CN105527462A - 一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法,其由原子力显微镜导电探针作为纳米电极测量单个跳动的小鼠心肌细胞动作电位。通过自主研发的原子力显微镜以及根据其力反馈系统使得探针精确定位到待测细胞上。探针和细胞表面接触有两种模式即恒力接触模式和非恒力接触模式。通过这两种模式分别对心肌细胞进行动作电位和跳动力的变化测量。本发明对心肌细胞动作电位的测量能够精确定位心肌细胞位置,实现定点测量。同时在恒力接触模式下,能够获取高信噪比动作电位信号波形。在非恒力模式下,能够同时测量心肌细胞的动作电位即跳动力变化信号。
Description
技术领域
本发明涉及一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法,属于工程技术领域。
背景技术
随着纳米技术的发展,原子力显微镜(AFM)作为纳米尺度测量的重要工具,使得其在生物医学中的应用成为可能,尤其是在对活细胞操纵及特性检测的研究中,显示了它相对于其他活细胞特性检测技术独有的优势。
细胞的电生理特性是像心肌细胞、神经细胞等带电细胞所具有的性质,测量此类细胞的电生理特性对心脏和神经等疾病的诊断,心肌和神经细胞的再生康复以及高通量药物筛选等均可带来重大突破,对心血管和帕金森等神经系统重大疾病的治疗与防控具有极为重要的社会和经济意义。
在现代生物医学研究和应用中,往往需要进行生物电信号的提取。一般情况下可以通过电极采用一定的导联方式来提取生物电信号,然后经特定的信号调理电路进行放大、去噪等处理后再对信号进行特征识别。随着细胞培养技术和半导体微细加工技术的发展,以活细胞作为敏感元件的细胞传感器和细胞芯片,已成为生物传感器研究领域的一大热点。已经有人将这种细胞传感器用于环境监测、药物筛选、新药开发和基础神经学等研究。国内外很多研究小组在从事关于细胞传感器的研究,也已经有比较成熟的技术用于记录细胞生理特性的研究。
在近几年研究中,测量心肌细胞动作电位的技术主要有两种。第一种是膜片钳技术,自膜片钳技术发明以来,被认为是测量细胞电生理的黄金标准。传统的膜片钳技术是由微吸管作为微电极来测量细胞的电压或者电流特性。芯片膜片钳技术能记录不同细胞的全细胞电生理活动。虽然膜片钳技术在测量细胞电生理时能够获得较好的信号结果,但是膜片钳技术操作复杂,需要受过专业训练的人来进行操作,并且在微电极与细胞之间没有力反馈系统,对细胞影响较大,很难对细胞进行精确操纵。
微电极阵列能够无损的、长时间记录带电细胞的电生理特性。细胞直接培养在微电极阵列上,细胞与微电极之间的界面对精确测量细胞动作电位信号有着重要的作用。但是微电极阵列中的电极位置固定,细胞随机生长在电极上,所以很难定位电极与细胞的位置,从而不能测量选定细胞位置的电特性。
发明内容
本发明技术解决问题:克服现有技术的不足,提供一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法,原子力显微镜具有精确的测力的功能,该方法将原子力显微镜的测力功能结合原子力显微镜导电探针来测量心肌细胞的动作电位及跳动力变化信号,该方法将原子力显微镜的力反馈系统结合纳米尺度的导电探针来测量心肌细胞的动作电位及跳动力变化信号,通过原子力显微镜光杠杆测力原理及反馈信息,能够精确定位细胞位置,在操作上具有高度灵活性,测量电极为纳米电极,通过软件程序实现探针恒力跟踪细胞跳动,从而获得较高信噪比电信号。
本发明的目的可以通过以下技术措施实现:一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法,其特征在于:原子力显微镜导电探针作为纳米电极,通过程序控制实现纳米电极与跳动细胞表面恒力接触测量心肌细胞的动作电位。在非恒力模式下同时测量心肌细胞的动作电位及搏动力变化信号。包括以下步骤:
(1)控制纳米位移平台,移动原子力显微镜导电探针及样品台,将原子力显微镜导电探针精确定位到目标心肌细胞上;
