测通道1114(或1214)中的EpCAM分子的存在的第二个APD的信号轨迹1321。
图14示出绘图1410，示出使用eDAR随脉冲长度而变化的所再现到的癌细胞的百分比。轨迹1420示出当脉冲宽度为10ms或以下的时候，在正确的通道中收集到100％的癌细胞。
图15示出带有轨迹1520的绘图1510，轨迹1520示出随进入流速而变化的回收到的稀有细胞的百分比。
图16示出使用由不可混合的阶段(phase)所分离的分离的液体的液份来在到达探测体之前封装生物颗粒。
本发明的具体描述
I.概览
在一个方面，本发明提供在液体样本中用于探测和/或回收稀有颗粒的方法与装置。这个方面所体现的概念在此处被称为“整体决策液份分级”或“eDAR”。在一个实施例中，这个eDAR方法论可被表征为(i)探测液体样本的液份中稀有颗粒的存在或者不存在，(ii)根据稀有颗粒的存在或不存在而给液份进行分级，以及(iii)基于所分配的分级来引导整个液份的流动或收集。
对于寻找稀有细胞，eDAR提供了速度上的极大优势。作为示例，假设10mL悬浮液含有10个期望的稀有细胞。在这个情况下，约99.9999％的悬浮量没有含有一个期望的稀有细胞。现有技术，诸如流式细胞计数仪、FACS等，总是对包含在整个悬浮容积中的每一个细胞进行连续扫描，导致几乎所有的时间浪费在扫描不含理想细胞的99.9999％的悬浮量上。eDAR通过把悬浮液分成液份而容许对整个悬浮液的很快的高级别的筛分。如果细胞的确是稀有的，大多数液份不含有任何期望的细胞。在一个实施例中，这些液份分级为空，且通过第一通道丢弃。反之，的确含有稀有细胞的少量液份被分级为非零，且被收集在另外的通道或腔体中。
以这样的方式，eDAR不同于传统的流式细胞计数仪。流式细胞计数仪通过如下操作(1)通过使用套流(sheath flow)来包含颗粒-行，从而以单个列队(file)(也就是，一个一个按行)流动生物颗粒，(2)一次仅探测一个生物颗粒，以及(3)确定所探测的生物颗粒的轨迹。如果所探测到的生物颗粒是期望的，例如，以多种方法中的一个方法引导该生物颗粒沿着特定的轨迹到的收集容器。如果所探测到的生物颗粒是不期望的，以不同的轨迹引导生物颗粒到达不同的收集容器。
相比于传统的流式细胞计数仪，eDAR审查所有液份，也就是，液体的三维子部分，来对整个液份做出整体决策。不同于连续化(液体的1-维子部分，这导致将生物颗粒排列在单行中)或者平面化(液体的2-维子部分，这导致将生物颗粒排列在平面中的多个平行的行中)，液份法(aliquoting)提供了很高的吞吐量。流式细胞计数仪能分析液份，因为探测器被设置为仅收集来自单个细胞或细胞的单个平面的信号。在探测点或平面之外的生物颗粒对于流式细胞计数仪中所使用的探测器而言是看不见的，因此，套流、引导缓冲或其他水力或几何聚集机制对于防止生物颗粒移动到探测点或平面外是必要的。eDAR分析一个完整液份，此液份跨(span)生物颗粒的一个平面或层以上。在eDAR中，分析发自整个液份的信号，而不是来自单个探测点或平面的信号。
eDAR提供超越现有方法的极大增加的灵敏度来探测或分离稀有细胞。eDAR的探测组件可探测发自整个液份内的单个光子，且因此不会错失表现出可探测的特性的生物颗粒。假阴性的比率是极低的，因为液份分级被设置为仅消除那些被分级为完全没有所期望的生物颗粒的液份。
可在疾病的生物学和诊断的多种应用中使用根据本发明的实施例，包括从体液中捕捉癌细胞或癌症干细胞用于癌症预后；用于水质监测的诸如贾第鞭毛虫病或似隐孢菌素之类的寄生虫；用于疟疾诊断的感染疟疾的红血球；用于HIV监测的淋巴细胞和白血球；用于疾病筛查的母血中的胎细胞；用于治疗的干细胞；用于与朊病毒相关的疾病(如，狂牛病)筛查的感染朊病毒的细胞。
除了疟疾，还可使用本发明的主题用于监测人类免疫缺陷病毒(HIV)诊断和监测中的CD4+T-淋巴细胞(CD4+T-细胞)的监测。绝对的CD4+T-淋巴细胞计数可用作在感染HIV的病人中开始抗逆转录病毒治疗和机会性感染预防的标准。白细胞(血白细胞)的一部分，CD4+T-淋巴细胞的减少，强烈地相关于免疫防御的下降。CDC公共卫生服务已经强烈推荐在所有感染HIV的人中每3-6个月监测CD4+T-淋巴细胞(CD4+T-细胞)的水平作为开始合适的治疗策略和评估治疗效果的方法。
在一些实验室中，使用三个实验技术的产品来建立绝对的CD4+T细胞数量：全部的血白细胞计数、血白细胞中淋巴细胞的百分比和淋巴细胞是CD4+T-细胞的百分比。诸如FACSCount(BD Bioscience)之类的单个平面流式细胞仪在发展中国家不能商业地获得或者不能作为便携式设备。可使用本发明主题的实施例来从其他白细胞和RBC中快速地辨别出CD4+T-淋巴细胞。
根据本发明的实施例所用的附加的可能的分离、浓缩和/或隔离的应用，包括基因失调的出生前诊断的母血的胎细胞监测和朊病毒探测。朊病毒包括通过修改核酸步骤来对抗失活的一小部分感染的蛋白质颗粒。除外，可使用根据本发明主题的实施例用于胎细胞或其他微生物颗粒或纳米生物颗粒。
II.定义
如此处所使用的，“液体样本”是指可能含有或可能不含感兴趣的稀有颗粒的任何液体。在特定实施例中，液体样本可以是生物液体样本，例如血液样本、血浆样本、唾液样本、尿液样本、淋巴样本、脊髓液样本等。在其他实施例中，样本可以是环境液体样本，例如来自湖、河、海洋、池塘、溪流、泉水、湿地、水库等的液体样本。在还有其他实施例中，样本可以是水的样本，例如，来自脱盐植物、水处理植物、水库、泉水、溪流、冰川水流、水塔或者可实现为可携带的水的水源的任何其他水源。
如此处所使用的，“稀有颗粒”是指以低水平在液体样本中出现的细胞或分子。在特定实施例中，稀有颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白质络合物、核酸、核蛋白复合体、碳水化合物、代谢物、新陈代谢作用之副产物等。在特定实施例中，如果在液体样本中的浓度低于全部颗粒总量的约10％的颗粒可被认为是稀有的，或者低于液体中全部颗粒总量的9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少。在还有其他实施例中，稀有颗粒在液体样本中以每103液体全部颗粒总量中出现小于约1个，或者在液体全部颗粒总量中每104,105,106,107,108,109,1010,1011,1012中出现小于约1个，或者更少。
在特定实施例中，稀有颗粒是稀有细胞。稀有细胞可以是有核的或者无核的。稀有细胞，包括但不限于，表达恶性显形的细胞；胎细胞，包括孕妇外周血中的胎细胞、肿瘤细胞，诸如从肿瘤中流到血液或其他体液中的肿瘤细胞；感染病毒的细胞，诸如感染HIV的细胞、带有感兴趣的基因的转感染的细胞；以及在经受致敏失调(autoreactive disorder)的对象的周边血中出现的T-细胞或B-细胞的异常子类型。
如此处所使用的，“整体决策(ensemble-decision)”是指基于在颗粒的整体或分组中特性的存在或不存在的探测而做出的决策。在特定实施例中，将基于含有多个颗粒的液体样本的液份中单个独特颗粒的存在或不存在而做出整体决策。重要地，基于单个颗粒的存在或不存在而做出的整体决策将被应用到整个液份(也就是，应用到液份中出现的全部颗粒)。
如此处所使用的，“液份”是指将被分析的液体样本的全部容积的一部分。液份占有三维空间且其中的颗粒没有组织地随机地分布。液份具有有限深度，
且颗粒可沿该深度分布，且没有可辨别的层。在本发明的上下文中，对液份按其整体而非子部分加以分析。片、带、平面或其他暗示二维空间、并被用于描述一般采用水力聚集的现有的细胞排序方法(如，流式细胞计分析、FACS等)的类似术语并不认为是液份。
在特定实施例中，液份可包括液体样本的一部分或更多，例如，约1/2的液体样本，或约1/3,1/4,1/5,1/6,1/7,1/8,1/9,1/10或更少的液体样本。在特定实施例中，液份可包括，例如，10％的液体样本，或者约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,0.001％或更少的液体样本。这样，用此处提供的eDAR方法所检查或处理的液体可被分为，例如，至少约2个液份，或者至少约3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,175,200,225,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900,1,000,1,100,1,200,1,300,1,400,1,500,1,600,1,700,1,800,1,900,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500,5,000,6,000,7,000,8,000,9,000,10,000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,70,000,80,000,90,000,100,000,200,000,300,000,400,000,500,000,600,000,700,000,800,000,900,000,、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万或更多的液份。本领域技术人员可理解，液体样本所分成的液份的数量取决于液体中所希望的稀有颗粒的数量以及液体样本的总量。
在特定实施例中，液份可具有体积为，例如，在约0.1nl和约10ml之间、或者在约1nl和约1ml之间、或者在约1nl和约100μL之间、或者在约1nl和约10μL之间、或者在约1nl和约1μL之间、或者在约1nl和约100nL之间。
如此处所使用的，术语“分级(ranking)”涉及通过分类来评估液份的量的特性、质的特性或者重要性。在一个实施例中，液份可被分级为或者是空(例如，当在液份中没有探测到稀有颗粒的时候)或者非零(例如，当在液份中探测到至少一个颗粒的时候)。在一个实施例中，这样的分级可以是二元的。在其他实施例中，可根据附加类别而分级液份，例如，该附加的类别相关联于液份中稀有颗粒的浓度、液份中稀有颗粒的特性、液份中多个不同稀有颗粒的特性等。以这个方式，可基于浓度范围而分配任何数量的类别，浓度范围例如，在约1到10之间、在约11到20之间、在约1到50之间、在约51到100之间、在约1到100之间、在约101到201之间等。可为这些分类分配一个对应于一些预确定的量化或质化类别中的一个的任意数字(如，0、1、2、3、4、5等),或分配一个对应于液份中稀有颗粒的数量的实际值或大约数量的数字。
如此处所使用的，“可探测到的特性”是指与稀有颗粒相关联的性质，例如，光敏、电活化、生物活性或者磁性质，这些性质是稀有颗粒本身固有的，或者是与稀有颗粒相接合或相结合的可探测到的分子部分(moiety)相关联的。
光敏性质的示例包括，例如，通常是由生物颗粒形态(颗粒尺寸、粒度、内部亚细胞结构)所引起光强度的变化(光反射、散射、偏差、传输或吸收)、荧光、免疫荧光等。
电活化性质的示例包括，例如，电荷、氧化状态、自旋状态、电容、电导、电介性质、电泳迁移率或极化性的变化。
生物活性的示例包括，例如，使用酶的可探测到的反应，所述酶诸如是碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶及其化学发光的、比色的或化学荧光的底物，其包括但不限于TMB(3,3’,5,5’-N四甲联苯胺)、OPD(o-苯二胺、ABTS(2,2’-联氮双乙基苯并噻唑啉磺酸)、氯萘酚、AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)、DAB(二氨基联苯胺)、pNPP(P-硝基苯磷酸二钠)、BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)等。
在特定实施例中，可用于来探测稀有颗粒的分子部分包括但不限于：纳米颗粒、微珠、抗体及其碎片、荧光抗体、磁性纳米颗粒、聚合物分子、颜料分子、DNA或者RNA分子(如，适体)、脂质分子、蛋白质分子等。
