CN102455371A

CN102455371A - 一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置及方法

Info

Publication number: CN102455371A
Application number: CN2010105159232A
Authority: CN
Inventors: 张彦军; 刘晓; 杨茜
Original assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Current assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2012-05-16

Abstract

一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、外置电流放大器、数模/模数转换器、HPICM扫描控制系统、HPICM扫描探头及计算机控制系统；一种评估神经母细胞瘤恶性程度的方法，利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术，根据神经母细胞瘤中不同细胞亚型的形貌特征，包括细胞高度和体积，通过鉴定神经母细胞瘤中不同细胞亚型的相对比率，据此评估神经母细胞瘤的恶性程度。本发明的优点是可在正常生理条件下对细胞进行实时检测，整个诊断过程直观简便，无需对样品进行特殊处理且诊断准确度高。

Description

一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置及方法

(一)技术领域：

本发明提供一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置及方法，尤其是提供通过鉴定神经母细胞瘤中不同细胞亚型的相对比率来评估其恶性程度的方法，更具体的说，是利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术依据神经母细胞瘤中不同细胞亚型的形貌特征通过鉴定不同亚型的相对比率来诊断该肿瘤恶性程度的方法。

(二)背景技术：

神经母细胞瘤(NB)是一种幼儿常见的颅外恶性实体瘤。在过去的20多年里对其一直没有适宜的诊断和治疗手段，尤其是当该疾病没能及早诊断而发展到第三、四期时，其治愈率及预后效果更差。诊断治疗神经母细胞瘤的主要困难是源于该肿瘤细胞自身的异质性和肿瘤干细胞特性。

神经母细胞瘤细胞主要有三种细胞亚型组成：N型(成神经细胞型)、S型(基质粘连型细胞)和I型(中间型细胞)，并且这三种亚型在培养过程中会自发出现，它们的生化特性、分化潜能、恶性程度等有所不同。在生化特性上，I型的多能干细胞特性最显著，其更新、增值能力也最强，并且I型细胞同时表达了N型和S型的特征性生化指标。依恶性程度而言，I型最强，N型其次，S型最弱。从进一步分化的角度而言，I型可以向N型、S型分化，N型与S型之间也存在相互转化的情况。这诸多动态变化的因素影响了神经母细胞瘤的恶性程度，增加了诊断治疗的难度。

大量临床病例显示：S型细胞含量高、细胞高度分化是良性神经母细胞瘤的特征，而I型、N型细胞与肿瘤的恶性程度与复发有密切关系，因此可以通过分析三种亚型相对比率来鉴定神经母细胞瘤恶性程度。目前，最直接的诊断手段就是利用显微镜技术根据神经母细胞瘤中三种细胞亚型的形貌特征来评估瘤的恶性程度。然而，普通光学显微镜由于受到光学衍射极限的限制，其最高分辨率不能满足分辨形态相近的I型与N型细胞的需要；电镜探测中需要对生物样品进行固化和喷金处理，不仅费时费力而且会改变甚至破坏样品表面形貌，降低鉴定的准确度；由于利用针尖与样品间的作用力进行负反馈控制，原子力显微镜(AFM)探针与活体细胞胞体的轻微接触不可避免，且在扫描高度急剧变化且与基底附着度低的复杂生物样品(例如：圆形的神经母细胞瘤N型和I型细胞)时，存在着负反馈控制显微镜技术所无法逾越的困难。

2009年，在负反馈控制的扫描离子电导显微镜技术(SICM)基础上改进而来的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术(HPICM)不仅秉承了原有的可直接在生理液态培养条件下实时、非接触式、高分辨率地探测活体生物样品表面三维微观结构的优点，而且克服了传统SICM连续负反馈控制扫描模式的不足，实现了对高度急剧变化且表面形态复杂的活体生物样品的纳米尺度高分辨率扫描成像(见图2)。这就使得在生理条件下、非接触式、高分辨率鉴定神经母细胞瘤中不同细胞亚型的相对比率并诊断其恶性程度成为可能。

(三)发明内容：

本发明提供一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置及方法，它运用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术在室温条件下(23±2℃)对神经母细胞瘤细胞进行生理条件下、非接触式、高分辨率扫描成像，进而鉴定三种细胞亚型的相对比率，评估神经母细胞瘤的恶性程度。