(2)在光学显微镜下,观察心肌细胞状态,移动原子力显微镜导电探针将其尖端放到待测细胞的正上方;
(3)设定软件参数,使原子力显微镜导电探针与心肌细胞膜在非恒力模式下接触,同时测量心肌细胞的动作电位及心肌细胞跳动的形貌变化;
(4)设定软件参数及跟踪模式,使原子力显微镜导电探针与心肌细胞在恒力模式下接触,稳定测量心肌细胞的动作电位;
(5)设定软件参数及跟踪模式,在探针与心肌细胞恒力接触模式下,测量心肌细胞在不同药物下的动作电位:首先,测量一组未加药物心肌细胞的动作电位波形,作为对照组;然后,向心肌细胞培养皿中直接加入ISO(异丙肾上腺素)药物,测量心肌细胞动作电位;最后,向心肌细胞培养皿中直接加入ACh(乙酰胆碱)药物,测量心肌细胞动作电位。
所述原子力显微镜导电探针为导电铂探针,针尖为四锥形,针尖尖端半径为20-25nm。
所述纳米位移平台为压电陶瓷,位移范围为100μm×100μm×100μm,移动精度为2nm,能够实现精确定位。
所述步骤(3)中的软件参数设定通过软件编程实现,设定为使原子力显微镜导电探针进针以50nm的步长逐渐接近细胞,待针尖与心肌细胞膜接触后,停止进针,同时测量心肌细胞的动作电位及跳动力变化信号。
所述步骤(4)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程实现,使原子力显微镜导电探针进针以50nm的步长逐渐接触心肌细胞,并同时启动原子力显微镜导电探针的恒力跟踪模式,使探针随心肌细胞跳动,从而探针与心肌细胞保持稳定的接触,测量心肌细胞的动作电位,能够获得稳定的动作电位波形。
所述步骤(5)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程设定,设定为探针恒力跟踪模式,使探针与心肌细胞稳定接触,并在培养皿中直接测量一组未加药心肌细胞的动作电位;然后,直接在心肌细胞培养皿中加入ISO,待药物作用3min之后,测量稳定动作电位信号;最后,直接在心肌细胞培养皿中加入ACh,待药物作用3min后,测量稳定的动作电位信号。
所述步骤(5)和(6)中通过软件程序控制,使得探针与心肌细胞膜之间恒力接触,探针能够跟踪心肌细胞跳动,通过原子力显微镜中光杠杆原理形成的力反馈模块,当心肌细胞收缩时,探针跟随细胞向上移动;当心肌细胞舒张时,探针跟随细胞向下移动,从而在心肌细胞跳动周期内,探针与心肌细胞始终为恒力接触,因此,探针与心肌细胞膜的封接稳定,获得可靠的信号波形。
本发明与现有方法和系统相比有以下优点:
(1)结合测量心肌细胞的电生理特性,通过原子力显微镜光杠杆测力原理及反馈信息,能够实现精确测量,操作具有高度灵活性、精确性。
(2)导电探针作为纳米电极测量心肌细胞动作电位,能够获得较高信噪比的电学信号。
(3)通过原子力显微镜光杠杆测力原理及反馈信息,纳米电极能够精确定位待测心肌细胞,能够恒力跟踪心肌细胞跳动,从而获得稳定的封接阻抗,对心肌细胞进行无损、实时测量,获得稳定的动作电位波形。
(4)通过软件可以设定两种测量模式:纳米电极与心肌细胞的恒力接触模式和非恒力接触模式,在非恒力接触模式下能够同时测量心肌细胞的动作电位和搏动力变化信号,能够同时观测到心肌细胞动作电位和心肌细胞搏动规律的一致性。
附图说明
图1为本发明原理框图;
图2为本发明原子力显微镜导电探针跟踪心肌细胞跳动的原理图;
图3为本发明在光学显微镜下探针定位待测细胞的光学图像;
图4为本发明原子力显微镜导电探针即纳米电极电镜图像,其中(a)为原子力显微镜导电探针的悬臂,(b)为原子力显微镜导电探针的针尖;
图5为本发明在探针和细胞非恒力接触模式下同时记录的电学和力学信号波形,其中(a)为心肌细胞动作电位信号波形,(b)为心肌细胞的搏动力信号波形;
图6为本发明在探针和细胞在恒力接触模式下不同药物作用下记录的动作电位波形,其中(a)为加药前心肌细胞动作电位信号,(b)为加入ISO对心肌细胞作用后的动作电位信号,(c)为加入ACh对心肌细胞作用后的动作电位信号。
具体实施方式