如此处所使用的，“抗体”是指含有具体地结合并识别抗原的来自免疫球担保的框架区域或其片段的多肽。所识别出的免疫球蛋白基因包括卡帕、拉姆达、爱尔法、伽马、德耳塔、厄普西隆和谬恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为或者卡帕或者拉姆达。重链被分类为伽马、谬、爱尔法、德耳塔或者厄普西隆，然后其分别地定义免疫球蛋白类别IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。一般，抗体的抗原结合区是结合的特异性和亲和力是最关键的。抗体可以是从血清多克隆的单克隆的、杂种细胞或再结合克隆的，或者可以是嵌合、灵长化或人源化。
示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N末端确定约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体以完整的免疫球蛋白形式或用不同肽酶消化产生许多良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫连接下面消化抗体，产生F(ab)'2，Fab的二聚体，其本身是由二硫键连接于VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以打断铰链区中的二硫连接，从而将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体主要是带部分绞链区的Fab(参见FundamentalImmunology(《基础免疫学》，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据完整抗体的消化定义了不同抗体片段，但是本领域技术人员将理解，也可用化学方法或通过重组DNA的方法从头合成所述Fab'片段。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过全抗体修饰，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等，Nature348:552-554(1990))。
在一个实施方式中，抗体与标记或可检测部分偶联。
本文所述"标记"或"可检测部分"是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括但不限于：放射性核素、荧光染料(例如、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿TM、罗丹明、德克萨斯红、异硫氰酸四罗丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标记物(例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、由肿瘤相关蛋白酶(例如萤光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)激活的自淬灭的荧光化合物、纳米粒、生物素、地高辛等。
在某些实施方式中，可灌注检测试剂以选择性地标记或突出显示分离细胞。这种试剂的例子包括但不限于：荧光、免疫荧光、染料偶联的分子(例如抗体、fab片段、适体、聚合物、配体、激动剂、拮抗剂或它们的组合)磁性、电活化、生物活化或光致活化的化合物。一个例子是采用与作为上皮癌细胞中细胞骨架的整合组分的细胞角蛋白反应的染料。其它染料的例子包括：异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的小鼠抗-人上皮抗体(HEA)和藻红蛋白(PE)-偶联的抗-CD45。用于表面选择性捕获的抗体的示例包括但不限于泛细胞角蛋白抗体A45B/B3、AE1/AE3、或CAM5.2(识别细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、或细胞角蛋白19(CK19)的抗体)和针对乳腺癌抗原NY-BR-1(又称为B726P、ANKRD30A、锚蛋白重复结构域30A)；B305D同种型A或C(B305D-A或B305D-C；也称为抗原B305D)；Hermes抗原(也称为抗原CD44、PGP1)；E-钙粘着蛋白(也称为桑葚胚粘着蛋白-1、CDH1)；癌-胚胎抗原(CEA；也称为CEACAM5或癌-胚胎抗原相关细胞粘着分子5)；β-人绒毛膜促性腺素(β-HCG；也称为CGB、绒毛膜促性腺素、β多肽)；组织蛋白酶-D(也称为CTSD)；神经肽Y受体Y3(也称为NPY3R)；脂多糖相关蛋白3、LAP3、融合肽；趋化因子(CXC基序受体4；CXCR4)；)；癌基因ERBB1(也称为c-erbB-1、表皮生长因子受体、EGFR)；Her-2Neu(也称为c-erbB-2或ERBB2)；GABA受体A、pi(π)多肽(也称为GABARAP、GABA-A受体、pi(π)多肽(GABA A(π)、γ-氨基丁酸A型受体pi(π)亚基)、或GABRP)；ppGalNac-T(6)(也称为β-l-4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶6、GalNAc转移酶6、GaINAcT6、UDP-N-乙酰-d-半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶6、或GALNT6)；CK7(也称为细胞角蛋白7、肌凝集素、SCL、角蛋白7、或KRT7)；CK8(也称为细胞角蛋白8、角蛋白8、或KRT8)；CK18(也称为细胞角蛋白18、角蛋白18、或KRT18)；CK19(也称为细胞角蛋白19、角蛋白19、或KRT19)；CK20(也称为细胞角蛋白20、角蛋白20、或KRT20)；Mage(也称为黑色素瘤抗原家族A亚型或MAGE-A亚型)；Mage3(也称为黑色素瘤抗原家族A3或MAGA3)；肝细胞生长因子受体(也称为HGFR、肾细胞乳头状癌2、RCCP2、原癌基因met、或MET)；粘蛋白-1(也称为MUC1、癌抗原15.3、(CA15.3)、癌抗原27.29(CA27.29)；CD227抗原、上皮唾液蛋白、上皮膜抗原(EMA)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、花生反应性尿粘蛋白(PUM)、肿瘤相关糖蛋白(TAG12))；毛囊肿病液蛋白(也称为GCDFP–15、催乳素诱导蛋白、PIP)；尿激酶受体(也称为uPR、CD87抗原、纤溶酶原激活剂受体尿激酶型、PLAUR)；PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白；也称为PTHLH)；BS106(也称为B511S、小乳腺上皮粘蛋白、或SBEM)；前列腺蛋白类亲脂素B(LPB、LPHB、也称为抗原BU101、分泌球蛋白家庭1-D成员2，SCGB1-D2)；乳腺球蛋白2(MGB2；也称为乳腺球蛋白B、MGBB、Lacryglobin(LGB)亲脂素C(LPC、LPHC)，分泌球蛋白家庭2A成员1、或SCGB2A1)；乳腺球蛋白(MGB；也称为乳腺球蛋白1，MGB1、乳腺球蛋白A、MGBA、分泌球蛋白家庭成员2A成员2、或SCGB2A2)；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(Maspin，也称为丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂分支B(卵清蛋白)成员5、或SERPINB5)；前列腺上皮特异性Ets转录因子(PDEF；也称为不育阿尔法基序指向域-包含ets转录因子、或SPDEF)；肿瘤相关钙信号传导蛋白1(也称为大肠癌抗原CO17-1A、上皮糖蛋白2(EGP2)、40kDa的上皮糖蛋白(EGP40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、上皮特异性抗原(ESA)，胃肠道肿瘤相关抗原733-2(GA733-2)、KS1/4抗原、染色体4表面标记物1的膜成分(M4S1)、MK-I抗原、MIC18抗原、TROP-1抗原、或TACSTD1)；端粒酶逆转录酶(也称为端粒酶催化亚基、或TERT)；三叶因子1(也称为乳腺癌雌激素诱导序列、BCEI、胃肠三叶蛋白、GTF、pS2蛋白、或TFF1)；叶酸；或三叶因子3(也称为肠三叶因子、ITF、p1.B；或TFF3)的抗体。
涉及稀有颗粒如蛋白质、核酸或细胞时，术语"特异性(或选择性)结合"抗体或"特异性(或选择性)与……免疫反应"指能在粒子和其它生物物质的异质群体中确定是否存在该稀有颗粒的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，指定抗体与特定稀有颗粒的结合至少为背景的两倍，更典型地是背景的10-100倍以上。在这些条件下与抗体特异性结合需要选择对特定粒子特异性的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与选定抗原特异性免疫反应而不与其它蛋白质反应的哪些多克隆抗体。可通过消减与其它分子交叉反应的抗体来实现该选择。
在一个方面，本发明提供了用于探测样本液体中一个或多个生物颗粒的方法；所述方法包括：a)询查所述样本液体的一个或多个液份；b)在单个测量中，探测在所述一个或多个液份的每一个中所述一个或多个稀有生物颗粒的存在或不存在，其中，所述一个或多个液份中的至少一个含有多个生物颗粒；以及c)基于所述一个或多个稀有颗粒的存在或不存在而分级所述液份。在特定实施例中，稀有生物颗粒是细胞。在特定实施例中，稀有生物颗粒是荧光标记的细胞。
在此处所提供的方法的一些实施例中，在单个测量中探测多个参数。在特定实施例中，多个参数是不同的荧光颜色。
在此处所提供的方法的特定实施例中，通过添加防止样本中包括所述生物颗粒或其组合物的细胞凝结的抗凝血剂、混合物来稳定样本液体。
在一些实施例中，液份分级是二元的，例如如果液份未含有稀有颗粒则分配值“0”，如果含有的话，则分配值“1”。在其他实施例中，分级是非二元的，例如，基于在液份中出现的稀有颗粒的数量而分配值，或者样本中稀有颗粒的特性而分配值。在特定实施例中，用计算机和代表分级算法的软件来执行分级。
在一些实施例中，此处提供的方法还包括基于液份的分级而使液份在不同通道的步骤。例如，基于分配给液份的值而引导所述液份的流动或收集。在特定实施例中，通过使用外部场(field)或通过创建流动分布而实现这一点。
在特定实施例中，所述方法可包括使用类似所述分级通过收集和/或汇聚液份来集中所述稀有颗粒。
在此处提供的方法的一些实施例中，稀有颗粒选择以下细胞构成的组：癌细胞、癌干细胞、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、感染疟疾的红血球、淋巴细胞、白血球、胎细胞、干细胞和感染朊病毒的细胞。
在另一个方面，本发明提供了用于探测样本液体中一个或多个生物颗粒的设备；所述设备包括：a)用于探测在所述一个或多个液份的每一个中的一个或多个稀有生物颗粒的存在会不存在的一个或多个探测器，其中所述一个或多个液份中的至少一个含有多个生物颗粒；以及b)带有用于基于所述一个或多个稀有颗粒的存在或不存在而分级所述液份软件的计算机。在一个实施例中，所述分级是二元的。在其他实施例中，其中所述设备被用于探测多个类型的生物颗粒，所述分级是非二元的。
在特定实施例中，所述设备可进一步包括多个通道，用于基于所述分级而引导所述液份。在具体实施例中，用抗凝血剂复合物、优先结合至(bind to)稀有颗粒的复合物、防止生物颗粒凝结的复合物或其组合来处理所述通道。
在特定实施例中，所述设备可进一步包括用于追踪并操作所述生物颗粒的轨迹的电极。在其他实施例中，所述设备可进一步包括用所附的磁性颗粒来分离生物颗粒的磁性元件。在还有其他实施例中，所述设备可进一步包括用于追踪并操作所述生物颗粒的轨迹的声学元件。
在此处提供的设备和装置的特定实施例中，所述设备包括选自以下的一个或多个探测器：照相机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、雪崩二极管(APD)、单光子雪崩二极管(SPAD)或者互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。