本发明的技术方案：一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、外置电流放大器、数模/模数转换器、HPICM扫描控制系统、HPICM扫描探头及计算机控制系统；所说的充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与外置电流放大器和HPICM扫描控制系统连接；所说的参比Ag/AgCl电极与外置电流放大器连接；所说的数模/模数转换器分别于与外置电流放大器、HPICM扫描控制系统和计算机控制系统连接；所说的HPICM扫描探头由一个Z向平板压电陶瓷和一个XY向平板压电陶瓷定位系统组成，分别与HPICM扫描控制系统连接；所说的计算机控制系统分别于外置电流放大器、数模/模数转换器和HPICM扫描控制系统连接。

上述所说的玻璃微探针由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，硼硅酸盐微电极玻璃毛细管OD 1.00mm，ID 0.59mm；本装置中使用尖端内壁直径～50nm，电阻～150MΩ的玻璃微探针。

上述所说的外置电流放大器采用美国Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器；HPICM扫描控制系统采用英国Ionscope公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜控制系统。

上述所说的数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata1440A数模/模数转换器。

上述所说的Z向平板压电陶瓷采用德国Physik Instrumente公司的25μmLISA高精度平板压电陶瓷，XY向平板压电陶瓷定位系统采用德国PhysikInstrumente公司的100×100μm PIHera纳米级平板压电陶瓷扫描台。

本装置的工作原理：通过采用SBC6711DSP主板的ICnano SICM控制组件(Ionscope Ltd，英国)操控带有探针的Z向平板压电陶瓷的上下跳跃及载有生物样品的纳米级平板压电陶瓷扫描台的XY向移动，并以20kHz的高速采样频率实时监测流入纳米尺度玻璃微探针的电流变化；利用MultiClamp 700B膜片钳放大器(Molecular Devices，美国)给HPSICM的微探针提供+200mV的电压；HPSICM不再采用传统SICM的连续负反馈扫描控制模式，取而代之的是微探针在生物样品表面以设定幅度Z向上下跳跃的模式进行扫描。

一种评估神经母细胞瘤恶性程度的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)由于典型的N型细胞胞体呈圆形、折光性强、相互间形成类神经网络结构；典型的S型细胞扁平、贴壁紧；而I型细胞的形貌介于N型和S型之间，单个细胞形状比较对称；根据上述形貌差异，随机选取典型的三种亚型细胞，利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术对其分别进行扫描成像；

(2)利用成像分析软件测量出每个成像细胞的高度和体积，然后按亚型对细胞的这些形貌数据进行统计分析，分别得到神经母细胞瘤细胞系中三种亚型的细胞高度和体积的范围和平均值及三种亚型之间的差异性；统计结果显示：神经母细胞瘤中三种细胞亚型的细胞高度具有极显著差异，故细胞高度可作为鉴定三种亚型的主要依据；三种亚型细胞体积的差异性有所不同，故可作为鉴定三种细胞亚型的参考依据；

(3)依据神经母细胞瘤三种细胞亚型鉴定标准，准确判断随机成像细胞所属类型，进而鉴定出神经母细胞瘤中三种细胞亚型的相对比率用于评估该肿瘤的恶性程度。

上述所说的步骤(2)中的成像分析软件采用SICM Image Viewer分析软件。

本发明的优越性在于：只需对分离的神经母细胞瘤细胞进行日常培养，无需对不同细胞亚型进行筛选分离，也无需对细胞进行固化染色等预处理，可以在肿瘤细胞的正常生理条件下对其进行实时鉴定，过程直观简便，鉴定的准确度高。

(四)附图说明：

图1为本发明所涉一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置的结构示意图。

图2为利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜对神经母细胞瘤细胞进行扫描成像的原理和细胞模型示意图。

图3-a、图3-b、图3-c、图3-d为SK-N-SH细胞株中三种亚型细胞的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜成像(其中，图3-a为含有N型、S型和I型三种细胞的细胞群成像，图3-b为典型的单个N型细胞成像，图3-c为典型的单个S型细胞成像，图3-d为典型的单个I型细胞成像)。