如图1所示,为本发明原理框图,其中1为导电探针测量细胞模块,包括原子力显微镜导电探针,心肌细胞,激光器和四象限光电检测器组成的光杠杆系统,2为压电陶瓷纳米位移平台,3为四象限光电检测器电压采集及心肌细胞动作电位采集模块,4为压电陶瓷纳米位移平台控制模块,5为光学显微镜模块,6为计算机控制系统;
如图2所示,为本发明原子力显微镜导电探针跟踪心肌细胞跳动的原理图,其中,1为激光器,2为四象限光电探测器,3为原子力显微镜导电探针,4为样品台,5为舒张状态下的心肌细胞,6为收缩状态下的心肌细胞。
图1和图2所示,本发明实现为:
(1)控制压电陶瓷纳米位移平台2,移动原子力显微镜导电探针1及压电陶瓷纳米位移平台2,将原子力显微镜导电探针1精确定位到目标压电陶瓷纳米位移平台上2的心肌细胞上;
(2)在光学显微镜5下,观察心肌细胞状态,移动原子力显微镜导电探针1将其尖端放到待测心肌细胞的正上方;
(3)设定软件参数,使原子力显微镜导电探针1与心肌细胞膜在非恒力模式下接触,同时测量心肌细胞的动作电位及心肌细胞跳动的形貌变化;
(4)设定软件参数及跟踪模式,使原子力显微镜导电探针1与心肌细胞在恒力模式下接触,稳定测量心肌细胞的动作电位;
(5)设定软件参数及跟踪模式,在原子力显微镜导电探针与心肌细胞恒力接触模式下,测量心肌细胞在不同药物下的动作电位:首先,测量一组未加药物心肌细胞的动作电位波形,作为对照组;然后,向心肌细胞培养皿中直接加入ISO(异丙肾上腺素)药物,测量心肌细胞动作电位;最后,向心肌细胞培养皿中直接加入ACh(乙酰胆碱)药物,测量心肌细胞动作电位。
所述原子力显微镜导电探针1为导电铂探针,针尖为四锥形,针尖尖端半径为20-25nm。
所述压电陶瓷纳米位移平台4,位移范围为100μm×100μm×100μm,移动精度为2nm,能够实现精确定位。
所述步骤(3)中的软件参数设定通过软件编程实现,设定为使原子力显微镜导电探针1进针以50nm的步长逐渐接近心肌细胞,待针尖与心肌细胞膜接触后,停止进针,同时测量心肌细胞的动作电位及跳动力变化信号。
所述步骤(4)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程实现,使原子力显微镜导电探针进针以50nm的步长逐渐接触心肌细胞,并同时启动原子力显微镜导电探针的恒力跟踪模式,使探针随心肌细胞跳动,从而探针与心肌细胞保持稳定的接触,测量心肌细胞的动作电位,能够获得稳定的动作电位波形。
所述步骤(5)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程设定,设定为探针恒力跟踪模式,使探针与心肌细胞稳定接触,并在培养皿中直接测量一组未加药心肌细胞的动作电位;然后,直接在心肌细胞培养皿中加入ISO,待药物作用3min之后,测量稳定动作电位信号;最后,直接在心肌细胞培养皿中加入ACh,待药物作用3min后,测量稳定的动作电位信号。
所述步骤(5)和(6)中通过软件程序控制,使得原子力显微镜导电探针1与心肌细胞膜之间恒力接触,探针能够跟踪心肌细胞跳动,通过原子力显微镜中光杠杆原理形成的力反馈模块,当心肌细胞收缩时,探针跟随细胞向上移动;当心肌细胞舒张时,探针跟随细胞向下移动,从而在心肌细胞跳动周期内,探针与心肌细胞始终为恒力接触,因此,探针与心肌细胞膜的封接稳定,获得可靠的信号波形。
如图3所示,为本发明在光学显微镜的光学镜头下,原子力显微镜导电探针定位到待测心肌细胞上的光学图像;通过软件控制压电陶瓷纳米位移平台,将目标细胞移动到探针下。
如图4所示,为本发明采用原子力显微镜导电探针,探针表面镀有铂层,具有良好的导电性,探针成四锥形,尖端半径为20-25nm,采用此种导电探针能够提高探针针尖与心肌细胞的接触稳定性,从而可以稳定精确的测量心肌细胞的动作电位信号。
如图5所示,为本发明采用探针与细胞非恒力接触模式,同时测量心肌细胞的动作电位及搏动力变化波形。首先,将探针定位到待测跳动的细胞之上,手动进针,使得探针与细胞膜轻微接触,保持探针不动及压电陶瓷纳米位移平台不动,进行心肌细胞的动作电位及搏动力变化测量。如图5中的(a)所示,为所测心肌细胞的动作电位波形,可以看出噪声干扰比较明显。图5中的(b)为所测心肌细胞的搏动力变化波形,可以看出波形呈现出规律性起伏变化。