在此处提供的设备和装置的特定实施例中，所述设备可进一步包括用于询查所述样本液体的一个或多个液份的一个或多个源。例如，电磁辐射源。在具体实施例中，用于询查的一个或多个源选自：激光器(固态、二极管泵浦、离子或染色)、发光二极管(LED)、灯、电弧放电、磁性脉冲或自然光。在还有其他实施例中，当生物颗粒表现出诸如化学发光或生物发光之类的发光的时候，不需要用于询查液份的源。
III.具体实施方式
A.探测方法
在一个方面中，本发明提供了了用于探测液体样本中稀有颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：(a)探测所述液体样本的液份中稀有颗粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有颗粒的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。
在一个实施例中，探测所述稀有颗粒的存在的步骤包括如下子步骤：(i)在适于将探测试剂转换为包括所述探测试剂和稀有颗粒的混合物的状况下使所述液体样本与探测试剂接触；以及(ii)在液体样本的液份中探测在步骤(i)中所形成的混合物的存在或不存在。
在特定实施例中，探测试剂可包括标记的或未标记的抗体、抗原结合片段、适体、聚合物、纳米颗粒、微珠、荧光抗体、磁性纳米颗粒、聚合物分子、染料分子、适体、液体分子、蛋白质分子等。
在另一个实施例中，探测所述稀有颗粒的存在的步骤包括如下子步骤：(i)用电磁辐射的外部源来询查所述液份；以及(ii)探测所述稀有颗粒的荧光。
在一个实施例中，所述稀有颗粒可包括荧光标记的细胞。在特定实施例中，荧光标记的细胞可包括表达荧光蛋白的细胞、或者已经用荧光探测试剂标记的细胞。例如，急促地或稳定地表达红色或绿色荧光蛋白的细胞。
在还有另一个实施例中，其中稀有颗粒表现出固有的化学发光或生物发光，探测稀有颗粒存在的步骤包括探测所述稀有颗粒的生物发光或化学发光。
在特定实施例中，所述稀有颗粒可以是细胞、蛋白质、蛋白质络合物、核酸、核蛋白复合体、碳水化合物、代谢物、新陈代谢作用之副产物等。在特定实施例中，所述稀有颗粒是细胞。在具体实施例中，细胞可以是癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、癌干细胞、表现出癌表面抗原的癌细胞，例如，选自以下组成的组：CD44,CD2,CD3,CD10,CD14,CD16,CD24.CD31,CD45,CD64,CD140b或其组合。
通过灌注可选择地联结上生物标记的其他试剂，癌干细胞可区别于普通的癌细胞，它们可包括但不限于CD44,CD2,CD3,CD10,CD14,CD16,CD24.CD31,CD45,CD64或CD140b。
在特定实施例中，其中所述稀有颗粒是癌细胞，液份中被标识为具有稀有细胞的细胞将被进一步个别地仔细研究。例如，这些细胞可被进一步经由传统的流式细胞计数仪或eDAR而分开或分类，且可剖析期望的细胞来理解操作细胞机制的起源。可单独地分析每一个细胞中的内容，DNA、RNA、DNA序列、代谢物、脂质、碳水化合物、蛋白质内容等。
在其他实施例中，稀有细胞可以是寄生细胞或器官，例如，贾第鞭毛虫属或似隐孢菌属的种类、感染了原形体种类的红血球、感染了HIV的淋巴细胞或白血球、母血中的胎细胞、干细胞、感染了朊病毒的细胞、CD4+T-细胞等。
在一个实施例中，液体样本可包括多于一个类型的稀有颗粒，例如2,3,4,5,6,7,8,9,10种或更多类型的稀有颗粒。相应地，在特定实施例中，液体样本同时地接触多个可区分的探测试剂，每一个探测试剂在足以将多个探测试剂转换为包含探测试剂和多个稀有颗粒的混合物的状况下具有不同特异性。在一些实施例中，同时地探测多个混合物，例如，通过使用包括多于一个的询查设备和/或多于一个探测设备的eDAR装置。
例如，在有两个稀有颗粒需要被同时探测的情况下，每一个稀有颗粒可接触可区分的探测试剂，每一个探测试剂可被两个探测设备中的一个所探测。进一步，其中所述探测试剂包括荧光分子部分、两个询查设备(如，产生对应于不同荧光分子部分的激发波长的不同波长的辐射的两个激光器)可被使用，且通过两个不同的探测设备可探测分别得荧光辐射。相应地，在一个实施例中，通过不同波长的荧光，探测试剂是可区分的。
在还有另一个实施例中，可连续地探测两个或更多的稀有颗粒。例如，在一个实施例中，所述方法可包括在eDAR装置的第一位置处探测第一稀有颗粒，在eDAR装置的第二位置处探测第二稀有细胞。以这个方式，存在第一和第二颗粒的液份可在第一探测步骤之后、在第二探测步骤之后、或者在两个探测步骤之后被引导。
在本发明的特定实施例中，来自细胞整体的特性的探测可以是同时的或者随时间累积的。例如，特性的探测可马上从含有生物颗粒整体的大的液份中马上(“同时”)地发出。
在特定实施例中，其中以同时的方式来执行方法，所述生物颗粒可由可变速度的液流来携载。作为示例，当生物颗粒穿过探测体的时候，可以稳定的流动来携载生物颗粒。可选地，当细胞穿过探测体的时候，可停止、减速或加速流动。可用以下中的一个来在探测体的上游或下游调节流动：阀门、外罩、电场、磁场、光场、气源压力、固态颗粒、薄膜、不溶的液滴、重力差分、或者用来改变通道的表面张力的镀层。
在此处提供的方法的一些实施例中，在液体样本连续地流经流动通道的过程中执行探测步骤。在特定实施例中，独立的液份并不是物理地分隔的，而是通过光探测步骤定义的，也就是，液份可被定义为在探测发生的时刻在探测体中呈现的颗粒的整体。
在特定实施例中，探测事件以常规频率发生，这取决于探测体的大小和液体样本的流速。例如，如果特定装置的探测体是10μL且液体样本以100μL/秒的速度流过所述装置，将以每0.1秒，或者10Hz的速度来探测不同的液份。
在特定实施例中，取决于装置的几何形状和将要被处理的液体的量，分离的液份以0.1kHz到100MHz之间的速率通过探测体。在另一个实施例中，分离的液份以约10Hz到约10MHz之间的速率穿过探测体。在另一个实施例中，分离的液份可以约0.1kHz到约100MHZ之间的频率穿过探测体，或者在约1kHz到约10MHZ之间、约1kHz到约5MHZ之间、约1kHz到约1MHZ之间。在特定实施例中，液份穿过探测体的频率可至少在约0.1kHz、或者至少在约0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,125,150,200,250,300,400,500,600,700,800或900kHz，或者至少约1MHz、或者在至少约2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90或100MHz。
在此处提供的方法的其他实施例中，对来自细胞整体的特性的探测可随着时间而从小的探测体发出(“累积的”)，该探测体是单个细胞数量级的，但是在流动的帮助下有多个细胞经过该探测体。eDAR的累积模式区别于从单个生物颗粒发出的相继的信号或帧的延时覆盖(time-lapse overlay)；单个生物颗粒的延时覆盖并不组成生物颗粒的整体。在同时的模式和累积的模式二者中，仅在探测到来自细胞整体的特性之后才呈现决策。
在此处提供的方法的还有其他实施例中，在探测之前可物理地分离液份。这可通过例如，通过空气或连续的不溶于油的液相将样本液体分离为分离的水性液份，例如，分为液滴。
在一个实施例中，用于分离液份的不溶的相可包括有机相、油、诸如矿物油和黄豆油之类的自然油、诸如AR-20,AS-4之类的硅油、PDMS油、诸如Fluorinert和全氟萘烷之类的氟化油、诸如十六烷和乙酰苯之类的有机溶剂、蜡、空气或气体。
在特定实施例中，不溶的相可以是连续的(也就是，整体地围绕着分离的液份)或者是分段的(也就是，仅占有分离的液份之间的间隔而不是完整地围绕着液份)。
例如，图16示出整体地围绕着分离的液份的不溶的相(1642)。
在一个实施例中，分离的液份是液滴。在另一个实施例中，分离的液份是栓体(plug)。
在一个实施例中，分离的液份可在与流动通道流体相通的流动通道中被相继地形成在eDAR装置上。
在特定实施例中，分离的液份可被形成在eDAR外部，但是经由管、接口或与流动通道流体相通的互连而流入该装置的流动通道中。
在一个实施例中，可将表面活性剂添加到细胞悬浮液或不溶的相中来稳定分离的液份。表面活性剂可包括白蛋白(牛或人血清白蛋白)、司盘80、普流罗尼克、八乙二醇一癸醚、四乙二醇一癸醚、诸如3-(N,N-二甲基十二烷铵)丙烷磺酸盐(DDAPS)之类的两性离子表面活性剂、诸如二辛基磺基丁二酸钠(AOT)之类的阴离子表面活性剂、诸如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)之类的阳离子表面活性剂和硅基、PEG化和氟化表面活性剂。
在还有另一个实施例中，液体样本可被分为液份且在探测步骤之前，被物理地分在eDAR装置的不同的流动通道或腔体中。然后可并行地(也就是，同时使用多个探测设备或单个探测设备)或相继地(例如，通过引导独立的液份继续地通过一个或多个探测体)执行接下来的探测步骤。
在本发明的一些实施例中，液体样本，例如，生物学液体样本，在探测稀有颗粒之前可被稳定。在特定实施例中，可用试剂来稳定液体，所述试剂包括但不限于，抗凝剂，诸如柠檬酸盐、肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己二胺四乙酸(DCTA)或乙二醇双四乙酸(EGTA)；乙醛，诸如亚甲醇、甲醛、双咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、六亚甲基四胺、多聚甲醛、戊二醛或乙二醛等的氨化物或氨基化合物的羟甲基衍生物。
在本发明的还有其他实施例中，此处提供的方法可被进一步与在分通道(channeling)所期望的液份之后发生的次级过程相连接。可与此处提供的方法相连接的过程和/或功能的示例包括，例如，标识细胞内容(如，DNA、RNA、小RNA、脂质、代谢物、碳水化合物或细胞内包裹的蛋白质)的选择性反应。这些反应包括聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、等温PCR、确定DNA的外遗传状态的反应、确定小RNA和siRNA内容的单分子杂交反应或者适体(DNA的短链)选择性反应。
在特定实施例中，此处提供的方法可进一步与液份或细胞分离之后的实验方案相连接。可与此处提供的方法相连接的实验的非限制性示例包括基于核酸的方法，诸如RNA提取(带有或没有扩增)、cDNA合成(逆转录)、基因微阵列、DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)(单个、嵌套式、实时定量或接头引物)或者DNA甲基化分析；细胞术方法，诸如荧光原位杂化(FISH)、激光捕获微分析、流式细胞计数仪、荧光激活的细胞分选(FACS)、细胞培养或比较基因组杂交(CGH)研究；化学实验方法，诸如电泳、Southern印迹分析或酶联免疫吸附实验(ELISA)；确定小RNA和siRNA内容的实验；确定DNA/RNA内容的实验；确定脂质内容的实验；确定碳水化合物内容的实验；确定代谢物内容的实验；确定蛋白质内容的实验；以及功能细胞实验(如，细胞凋亡实验、细胞迁移实验、细胞增殖实验、细胞分化实验等)等。
在还有另一个实施例中，此处提供的方法可还与流式细胞计数仪相连接，例如，进一步分开或分离在所选的液份中出现的稀有颗粒。在一个实施例中，此处提供的方法所使用的eDAR的通道可与流式细胞计数仪流体相通。在特定实施例中，eDAR和流式细胞计数仪的连接容许所选择的液份被进一步检查或连续地归类来丰富稀有颗粒或细胞的量。在此处提供的方法的特定实施例中，这个配置容许上游对稀有颗粒或细胞的粗略归类，且在仅引导含有稀有颗粒或细胞的液份进入下游过程，所述下游程序诸如流式细胞计数仪，其是费时、高成本和/或劳动密集的。
在特定实施例中，可使用此处提供的eDAR装置来执行此处提供的方法。
1、有利特征
如上所述，部分地由于对全部液份(而不是单个的细胞或颗粒)的整体探测和分级，eDAR技术相比传统的目前使用的流式细胞计数仪方法更快速且更为价廉。一些特征对于改进的eDAR方法有帮助。