图4为神经母细胞瘤细胞中三种细胞亚型的细胞高度和体积(其中，*表示N型与S型、N型与I型的细胞体积都差异明显P＜0.005，n＝12；#表示N型与S型、S型与I型、N型与I型的细胞高度差异都非常明显P＜0.0005，n＝12)。

(五)具体实施方式：

实施例：一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置(见图1)，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、外置电流放大器、数模/模数转换器、HPICM扫描控制系统、HPICM扫描探头及计算机控制系统；所说的充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与外置电流放大器和HPICM扫描控制系统连接；所说的参比Ag/AgCl电极与外置电流放大器连接；所说的数模/模数转换器分别于与外置电流放大器、HPICM扫描控制系统和计算机控制系统连接；所说的HPICM扫描探头由一个Z向平板压电陶瓷和一个XY向平板压电陶瓷定位系统组成，分别与HPICM扫描控制系统连接；所说的计算机控制系统分别于外置电流放大器、数模/模数转换器和HPICM扫描控制系统连接。

一种评估神经母细胞瘤恶性程度的方法：以一株分离自第四期神经母细胞瘤的SK-N-SH细胞株作为评估对象，这种使用分离自实体瘤、可在体外传代培养的细胞株作为细胞模型的方法，在对实体瘤的研究中是被普遍认可的。将SK-N-SH细胞于35mm培养皿中培养4天，扫描成像前将细胞置于室温L15培养基中；选取充灌有L15培养基、阻值～150MΩ、内径～50nm的玻璃微探针作为扫描用探针；利用SICM Image Viewer分析软件对各个细胞的成像结果进行处理分析，得到各个细胞的高度和体积(见图3-a、图3-b、图3-c、图3-d)。

根据图4提供的鉴定标准，以细胞高度为主要判据，以细胞体积为参考，利用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜随机对SK-N-SH细胞进行了扫描，鉴定出扫描细胞所属类型后，进行统计，发现该SK-N-SH细胞株中含有约52％的I型细胞、28％的N型、和20％的S型，可以诊断该四期神经母细胞瘤细胞株具有较高的恶性程度。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围；此外，本发明提供的是一种评估方法，神经母细胞瘤中三种细胞亚型的相对比率与恶性程度之间的量化关系不属于本发明的涵盖范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明专利的涵盖范围之内。

Claims

1.一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、外置电流放大器、数模/模数转换器、HPICM扫描控制系统、HPICM扫描探头及计算机控制系统；所说的充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与外置电流放大器和HPICM扫描控制系统连接；所说的参比Ag/AgCl电极与外置电流放大器连接；所说的数模/模数转换器分别于与外置电流放大器、HPICM扫描控制系统和计算机控制系统连接；所说的HPICM扫描探头由一个Z向平板压电陶瓷和一个XY向平板压电陶瓷定位系统组成，分别与HPICM扫描控制系统连接；所说的计算机控制系统分别于外置电流放大器、数模/模数转换器和HPICM扫描控制系统连接。

2.根据权利要求1所说的一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于所说的玻璃微探针由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，硼硅酸盐微电极玻璃毛细管OD1.00mm，ID 0.59mm；本装置中使用尖端内壁直径～50nm，电阻～150MΩ的玻璃微探针。

3.根据权利要求1所说的一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于所说的外置电流放大器采用美国Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器；HPICM扫描控制系统采用英国Ionscope公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜控制系统。

4.根据权利要求1所说的一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于所说的数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模/模数转换器。

5.根据权利要求1所说的一种评估神经母细胞瘤恶性程度的装置，其特征在于所说的Z向平板压电陶瓷采用德国Physik Instrumente公司的25μm LISA高精度平板压电陶瓷，XY向平板压电陶瓷定位系统采用德国Physik Instrumente公司的100×100μm PIHera纳米级平板压电陶瓷扫描台。

6.一种评估神经母细胞瘤恶性程度的方法，其特征在于它包括以下步骤：

7.根据权利要求6所说的一种评估神经母细胞瘤恶性程度的方法，其特征在于所说的步骤(2)中的成像分析软件采用SICM ImageViewer分析软件。