例如，在此处提供的方法的一个实施例中，液份包括多于单个的颗粒、细胞或荧光实体。在这个方面，可同时询查含有多个细胞或颗粒而不是单个细胞或颗粒或者1维细胞或颗粒层的分离的体。
在此处提供的方法的相关的实施例中，液体的颗粒或细胞不需要连续地(也就是没有重叠出现地一个接着另一个)进入探测点或探测体。在相关的实施例中，颗粒不需要以单行或层来进入探测点或探测体。相应地，在此处提供的方法的一个实施例中，单个液份中的多个生物颗粒，可同时可通过流动通道的横截面或横截体，例如，询查和/或探测体。
在此处提供的方法的一个实施例中，不需要套流、引导缓冲或其他碳水化合物或几何聚焦机制来使生物颗粒集中为单行用于询查和/或探测。
在此处提供的方法的一个实施例中，采用全部液份的分级方案或值分配方案，而不是分类单个生物颗粒。
在此处提供的方法的一个实施例中，同时地探测颗粒或细胞的整体，例如作为更大的液体样本中的单个液份。在相关的实施例中，对于液份的确定影响包含在液份中的颗粒或细胞的整个整体。在还有另一个相关的实施例中，在液份中被同时地探测的颗粒或细胞的整体将保持为颗粒或细胞的整体。
2、液份分级
在此处提供的方法的一个实施例中，如果该液份含有稀有颗粒则分配第一值给该液份，或者如果该液份没有含有稀有颗粒则分配第二值给该液份。在具体实施例中，分级(也就是，值的分配)是二元的。例如，含有至少一个稀有颗粒的每一个液份被分配为值1，而没有含有稀有颗粒的每一个液份被分配为值0。
在此处提供的方法的另一个实施例中，根据液份中出现的稀有颗粒的量而分配值给液份。例如，含有4个稀有颗粒的液份可被分配为值4。可选地，含有4颗粒的液份可根据稀有颗粒量的特定范围而被分配值，所述范围例如0到5个颗粒、1到10个颗粒、4到6个颗粒，等。
在此处提供的方法的还有另一个实施例中，其中在单个液体样本中出现多于一个类型的稀有颗粒，根据液份中任何稀有颗粒的识别性(identity)来分配值给液份。例如，其中液体样本含有两个稀有颗粒，A和B，既没有含有A也没有含有B的液份可被分配为值0，仅含有A的液份可被分配为值1，仅含有B的液份可被分配为值2，既含有A又含有B的液份可被分配为值3。相应地，在此处提供的方法的一个其中在单个液体样本中出现多于一个类型的稀有颗粒的实施例中，分级(也就是，值的分配)不是二元的。
在特定实施例中，分配的非空的值可取决于稀有颗粒的识别性或者稀有颗粒的浓度。
在特定实施例中，具有同样的被分配的值的多个液份可被聚集或引导在一起。
在本发明的方法的一个实施例中，需要主动性的决定来分级或分配值给液份。在特定实施例中，使用计算机、控制器、带有集成电路的芯片、电路板、电子元件、软件和/或算法来分级或分配值给液份。
3、液份引流和液体流动
在本发明的特定实施例中，基于分配给液份的值而引导液份的流动或收集。例如，在液体样本中出现单个类型的稀有颗粒的实施例中，可引导被分配了空或“0”值的液份到第一通道(被引导)或废弃出口，而被分配了正的或“1”值的液份可被引导到第二通道或收集腔体中。
在本发明的其他实施例中，其中在液体样本中出现了多于一个类型的稀有颗粒，可基于液份中出现的稀有颗粒的具体成分而引流液份。在一个实施例中，没有含有稀有颗粒的液份可被引导到第一通道或废物出口，含有第一种类型的稀有颗粒的液份可被引导到第二通道或第一收集腔体中，含有第二种类型的稀有颗粒的液份可被引导到第三通道或第二收集腔体中。
在特定实施例中，含有多于一种类型的稀有颗粒的液份可被引导到特定流动通道或收集腔体中。可选地，可引导液份到混合或稀释腔体中，接着被混合或被稀释的液份可被进一步分为子液份，这样稀有细胞被分入到不同的子液份中。然后可再次探测子液份中的稀有细胞，这样可将稀有细胞彼此分开。
在此处提供的方法的一个实施例中，可通过使用外部场或通过创建流动分布来执行引流的步骤(也就是，引导液份的流动或收集)。
在本发明的一个方面中，一旦液份被分级，可使用外部场来改变液份方向。场可被包括电场、磁场、动电、电泳、介电泳、水力、重力、风力或光学力。可选地，可引入不与细胞悬浮液相溶的物质(诸如空气、不相溶的有机液体或微珠)来减少外部的流动分布。
在特定实施例中，可由例如，引起液压的方法和设备来传递流动，这些方法和设备包括但不限于那些在机械原理(如，外部注射泵、气动薄膜泵、振动薄膜泵、真空设备、离心力和毛细管作用)；电或磁原理(如，电渗流动、动电泵压电/超声波泵、磁流体插头、电流体力学泵和磁流体力学泵)；热力学原理(如，气泡发生/减少相改变量扩增)；表面湿润原理(如，电湿润、化学地、热力地和减少放射性地表面张力梯度)等基础上操作的方法和设备。
在还有其他实施例中，通过重力反馈、表面张力(像校准动作)、静电力(动电流动)、离心流动(设置在光盘上的基体并转动)、磁性力(震荡离子导致流动)、磁流体力合真空或压力差而传递或引流液体。
在特定实施例中，液体流动控制设备，诸如那些相关于引起液压或液体驱动力的方法和设备而列举的液体流动控制设备，可连接至本发明主题的入口接口或出口接口。在一个示例中，在入口和出口的一个或两个处设置多个接口，并且一个或多个接口连接至液体流动控制设备。
B、诊断和预后方法
在一个方面中，本发明提供了对于相关于液体样本中稀有颗粒的存在相关联的状况，用于提供对象诊断或预后的方法，所述液体样本例如是生物学液体，诸如血液样本。
在一个实施例中，所述方法包括如下步骤：(a)探测所述生物学液体的液份中稀有颗粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有颗粒的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。
在另一个实施例中，所述方法包括如下步骤：(a)在适于将探测试剂转换为包括所述探测试剂和稀有颗粒的混合物的状况下使来自对象的生物学液体与探测试剂接触；(b)在生物学液体的液份中探测在步骤(a)中所形成的混合物的存在或不存在；(c)基于在步骤(a)中形成的混合物的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(d)基于所分配的值而提供诊断或预后给所述对象。
在另一个实施例中，探测所述稀有颗粒的存在的步骤包括如下子步骤：(i)用电磁辐射的外部源来询查所述液份；以及(ii)探测所述稀有颗粒的荧光。
在100多年前，物理学家已知癌症是由脱落细胞进入血液而扩散的。随着血液携载这些癌细胞从一个器官到另一个器官，癌症转移。这些脱落的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(CTC)。在一个方面，本发明提供用于从周边血中计数和分离这些癌细胞的准确的方法。
血液中对于CTC的准确探测被证明是非常困难的，因为还存在着无法估计数量的红和白血球。多到50亿红血球和5百万白血球共存才能找到单个CTC，探测CTC的问题相当于逐个在干草堆中找针。
通过准确地计数血液中癌细胞的数量，本发明提供对于癌扩散过程的实时快照。CTC血液测试与传统预后工具(如，淋巴节点的状态、肿瘤尺寸和形态特征)的最大的不同之处在于可使用CTC血液测试来提供关于癌症治疗是否有效的早期反馈。经受6个月化疗的病人可每3-4周测量他们的CTC计数；如果计数维持为高，肿瘤学家可相信现在的治疗是无效的并开出新的药物。从病人的角度而言，进行CTC测试可(1)通过免除无效的化疗而提供很大的节省，这种无效的化疗可能需要每种药物约$3,000-$10,000/月的花费，(2)给他们珍贵的机会在太晚之前寻找到有效的治疗。单凭这些理由就足够重要到让肿瘤学家常规地处方昂贵的放射成像扫描(如，CT或MRI)。然而，在一个方面，本发明提供了快速、价廉的CTC测试，它较便宜、更安全、更可重现、且快于放射成像扫描六周提供了同样的，或者是更准确的，预后信息。目前没有可用的生物标记测试提供类似的优势。
由于探测的癌细胞的高度敏感性，此处描述的方法提供了在癌细胞的浓度达到竞争技术的较低探测极限之前探测癌细胞的潜在。这意味着此处提供的方法能相比竞争技术更早地获得有意义的结果。因此，并不是将本技术的使用限制在阶段IV的转移癌，肿瘤学家可将其使用向早期的诊断(也就是，阶段III、阶段II、阶段I或转移的、或癌症之前的)扩展，例如，通过周期性地处方此处提供的方法用于那些还没有表现出癌症症状的一般公众。一般地，健康的人血液中没有任何CTC；如果使用本发明在没有疑似的病人中探测到任何CTC，那么可指定进一步的测试(如，CT、MRI)来定位肿瘤病确认状态。
在另一个实施例中，使用本发明分离出的肿瘤细胞可被进一步经受分组分析(如，根据基因型或显型)来研发出靶向治疗。作为示例，被分离出的肿瘤细胞可与结合至特定药物靶点上的荧光抗体一起培养来确定药物靶点的存在或表达的程度。一旦确定了药物靶点的表达，肿瘤学家可确保从靶项为该表达而特别研发的药物中选择。在一个示例中，被分离出的肿瘤细胞可与特定结合至Her2受体上的荧光抗体一起培养来确定乳腺肿瘤脱落的CTC是否是Her2-阳性。如果经分离的肿瘤细胞表现出较高的Her2表达，肿瘤学家可指定Herceptin(曲妥珠单抗)，因为这个药物是被设计为靶向并阻碍HER2蛋白质过表达的功能。其他已知的药物靶点，包括BCR-ABL或PDGFR(由药物Gleevec靶向)、ERBB2(由Herceptin靶向)、EFGR(由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-阿尔法(由ATRA靶向)、雌激素受体(由Tamoxifen靶向)、芳香酶(由Letrazole靶向)、男性激素受体(由Flutamide、Biclutamide靶向)、CD20(由Rituximab靶向)、VEGF-受体(由Avastin靶向)，也可类似地在指定合适的化疗方案之前，从被分离的肿瘤细胞中筛选出来。
在具体实施例中，稀有颗粒是癌细胞或循环肿瘤细胞(CTC)。在其他实施例中，稀有细胞是寄生细胞或器官，例如，贾第鞭毛虫属或似隐孢菌属的种类、感染了原形体种类的红血球、感染了HIV的淋巴细胞或白血球、母血中的胎细胞、干细胞、感染了朊病毒的细胞、CD4+T-细胞等。
在一个实施例中，提供了用于诊断疟疾的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置来探测感染了疟原虫的红血球。
在一个实施例中，提供了用于诊断HIV感染的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置来探测感染了HIV的淋巴细胞或白血球。
在还有另一个实施例中，提供了用于诊断与朊病毒相关联的疾病的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置从来自人类或其他动物(如，牛)的生物液体中探测先兆(prior)。在一个实施例中，与朊病毒相关联的疾病是疯牛病。
1、诊断癌症
在一个具体实施例中，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置在来自对象的血液样本中探测循环肿瘤细胞。在特定实施例中，对象是之前被诊断为阶段I、阶段II、阶段III或阶段IV癌症的病人。在特定实施例中，其中在来自之前被诊断为癌症的病人的血液样本中探测到CTC，病人可能进一步被诊断为转移癌。
在一个实施例中，提供用于为之前被诊断为固体肿瘤的对象诊断转移癌的方法，所述方法包括如下步骤：(a)在来自对象的血液样本的液份中探测CTC的存在或不存在；(b)基于所述CTC的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。在一个实施例中，血液样本中CTC的不存在相关于对象不具有转移癌。在另一个实施例中，血液样本中至少一个CTC的存在相关于对象具有转移癌。在还有另一个实施例中，血液样本中至少参考数量个CTC的存在相关于对象具有转移癌。在一些实施例中，所述方法可进一步包括步骤(d)如果在血液样本中没有探测到CTC，诊断对象为不具有转移癌，或者，如果在血液样本中探测到至少一个CTC，诊断对象为具有转移癌。
在相关实施例中，提供了用于监测被诊断为癌症的对象，包括使用此处提供的eDAR方法在来自对象的血液样本的液份中探测CTC的存在或不存在。在特定实施例中，可定期监测病人看癌症到转移癌的过程，例如，一年至少一次、一年至少两次，或者每年至少约3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。在一些实施例中，可监测对象至少一个月一次，或者一个月至少约2，3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。在一个实施例中，血液样本中CTC的不存在相关于对象不具有转移癌。在另一个实施例中，血液样本中至少一个CTC的存在相关于对象具有转移癌。在还有另一个实施例中，血液样本中至少参考数量个CTC的存在相关于对象具有转移癌。在一些实施例中，所述方法可进一步包括步骤(d)如果在血液样本中没有探测到CTC，诊断对象为不具有转移癌，或者，如果在血液样本中探测到至少一个CTC，诊断对象为具有转移癌。
对于在血液样本中探测到CTC的实施例，所述方法可进一步包括对被标识为含有CTC的一个或多个液份加以进一步分析而标识这个CTC细胞或多个CTC细胞的一个或多个特性。例如，含有CTC的液份或一组液份可被与对一个或多个癌症特定的表面活性剂而专用的一个或多个探测试剂相接触。通过确定哪些癌症特定的活性剂呈现在CTC表面，可设计治疗来靶向所表达的表面活性剂。可被化验的癌症特定的表面活性剂的非限制性示例，包括，但不限于BCR-ABL或PDGFR(由药物Gleevec靶向)、ERBB2(由Herceptin靶向)、EFGR(由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-阿尔法(由ATRA靶向)、雌激素受体(由Tamoxifen靶向)、芳香酶(由Letrazole靶向)、男性激素受体(由Flutamide、Biclutamide靶向)、CD20(由Rituximab靶向)、VEGF-受体(由Avastin靶向)等。相应地，在特定实施例中，该方法可进一步包括基于呈现在CTC上的特定表面活性剂的探测而为对象分配靶向治疗的步骤。
在特定实施例中，可使用此处提供的eDAR方法来执行进一步的分析，例如在适于将探测试剂转换为带有呈现在CTC表面上的癌症特定活性剂的混合物的状况下将所聚集的液份和多个不同标签的探测试剂相接触，并使用多个探测设备探测该混合物。
在其他实施例中，进一步分析可通过将初步的eDAR方法和传统的流式细胞计数仪或免疫化学方法(如，免疫印记、ELISA、xMAP多种分析，等)结合起来执行。在特定实施例中，用于探测CTC的eDAR设备可与用于执行进一步分析的第二设备或装置流体相通。
在被诊断为转移癌的对象的实施例中所述方法可还包括为对象分配用于转移癌的治疗。
在还有一个具体实施例中，提供了用于诊断有癌的对象的方法，所述方法包括从取自对象的血液样本中探测CTC。例如，在来自之前没有被诊断为癌症的对象的血液样本中探测CTC。在一些实施例中，对象可能有得癌症或癌症发展的高风险，例如，对象可具有癌症家族史、是抽烟者、或者已经暴露给致癌物(也就是，石棉、苯、镉、氡、放射能等)。
这样，在特定实施例中，提供了用于监测之前没有被诊断为癌症的对象的方法，所述方法包括如下步骤：(a)在来自对象的血液样本的液份中探测CTC的存在或不存在；(b)基于所述CTC的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。在一个实施例中，血液样本中CTC的不存在相关于对象不具有转移癌。在另一个实施例中，血液样本中至少一个CTC的存在相关于对象具有癌症。在还有另一个实施例中，血液样本中至少参考数量个CTC的存在相关于对象具有癌症或转移癌。在一些实施例中，所述方法可进一步包括步骤(d)如果在血液样本中没有探测到CTC，诊断对象为不具有癌症，或者，如果在血液样本中探测到至少一个CTC，诊断对象为具有癌症。
在特定实施例中，可如上所述地执行探测CTC的存在或不存在的步骤，例如，通过(i)在适于将探测试剂转换为含有所述探测试剂和稀有颗粒的混合物的状况下将来自对象的生物液体和探测试剂接触；以及(ii)在生物液体的液份中探测在步骤(i)中形成的混合物的存在或不存在，或者通过(i)用电磁辐射的外部源来询查所述液份；以及(ii)探测所述稀有颗粒的荧光。
2、用于提供预后的方法
在一个方面中，本发明提供了用于对与生物液体中稀有颗粒的存在相关联的疾病或状况的诊断的方法。在一个实施例中，所述方法包括如下步骤：(a)探测来自对象的生物样本的液份中稀有颗粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有颗粒的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集；以及(d)如果在样本中没有探测到稀有颗粒则提供好的预后，或，如果在样本中探测到稀有颗粒则提供不佳的预后。
在其他实施例中，基于液份中稀有颗粒的量或特性而分配值给液份。在这些实施例的特定实施例中，就样本中稀有颗粒的量而提供好的或不佳的预后。例如，在一个是示例中，如果在样本中稀有颗粒的量小于预确定的参考值，则提供好的预后，而如果在样本中稀有颗粒的量等于或大于预确定的参考值，则提供不佳的预后。
在特定实施例中，预确定的参考值可相关于对特定治疗有所反应的可能性，或者整体存活或无疾病存活一段时间(例如至少6个月或者至少1年、2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多年)的可能性。
在特定实施例中，可如上所述地执行探测稀有颗粒的存在或不存在的步骤，例如，通过(i)在适于将探测试剂转换为含有所述探测试剂和稀有颗粒的混合物的状况下将来自对象的生物液体和探测试剂接触；以及(ii)在生物液体的液份中探测在步骤(i)中形成的混合物的存在或不存在，或者通过(i)用电磁辐射的外部源来询查所述液份；以及(ii)探测所述稀有颗粒的荧光。
在特定实施例中，可使用此处提供的方法来提供对于与稀有颗粒相关联的任何疾病的预后。在一个实施例中，提供了用于疟疾的预后的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置从来自个体的血液样本中探测感染了疟原虫的红血球的数量，并且如果在血液样本中探测到的受感染的红血球的全部数量小于预确定的参考值的话则提供好的预后，或者，如果在样本中探测到的受感染的红血球的全部数量等于或大于预确定的参考值的话则提供不佳的预后。
在另一个实施例中，提供了用于HIV感染的预后的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置从来自个体的血液样本中探测感染了HIV病毒的淋巴细胞或白血球的数量，并且如果在血液样本中探测到的受感染的细胞的全部数量小于预确定的参考值的话则提供好的预后，或者，如果在样本中探测到的受感染的细胞的全部数量等于或大于预确定的参考值的话则提供不佳的预后。
在还有另一个实施例中，提供了用于和朊病毒相关联的疾病的预后的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置从来自个体的生物液体样本中朊病毒的数量，并且如果在样本中探测到的朊病毒的全部数量小于预确定的参考值的话则提供好的预后，或者，如果在样本中探测到的朊病毒的全部数量等于或大于预确定的参考值的话则提供不佳的预后。
在特定实施例中，预确定的参考值可相关于对特定治疗有所反应的可能性，或者整体存活或无疾病存活一段时间(例如至少6个月或者至少1年、2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多年)的可能性。
在特定实施例中，本发明提供了用于为被诊断为固体肿瘤的对象提供预后的方法。在一个实施例中，所述方法包括如下步骤(a)在来自对象的血液样本的液份中探测CTC的存在或不存在；(b)基于所述CTC的存在或不存在而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集；以及(d)如果没有探测到CTC，则提供好的预后，或者，如果探测到CTC则提供不佳的预后。
在另一个实施例中，提供了为诊断为转移癌的对象提供预后的方法，所述方法包括如下步骤(a)在来自对象的血液样本的液份中探测CTC的存在或不存在；(b)基于在液份中探测到的CTC的数量分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集；以及(d)如果血液样本探测到的CTC的全部数量小于预确定的参考值，则提供好的预后，或者，如果血液样本探测到的CTC的全部数量等于或大于参考值则提供不佳的预后。
在特定实施例中，预确定的参考值可相关于对特定治疗有所反应的可能性，或者整体存活或无疾病存活一段时间(例如至少6个月或者至少1年、2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多年)的可能性。
3、监测疾病发展或对治疗的反应
在另一个方面，本发明提供用于监测疾病的发展或对治疗的反应的方法，所述方法包括使用此处提供的eDAR方法和/或装置探测液体样本中的稀有颗粒。
在一个实施例中，所述方法包括如下步骤：(a)探测在第一时间取自对象的第一生物样本的多个液份中稀有颗粒的存在或不存在；(b)基于所述稀有颗粒的存在、不存在、量或识别性而分配值给所述液份；(c)确定来自第一样本的所有液份的总体值；(d)探测在第二时间取自对象的第二生物样本的多个液份中稀有颗粒的存在或不存在；(e)基于所述稀有颗粒的存在、不存在、量或识别性而分配值给所述液份；(f)确定来自第二样本的所有液份的总体值；以及(g)比较分配给第一样本的总体值和分配给第二样本的总体值，其中当与第一样本比较的时候，分配给第二样本的增加的值相关于疾病的进展和/或对于治疗的不佳的反应，和/或，当与第一样本比较的时候，分配给第二样本的下降的值相关于疾病的衰退和/或对于治疗的好的反应。
在特定实施例中，可进一步基于为收集所分配的值而引导液份到特定通道或腔体(带有通道的)中，进一步浓缩、或进一步分析。
在特定实施例中，在疾病诊断或治疗方案开始之后可有规律地采用监测疾病进展或对于治疗的反应的方法。例如，可从对象处至少一年一次、至少一年两次收集样本，或者一年至少约3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。在一些实施例中，可监测对象至少一个月一次，或者一个月至少约2，3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。
在特定实施例中，其中发现了疾病的进展或对于治疗的不佳的反应，该方法可进一步包括如下步骤：分配治疗、增加剂量方案、改变治疗方案等。
在特定实施例中，与稀有颗粒相关联的疾病或状况可以是癌症、疟疾、HIV/艾滋、与朊病毒相关的疾病等。
C、监测水质的方法
在另一个方面中，本发明提供了使用此处提供的eDAR方法或装置，通过探测水样本中的一个或多个稀有颗粒污染物来监测水质的方法。
在一个实施例中，所述方法包括如下步骤(a)在取自水源的样本的液份中探测水污染物的存在或不存在；(b)基于液份中水污染物的存在、不存在、量或识别性而分配值给所述液份；以及(c)基于所分配的值而引导液份的流动或收集，藉此基于分配给在本方法中所探测的所有液份的总体值而确定水源的质量。
在特定实施例中，水源可以是湖、池、河、溪或其他自然水体。在这些实施例的特定实施例中，可测试水来确定或预测人为物体或活动对或者将对水体产生的影响，或者评估使用这个水体提供饮用水给人类的可行性或安全性。
在其他实施例中，水源可以是在水处理厂、水库、水塔处的池、池塘或者收集了用于提供饮用水给人类的其他水体。在这些实施例的特定实施例中，可测试水来评估使用这些水体提供饮用水给人类的可行性或安全性。
在特定实施例中，使用此处提供的方法来定期地监测用于提供饮用水给人类的水源的水质，例如，在水处理厂或在水塔或水库处。例如，可监测水源至少一年一次、至少一年两次，或者一年至少约3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。在一些实施例中，可监测对象至少一个月一次，或者一个月至少约2，3,4,5或更多次。在还有其他实施例中，可测试水至少一周一次、或者一周至少2,3,4,5,6或更多次，或者每天至少一次、或者每天至少2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。
在其他实施例中，可使用此处提供的方法来确定自然灾害(如，在飓风、海啸、地震之后)、事故或恐怖行动之后，使用水体提供饮用水给人群的可行性或安全性。
测试或监测水安全性或质量的方法可包括对稀有颗粒的探测，所述稀有颗粒是水污染物，例如，诸如贾第鞭毛虫、似隐孢菌素种类之类的寄生虫或者以低量引起公众健康危险的其他有机或无机的水污染物。
D、装置
在一个方面，本发明提供了用于探测生物液体中稀有颗粒的设备。
在一个方面，所述设备包括：(a)至少第一个输入通道；(b)至少两个出口通道；(c)能探测生物样本的液份中一个或多个稀有颗粒的至少一个探测器；(d)用于引导所述液份的流动的机制；以及(e)能基于所述液份中稀有颗粒的存在、不存在、特性、成分或量能给所述液份分配一个值的分级设备，其中计算机与所述探测器和用于引导所述液份的流动的机制之间通信。
在一些实施例中，所述装置包括用于询查液份的源。在其中稀有颗粒或细胞固有地表现化学发光或生物发光的其他实施例中，所述装置可能不需要用于询查液份的源。
在特定实施例中，此处提供的装置可包括由壁封围的和/或在衬底上微制作的流动通道，其所带有的设计特征最小化对稀有细胞的无意伤害。减少稀有细胞的无意伤害减少了假阴性率，其可导致错误的病人诊断或预后。流动通道可进一步包括具有水动力设计的孔的通道来用最小压力或伤害排出生物细胞，如美国专利申请号2007/0037172和2008/0248499中所描述的那样。这样的通道，在上述专利申请中被称为一维(1-D)孔，减少了在细胞排出过程中细胞所经历的水动力的压力，且因此减少了细胞消散(lysis)的可能性。带有1-D孔的通道可战略性地根据美国专利号2008/0318324中所描述的“流出过滤”配置而设置，从而进一步再引导、分割、阻尼或分散流动，因此减少在排出时刻细胞所经历的冲击力。封闭流动通道的壁可使用根据PCTPCT/US2009/02426中描述的步骤的UV-加工过程从医疗设备梯度聚合物的生物兼容衬底材料来制造，这样eDAR装置可遵循引导医疗设备制造的规则。
1、用于引导液份流动的机制
在特定实施例中，用于引导流动的机制引导液份的流到第一出口通道(如果液份含有稀有颗粒)或到第二出口通道(如果液份没有含有稀有颗粒)。
在另一个实施例中，用于引导流动的机制，取决于稀有颗粒的识别性、成分或量而引导含有稀有颗粒的液份的流到多个出口通道的一个中。
在特定实施例中，用于引导液份的流动的机制包括电极、磁性元件、声学元件、电致动元件、电场或磁场。
在还有其他实施例中，用于引导液份的流动的机制包括一个或多个电致动的阀门或活塞，其中所述阀门或活塞在至少第一方向的流动通道中控制液体的流动，所述第一方向的流动通道与第一输入通道和两个出口通道在第一节点处交汇。
在一个实施例中，螺线管活塞是电致动螺线管阀门的子组件。在还有一个实施例中，螺线管活塞通过模制被嵌入在设备中。在还有另一个实施例中，所嵌入的螺线管活塞可被经由管道液体相通的螺线管阀门所替代。
在一个具体实施例中，此处提供的装置可包括用于追踪和/或操作颗粒、液份或液体样本的轨迹或流动的一个或多个电极。在特定实施例中，电极基于例如介电泳或电湿润的现象而增强液份的分离。
在特定实施例中，本发明的装置可包括用于追踪和/或操作颗粒、液份或液体样本的轨迹或流动的一个或多个声学元件。在特定实施例中，可使用声学元件来用声能(如，声泳力、超声或超音波(megasonic))来操作所选择的颗粒或细胞的轨迹而基于细胞对压缩的压力波的反应改进细胞分离。
在另一个实施例中，此处提供的装置可进一步包括磁性元件，用于分离结合至或由磁性颗粒束缚住的稀有颗粒或细胞。在特定实施例中，基于附着在颗粒或细胞上的微磁或纳米磁颗粒的磁化系数，磁性元件可增强液份、颗粒或细胞的分离。
在特定实施例中，此处提供的装置可包括使用液压改变、流速改变或电渗流速改变来操作所选颗粒或细胞的轨迹。
2、探测设备
在特定实施例中，探测器选自以下组成的组：照相机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、雪崩二极管(APD)、单光子雪崩二极管(SPAD)以及互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。
在特定实施例中，此处提供的装置包括光的、电的、声的或磁性探测器来追踪所选细胞的动作或列举液份中存在的所选的颗粒或细胞。
在一些实施例中，此处提供的装置或方法可结合各种配置的荧光(单或者多颜色)显微镜成像，其包括但不限于，明场、外延、共焦的、DIC(微分干涉差)、暗场、霍夫曼、或者相位对比。
在一些实施例中，此处提供的装置可包括多个探测设备，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个探测设备。对于执行本发明的一些方法，可能需要多个探测设备，例如，其中在液体样本中出现多于一个的稀有颗粒或细胞，使用多于一个的细胞标记来区分不同细胞类型、或者同时探测多个探测试剂。
3、询查设备
在特定实施例中，此处提供的装置可进一步包括用于询查或激发液份中出现的可探测到的成分的源。在特定实施例中，用于询查的源选自，例如，激光(固态、二极管泵浦、离子或染色)、发光二极管(LED)、灯、电弧放电、磁性脉冲或自然光源。
在一些实施例中，此处提供的装置可包括多个询查设备，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个探测设备。对于执行本发明的一些方法，可能需要多个询查设备，例如，其中在液体样本中出现多于一个的稀有颗粒或细胞，使用多于一个的细胞标记来区分不同细胞类型、或者同时探测多个探测试剂。
4、分级设备
在特定实施例中，分级设备可选自：计算机、控制器、带有集成电路的芯片、电路板、电子元件、软件、算法或其组合。
5、流动通道和腔体
在特定实施例中，此处提供的装置可被包括多个流动通道，包括一个或多个输入流动通道(也就是将液份引入探测体的通道)和一个或多个输出通道(也就是，将液份引出探测体的通道)。在一些实施例中，如此处提供的装置可包括至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100或更多个输入通道和至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100或更多个输出通道的组合。
在特定实施例中，装置可包括多个连接至主通道的流动通道来注入附加液体而改变局部速度。
在一个实施例中，此处提供的装置可包括由以下材料制成的壁所封闭的流动通道或腔体，所述材料包括但不限于：聚合物材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨酯甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚对二甲苯、聚氯乙烯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚已酸内酯、聚酮、聚邻苯二甲酰胺、纤维素乙酸酯、聚丙烯腈、聚砜、环氧聚合物、热塑料、含氟聚合物和聚偏二氟乙烯、聚酰胺、聚酰亚胺)、无机材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融石英、陶瓷、玻璃(有机)、金属和/或其他材料及其组合。
在特定实施例中，壁材料可由以下材料制成：多孔膜、毛料的织造或非织造纤维(诸如布或网)、金属(如，不锈钢或蒙乃尔铜-镍合金)、玻璃、纸张或合成纤维(如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和各种聚酯)、烧结的不锈钢和其他金属以及诸如氧化铝、硅或碳之类的多孔无机材料。
在特定实施例中，此处提供的装置可包括用化学或生物分子预先处理过的流动通道或腔体。例如，通道或腔体可被用抗凝血剂复合物处理来防止或减少液体样本中颗粒的联结、用优选结合至液体样本的颗粒(例如稀有颗粒或细胞)的复合物处理、或者用防止或减少液体样本中的颗粒凝聚或聚集的复合物处理。
在一个实施例中，通道或腔体表面可用抗凝血剂复合物处理、用优选结合至循环肿瘤细胞的复合物处理、或者用防止细胞粘住的复合物处理。
在特定实施例中，通道或腔体表面可被化学改性来增强湿润性或者帮助对所选细胞、颗粒或分子的吸收。表面改性化学物质可包括但不限于：硅烷，诸如三甲基氯硅烷(TMCS)、六甲基二硅氮烷(HMDS)、十三氟-1,1,2,2-四氢辛烷、正辛基二甲基化氯硅烷、氯二甲基辛硅烷、十八烷基三氯硅烷(OTS)或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；聚合物如丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺(DMA)、丙烯酸-2-羟乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氮杂环丙烷(PEI)、聚乙二醇(PEG)、环氧聚二甲基丙烯酰胺(epoxy poly(dimethylacrylamide)(EPDMA)或PEG一甲氧基丙烯酸酯(PEG-monomethoxyl acrylate)；表面活性剂如普流罗尼克(Pluronic)表面活性剂、基于聚乙二醇(PEG)的表面活性剂、十二烷基磺酸钠(SDS)十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或聚凝胺(PB)；纤维素衍生物如羟丙基纤维素(HPC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，胺如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺，含氟化合物如包含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟隆的化合物。
6、用于背景降噪(Background Reduction)的装置
在特定实施例中，此处提供的装置可进一步包括用于降低额外背景信号和/或改进信号-噪声比的装置。通过降低额外背景信号和改进信号-噪声比，因为可准确地探测到来自甚至高度稀释的液份的微弱信号，增强了探测的灵敏度。也就是说，信号-噪声比越好，可扫描的液份越大。直接结果就是，由于需要扫描的液份越少(但是量更大)相应地增加了液体流通量。
在一个实施例中，用于降低背景信号的装置包括掩模(mask)。掩模可包括任何形状或大小的任何数量的孔，带有或不带有间歇间距地位于任何位置。例如，图3示出含有孔阵列(311)的掩模(301)，位于探测体和探测器之间，用于选择性地容许通过可探测到的特性。
在特定实施例中，掩模可包括光元件，其选择性地通过特定波长的光，例如，低通、高通或带通滤波器或者声光调制器、空间光调制器、光断路器、人造全息图、物理孔或电流计扫描器。
在其他实施例中，掩模可包括磁性元件，其选择性地防止磁场的通过。
在一些实施例中，可使用其他完成信号-噪声比类似增益的其他设备来代替掩模或与掩模协同使用。例如，在特定实施例中，可使用选自以下的设备来增加信号-噪声比：锁定放大器、扫描探测器、调制的询查器或探测器、或者调制频率或强度任何装置。
在还有其他实施例中，可使用带有直接结合到内的掩模的空间调制功能的探测器来与此处提供的装置协同使用。在特定实施例中，不存在独立的掩模。在其他实施例中，也存在独立的掩模。结合掩模功能的探测器的非限制性示例包括光电二极管阵列或带有空间像素化的照相机，这样独立光电二极管的信号或照相机的选择像素可被移除或保留。
7、附加元件
在特定实施例中，此处提供的装置可进一步包括以耦合至此处提供的eDAR方法的方式对于执行实验、处理或测试有用的附加元件。
在一个实施例中，此处提供的装置可进一步包括一个或多个电阻加热元件来执行片上细胞试验，诸如聚合酶链反应(PCR)或实时聚合酶链反应(RT-PCR)。
在还有其他实施例中，此处提供的装置可进一步包括一个或多个电极，例如，来进行片上化学实验，诸如电泳或电色谱。
在另一个实施例中，此处提供的装置可进一步包括过滤器元件。在具体实施例中，过滤器元件的形式可为微柱、微撞击器、微筛、带有比生物颗粒更小的孔的通道、带有使生物颗粒不能进入孔但液体被容许围绕生物颗粒周围通过孔的孔的通道(“1-D通道”)、微珠、多孔膜、从壁的突出、粘合涂层、毛料的织造或非织造纤维(诸如布或网)、金属(如，不锈钢或蒙乃尔铜-镍合金)、玻璃、纸张或合成纤维(如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和各种聚酯)、烧结的不锈钢和其他金属以及诸如氧化铝、硅或碳之类的多孔无机材料。
例如，图16示出过滤元件(1622)，其可被设置在通道中，诸如在出口通道(1621)，用于选择性地容许流体部分的通过同时留住所期望的生物颗粒。
在还有另一个实施例中，此处提供的装置可被连接至传统的流式细胞仪。
例如，图16示出可与传统流式细胞仪流体相通的出口通道(1621)(带有或不带有过滤器元件1622)，这样含有稀有细胞1602的分离的液份1661被进一步连续地(一个细胞接一个细胞地)检查或排序。
IV.示例
A.示例1
用于探测或量化液体中的稀有颗粒的，带有单个入口和出口接口的eDAR装置的示例。
图4示出eDAR装置的示例，包括将细胞悬浮液分为液份的设备(411)、询查设备(421和422)、探测或成像设备(431、432和433)和分级设备(计算机，未示出)。在这个具体示例中，将细胞悬浮液分为液份的设备(411)可包括含在壁和流体接口(412和413)中的流体通道(414)。激光器作为询查设备。将带有光电二极管、光电倍增器或照相机的倒置显微镜用作探测设备。在通道(414)和探测设备(431、432和433)之间的路径中放置掩模(451)。计算机接收来自探测设备的信号并通过算法来分级液份。然后计算机基于分级的值(也就是在液体样本中稀有颗粒的存在、不存在、特性或成分)而引导液份到合适的通道中。尽管图4示出三个探测设备(431、432和433)和两个询查设备(421和422)，实践中eDAR可仅包括一个探测设备和一个询查设备、或者众多的探测设备和询查设备。
在图4中所示的装置的一个用途中，询查设备(421和422)包括488nm固态二极管泵浦激光器和633nmHeNe激光器，这些激光被引入倒置显微镜。在进入显微镜物镜之前，使用圆柱形光具整形两个激光束来形成10比1纵横比的准直的椭圆光束。使用半波晶片和偏振光束分光器的组合，可调节每一个光束的强度，而镜子独立地引导光来创建空间协同定位的激发区域。来自生物颗粒的荧光在穿过带通滤波器之前，通过两个二向色镜子将其分为三个波长带，并重新聚焦在三个单光子雪崩二极管(SPAD：431、432和433)上。一个SPAD收集波长范围560-610nm的荧光，第二个SPAD收集645-700nm范围的荧光，第三个SPAD收集范围500-540nm。SPAD的输出被送向带有计数器/定时器板的计算机并被用数个算法加以分析。
B.示例2
用于探测或量化液体中稀有颗粒的，带有两个出口接口的eDAR装置。
图5示出eDAR装置，包括将细胞悬浮液分为液份的设备(510)、询查设备(521)、探测或成像设备(531)、分级设备(计算机，未示出)和根据所分配的分级而引导液份的装置。这个装置还包括单个入口接口(511)、两个出口接口(512和513)、以及在单个点结合来将液体分成液份的三个流体通道(514)。激光器用作询查设备(521)，带有光电二极管、光电倍增器的倒置显微镜或照相机作为探测设备(531)。掩模(551)被置于通道(514)和探测设备(531)之间。计算机接收来自探测设备的信号并通过算法来分级液份。然后设备利用电、磁、水力或气动装置根据所分配的分级来引导液份进入出口512或出口513。
除了上述的具有单个询查设备和单个探测设备的eDAR之外，可使用多个询查和探测设备来与此处描述的eDAR装置协同使用。例如，图6示出带有一个询查设备(640)和三个探测设备(650、651和652)的eDAR装置。
C.示例3
用于探测或量化液体中稀有颗粒的，带有多个入口和/或出口接口的eDAR装置。
在本发明的各方面中，eDAR装置可包括多个入口和/或出口接口。例如，图7示出带有五个接口(711、712、713、714和715)和结合在单个点处的五个液体通道716的用于将悬浮液分成液份的设备(710)。可使用一个或多个接口作为液体入口；可使用一个或多个接口作为液体出口。例如，可使用该装置，这样两个接口用作入口接口、三个接口用作出口接口，或者可使用为一个接口用作入口接口、四个接口用作出口接口等。理论上，设备(710)可包括任意数量的液体入口和出口以及任意数量的流体通道。这些液体通道可在多于一个点处汇聚，且汇聚点并不必须由液体入口或出口所围绕。
D.示例4
用eDAR探测乳腺癌病人血液中的循环肿瘤细胞(CTC)。
来自阶段IV的转移乳腺癌病人的新近静脉穿刺的血液从单个穿刺孔抽入三个独立的管子。第一血液部分(第一管)被丢弃以避免来自皮肤穿刺的上皮细胞的可能的污染。第二管被收集到含有稳定试剂的Veridex’s CellSave管子中，用于使用Veridex’s CellSearch系统进行循环肿瘤细胞探测。第三部分被收集到含有EDTA抗凝血剂的收集管中，用于使用eDAR进行单独分析。
第三部分用下列物质培养：酶、定色剂、渗透试剂和靶向鼠抗泛角蛋白、CD45和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的荧光抗体。循环肿瘤细胞的阳性标识被定义为细胞表达鼠抗泛角蛋白和EpCAM，而不是CD45。CD45一般被认为是白细胞共同抗原且表示白血细胞。结合所有三个抗体的物体被认为是假阳性，一般是蛋白质聚合的结果。
简短地，以约在10-500μL/分钟的流速，予以抗体标记的5到10mL血液样本流过如示例1中所描述的eDAR装置，使用提供7.6psi的压缩空气源驱动该流动。eDAR装置在连续流动(同时)模式中操作。对于这些试验，使用200μm宽50μm高的微通道。对于予以抗体标记的混合物的询查，在约488nm和633nm提供线共焦激发束，其照亮约5-10μm薄的片光。这样，线共焦探测体具有约200μm(宽)×50μm(高)×10μm(厚)的尺寸，提供约0.1nL的探测体。三个SPAD探测设备在10000Hz采样率操作，被设置为探测从450-610nm、645-700nm和500-540nm的细胞发出的荧光信号。以这个速率，每一个液份在约1nL到50nL的数量级，估计为含有5-250个白血细胞和5000-25000个红血细胞。对于5-10mL的样本，因此以500μL/分钟的流速，花费10-20分钟来处理这个样本。以此方式处理的5mL样本将被分为每份体积50nL的10000个液份。
这样，如果使用具有两个出口通道的eDAR装置，在不使用过滤器的情况下，仅在10分钟内就将含有200CTC的5mL样本减少为10μL的体积。如果eDAR装置进一步与流式细胞仪液体接触，通过在流式细胞计数仪之前实现eDAR步骤，在5mL中出现的所有200CTC细胞将在2％的正常时间中被计数和/或个别地分离。
图8示出使用Veridex的CellSearch系统(下面板)和eDAR(上面板)的来自阶段IV乳腺癌病人(在不同日期抽取的不同病人)的27个血液样本的CTC计数。如清楚地示出的，使用CellSearch系统，大多数病人样本被认为零个CTC计数。反之，由eDAR分析的同样的病人样本抽取的超过50％被发现含有200-400CTC计数。这充分地展示了使用eDAR的相对于使用Veridex的商用CellSearch系统的100多倍的灵敏度。eDAR的增加的灵敏度可归于通过液份分级对CTC和背景之间的准确的辨别和掩模的使用。
也如图8中所示，由eDAR分析的病人样本的100％指示CTC的存在，而由Veridex的商用CellSearch系统分析的病人样本的只有40％指示任何CTC的任何存在。这展示了eDAR所提供的极低的假阴性率。CTC测试的高假阴性率可导致对于转移的不准确的预后，并给病人错误的安全感认为现有治疗方案是足够的。
图9中提供了由这个eDAR方法所探测的CTC的示例图像。简单地说，这个图示出在各种照明环境下使用eDAR从病人血液中捕获的癌细胞的光学图像(箭头标记CTC)。图9A是在血红细胞当中的CTC的明场图像。图9B是指示泛细胞角蛋白的出现的荧光图像。图9C示出无CD45出现的荧光图像，因此排除了将白血细胞错误标识为CTC的可能性。
E.示例5
在很多癌细胞中对于癌干细胞的探测。
由eDAR隔离的癌细胞可被进一步分析来区分生物体液中的子总体(subpopulation)。通过灌注靶向特定蛋白质的附加荧光抗体，可将一些癌细胞与其他区分开。例如，表达CD44而不是CD24蛋白的癌细胞目前被称为癌干细胞，因为与较高的转移潜在性相关。其他蛋白质可相关联于细胞的各种特性。
例如，图10示出对乳腺癌干细胞的标识(用箭头标记)。简短地，乳腺癌细胞(MCF-7)用Alexa488-抗-CD44(阳性)和Alexa647-抗-CD24(阴性)标记。图10A是用于探测Alexa500-抗-CD24(绿色)的荧光图像(488-540nm)；图10B是用于探测Alexa647-抗-CD24(红色)的荧光图像(645-700nm)；图10C是明场图像。图10D是指示CD44+/CD24-的合成图像(箭头指示癌干细胞)。癌细胞的大约25％被发现表达CD44而不是CD24，因此满足了癌干细胞的标准。以这个方式，可使用eDAR来区分生物液体中的癌细胞的子总体。
F.示例6
使用分离的液份的eDAR探测。
在此处提供的方法的一个示例中，可通过使用分离的水液份来操作eDAR，所述液份由不溶的相(phase)分开,从而在探测步骤之前封住生物颗粒。图16示出以这个方式操作的eDAR装置。例如，含有不期望的细胞(1601)和期望的细胞1602的细胞悬浮液被分为分离的液份(1631、1641、1651和1661)，它们由不溶的相(1642)彼此分离。分离的液份在流动通道(1603)中被引导成从左向右流动。当液份1641通过探测体(1604；圆柱形外形)的时候，同时地探测分离的液份(1641)中封住的多个细胞。如果没有探测到期望的细胞，将此分离的液份(1641)分级为空并引导向通道1611(见，例如，液份1651)。如果探测到任何期望的细胞，将此分离的液份分级为非零，并引导向通道1621(见，例如，液份1661)。
在一个实施例中，可在通道1621中设置过滤元件1622，以容许流体部分通过的同时留住所期望的生物颗粒。在一个实施例中，eDAR装置可连接至传统的流式细胞仪。例如，在图16中，通道1621可与传统流式细胞仪流体相通(带有或不带有过滤器元件1622)，这样含有稀有细胞1602的分离的液份1661被进一步连续地(一次一个)检查或归类。
不溶的相(1642)可以是如图16中连续的(也就是，整体地围绕着分离的液份)或是分段的(也就是，不溶的相1642仅占据分离的液份之间的间距但不是完整地围绕着液份)。
G.示例7
作为本发明的一个方面的利用的示例，如果10mL细胞悬浮液在100亿不希望的细胞之间仅含有9个期望的稀有颗粒，以最简单的方式，eDAR将需要探测来自10个液份含有的所期望的细胞的特性。由于只有9个期望的细胞，至少一个液份完全没有所期望的细胞且可被分级为空并马上被丢弃。所丢弃的部分中含有的不期望的细胞不需要个别地被筛查。因此，仅取10液份时，至少全部量的1/10被立刻丢弃了，1/10的不希望的细胞(包含在被丢弃的量中)不需要独立地被探测。客观地看，用一个决定将10亿个不期望的细胞作为整体排除。使用当前现有技术的细胞分类器，以70000物体/秒的极限速度，这个决定导致1,000,000,000/70,000＝14,300秒或4小时的时间的节省。这导致时间效率上的极大提高。
接着上述场景，假设如果10mL细胞悬浮液被分为每个100μL的100个液份，由于细胞悬浮液的全部量仅含有9个期望的细胞，至少91个部分不会含有任何所期望的细胞。因此，通过仅执行100次扫描以及做出100个决定，可以立刻排除91液份x100μL＝9.1mL。包含在被丢弃的部分中的细胞将是91亿个细胞，或者在100个决定中排除91％的不期望的细胞。
H.示例8
图1示出本发明的具体实施例，其中在同时方式的操作中在液份中探测稀有颗粒特性。简短地说，含有不期望的细胞(101)和期望的稀有细胞(102)的细胞悬浮液在流动通道(103)中被引导从左向右流动。在给定时间，多个细胞可穿过由阴影的圆柱形所封闭的探测体(104)并被同时地探测。如果没有探测到期望的细胞，等同于探测体的液份被分级为空，并引导向通道111。如果探测到任何期望的细胞，液份被分级为非零且被引导向通道121。
可选地，可在通道12中设置过滤元件(121)，选择性地容许流体部分通过的同时留住所期望的生物颗粒。过滤器元件可形为微柱、微撞击器、微筛、带有比生物颗粒更小的孔的通道、带有使生物颗粒不能进入孔但液体被容许围绕生物颗粒周围通过孔的孔的通道(“1-D通道”)、微珠、多孔膜、从壁的突出、粘合层、毛料的织造或非织造纤维(诸如布或网)、金属(如，不锈钢或蒙乃尔铜-镍合金)、玻璃、纸张或合成纤维(如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和各种聚酯)、烧结的不锈钢和其他金属以及诸如氧化铝、硅或碳之类的多孔无机材料。
I.示例9
在以同时模式运行的eDAR的另一个示例中，所述方法可进一步包括选择性地掩模液份从而减少额外背景信号和改进信号-噪声比。图2示出使用含有孔阵列(212)的掩模(211)，其位于探测体和探测器之间，用于选择性地容许通过可探测到的特性。通过掩模(211)的使用可同时探测多个生物颗粒。通过降低额外背景信号和改进信号-噪声比，因为可准确地探测到来自甚至高度稀释的液份的微弱信号，增强了探测的灵敏度。也就是说，信号-噪声比越好，可扫描的液份越大。直接结果就是，由于需要扫描的液份更少(但是量更大)相应地增加了液体流通量。如果没有探测到期望的生物颗粒，等同于探测体的液份被分级为空，并引导向通道221。如果探测到任何期望的生物颗粒，液份被分级为非零且被引导向通道222。
J.示例10
图11A部分，这是设备710(图7)的放大的示图，示出设备1110，用于用在节点1116处汇聚的五个液体通道(1111、1112、1113、1114和1115)来将悬浮液分为液份。流体通道1111、1112、1113带由液体流向节点1116，而流体通道1114和1115带着液体离开节点1116。螺线管活塞1120位于通道1111的顶部，而螺线管活塞1121位于通道1112的顶部。螺线管活塞1120和1121被配置为按压在弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜上，薄膜将活塞1120和1121与通道1111和1112中的液体分开。
图11的A部分示出用于将悬浮液分为液份的设备1110的操作。通过将螺线管活塞1120按压在位于流体通道1111的顶部的PDMS薄膜，通道1111被关闭。同时，螺线管活塞1121被设置为容许液体穿过通道1112流向节点1116。因此，进入通道1112的含有稀有细胞的血液被转向左边的出口通道1114(见B部分，0ms)。为引导液份1130进入右边的出口通道1115，螺线管活塞1120从位于流体通道1111的顶部的PDMS薄膜上被缩回，而螺线管活塞1121被按压向位于流体通道1112的顶部的PDMS薄膜。这导致引导含有稀有细胞的血液的液份1130进入右边的出口通道1115(C部分，5ms且D部分，10ms)。如所描述的，使用螺线管活塞的液份重引导只需要5ms的很少时间。
K.示例11
图12的A部分示出用于用在节点1240聚集的五个液体通道(1211、1212、1213、1214和1215)把悬浮液分成液份的设备1210。流体通道1211、1212、1213带着液体流向节点1240，而流体通道1214和1215带着液体离开节点1240。螺线管活塞1220连接至接口1216，接口1216经由管道1221与通道1211流体相通，而螺线管活塞1222连接至接口1217，接口1217经由管道1223与通道1212流体相通。
用电或者计算机信号(如，TTL信号)来致动螺线管阀门1220和1222关闭或打开。当螺线管阀门1220被关闭而螺线管阀门1222保持打开的时候，位于入口通道1213中的含有稀有细胞的血液的液份1260被转向左边的出口通道1214(见B部分，0ms)。当螺线管阀门1220被打开而螺线管阀门1222保持关闭的时候，位于入口通道1213中的含有稀有细胞的血液的液份1260被转向右边的出口通道1215(见C部分，2ms)。使用螺线管阀门1220和1222的组合的液份重导向可在2ms的很少的时间内将液份从一个通道引导到另一个通道。
L.示例12
为了测试eDAR设备的性能，根据如下步骤制备血液和癌细胞的混合物：用20μL的荧光EpCAM抗体来标记1x10E6/mL MCF-7细胞。然后用Isoton血球稀释液将这个细胞混合物稀释为1x10E5cells/mL。然后将10μL这种被稀释的细胞混合物添加到2mL全部人血中，并流过分液份的(aliquoting)设备。除非另有表示，在分液份的设备中的流速标准地为30μL/分钟。
图13示出从2个雪崩光电二极管(APD)收集来的荧光信号，这2个雪崩光电二极管位于节点1116(或者1240)上游和上游不同位置。曲线1310示出来自一个APD的轨迹1311，所述一个APD配置为探测探测体1140(或1270)处的液份中EpCAM分子的存在，而曲线1320示出来自配置为探测频道1114(或1214)中的EpCAM分子的存在的第二个APD的信号轨迹1321。信号峰值1312基本符合信号峰值1322，指示液份的分通道是正确的，导致较高的稀有细胞的再现率。
为了进一步调查eDAR设备的性能，计数被转向正确的流动通道的癌细胞的数量并随后对其收集(“再现”)，同时调整螺线管阀门(1220、1222)或活塞(1120、1121)保持关闭或打开的时间长度(“脉冲长度”)。通过将收集在正确通道中的稀有细胞的数量来除以位于探测体1140或1270的APD所探测的稀有细胞的数量而计算再现百分比。图14的曲线1410，示出使用eDAR随脉冲长度而变化的所再现到的癌细胞的百分比。轨迹1420示出当脉冲宽度为10ms或以下的时候，在正确的频道中收集到100％的癌细胞。当脉冲宽度上升，轨迹1420下降，表示一些细胞落在了错误的通道中。
通过调节进入通道1113(或1213)的流速，我们还可观察到可优化再现。图15示出带有轨迹1520的曲线1510，轨迹1520示出随进入流速而变化的再现到的稀有细胞的百分比。当流速在30μL/分钟以下的时候，再现率位于89-100％之间。然而，随着流速增加，再现率下降，指示越来越多的稀有细胞丢失到了错误的通道中。
应该理解，本文描述的示例和实施例是仅用于解说的目的，并且按照这些示例和实施例的各种变形和变化对于本领域技术人员而言将是被暗示了的，且包括在本申请的精神实质和范围以及所附权利要求的范围内。如此处引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用通用地整体结合于此。

Claims (23)

1.一种用于探测在液体样本中的稀有颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)探测所述液体样本的液份中稀有颗粒的存在或不存在，其中所述液份的探测体在探测期间同时包括多个颗粒；
(b)基于所述稀有颗粒在所述液份中的存在或不存在而分配值给所述液份；以及
(c)基于所分配的值而引导所述液份的流动或收集。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探测所述稀有颗粒的存在的步骤包括如下子步骤：
(i)在适于将探测试剂转换为包括所述探测试剂和稀有颗粒的混合物的条件下使所述液体样本与探测试剂接触；以及
(ii)探测在所述液体样本的液份中,在步骤(i)中所形成的混合物的存在或不存在。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探测所述稀有颗粒的存在的步骤包括如下子步骤：
(i)用电磁辐射的外部源来询查所述液份；以及
(ii)探测所述稀有颗粒的荧光。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探测稀有颗粒的存在的步骤包括探测所述稀有颗粒的生物发光或化学发光。
5.如权利要求1到4中任一个所述的方法，其特征在于，所述稀有颗粒是稀有细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液份含有多于一个稀有颗粒。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体样本是生物液体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体样本同时地接触多个可区分的探测试剂，每一个探测试剂在足以将所述多个探测试剂转换为包含所述探测试剂和多个稀有颗粒的混合物的条件下具有不同的特异性。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，同时地探测所述多个混合物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述探测试剂可由不同波长的荧光区分。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，如果所述液份含有稀有颗粒则分配第一值给所述液份，或者如果所述液份没有含有稀有颗粒则分配第二值给所述液份。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一值取决于所述稀有颗粒的识别性或者所述液份中所述稀有颗粒的浓度。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有同样的所分配的值的多个液份被聚集在一起。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述液体样本连续流过流动通道的过程中执行所述探测步骤。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述探测步骤之前，物理地分开所述液体样本的多个液份。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述探测步骤之前，所述液份被分到独立的流动通道或腔体中。
17.一种用于探测液体样本中的稀有颗粒的装置，所述装置包括：
(a)至少一个第一输入通道；
(b)至少两个出口通道；
(c)被配置探测所述液体样本的液份中一个或多个稀有颗粒的至少一个探测器，其中所述液份的探测体在探测期间包括多个颗粒；
(d)用于引导所述液份的流动的机制；以及
(e)能基于所述液份中所述稀有颗粒的存在、不存在、识别性、成分或量而分配值给所述液份的计算机，其中所述计算机与所述探测器和用于引导所述液份的流动的机制相通信。
18.如权利要求17所述的装置，其特征在于，如果液份含有稀有颗粒，所述机制引导液份流动到第一出口通道，或，如果液份没有含有稀有颗粒，所述机制引导液份流动到第二出口通道。
19.如权利要求17或18所述的装置，其特征在于，所述机制，取决于稀有颗粒的识别性、成分或量，而引导含有稀有颗粒的液份流到多个出口通道的一个中。
20.如权利要求17所述的装置，其特征在于，所述用于引导液份的流动的机制包括电极、磁性元件、声学元件或电致动的元件。
21.如权利要求17所述的装置，其特征在于，用于引导液份的流动的机制包括一个或多个电致动的阀门或活塞，其中所述阀门或活塞在至少第一定向的流动通道中控制液体的流动，所述第一定向的流动通道与所述第一输入通道和所述两个出口通道在第一节点处交汇。
22.如权利要求17所述的装置，其特征在于，所述探测器选自由以下组成的组：照相机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、雪崩二极管(APD)、单光子雪崩二极管(SPAD)以及互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。
23.如权利要求17所述的装置，其特征在于，所述装置还包括用于询查所述液份的电磁辐射源。
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