如图6所示,为本发明采用探针与细胞恒力接触模式,首先设置软件为恒力跟踪模式,使得探针与跳动的心肌细胞始终保持恒力接触。如图6中的(a)所示,为加药前心肌细胞动作电位信号,从图6(a)可以看出,加药前心肌细胞动作电位信号频率0.9Hz。加ISO后,图6中的(b)所示测量到的动作电位的频率有明显增加,其值为1.3Hz。在此基础上,加入ACh后动作电位的频率降低为0.4Hz,如图6中的(c)所示。实验表明,ISO和ACh对单个心肌细胞动作电位影响显著,与药物功效一致。同时,验证了本系统能够在纳米尺度上有效探测单个心肌细胞动作电位信号的细微变化。
Claims (7)
1.一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法,其特征在于:将原子力显微镜导电探针作为纳米电极,在恒力和非恒力接触模式下测量心肌细胞电学及力学信号,包括以下步骤:
(1)控制纳米位移平台,移动原子力显微镜导电探针及样品台,将原子力显微镜导电探针精确定位到目标心肌细胞上;
(2)在光学显微镜下,观察心肌细胞状态,移动原子力显微镜导电探针将其尖端放到待测细胞的正上方;
(3)设定软件参数,使原子力显微镜导电探针与心肌细胞膜在非恒力模式下接触,同时测量心肌细胞的动作电位及心肌细胞跳动的力变化;
(4)设定软件参数及跟踪模式,使原子力显微镜导电探针与心肌细胞在恒力模式下接触,稳定测量心肌细胞的动作电位;
(5)设定软件参数及跟踪模式,在探针与心肌细胞恒力接触模式下,测量心肌细胞在不同药物下的动作电位:首先,测量一组未加药物心肌细胞的动作电位波形,作为对照组;然后,向心肌细胞培养皿中直接加入ISO(异丙肾上腺素)药物,测量心肌细胞动作电位;最后,向心肌细胞培养皿中直接加入ACh(乙酰胆碱)药物,测量心肌细胞动作电位。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述原子力显微镜导电探针为导电铂探针,针尖为四锥形,针尖尖端半径为20-25nm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述纳米位移平台为压电陶瓷,位移范围为100μm×100μm×100μm,移动精度为2nm,能够实现精确定位。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的软件参数设定通过软件编程实现,设定为使原子力显微镜导电探针进针以50nm-70nm的步长逐渐接近细胞,待针尖与心肌细胞膜接触后,停止进针,同时测量心肌细胞的动作电位及跳动力变化信号。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程实现,使原子力显微镜导电探针进针以50nm的步长逐渐接触心肌细胞,并同时启动原子力显微镜导电探针的恒力跟踪模式,使探针随心肌细胞跳动,从而探针与心肌细胞保持稳定的接触,测量心肌细胞的动作电位,能够获得稳定的动作电位波形。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(5)中的软件参数及跟踪模式设定通过软件编程设定,设定为探针恒力跟踪模式,使探针与心肌细胞稳定接触,并在培养皿中直接测量一组未加药心肌细胞的动作电位;然后,直接在心肌细胞培养皿中加入ISO,待药物作用3min之后,测量稳定动作电位信号;最后,直接在心肌细胞培养皿中加入ACh,待药物作用3min后,测量稳定的动作电位信号。
7.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于:步骤(5)和(6)中通过软件程序控制,使得探针与心肌细胞膜之间恒力接触,探针能够跟踪心肌细胞跳动,通过原子力显微镜中光杠杆原理形成的力反馈模块,当心肌细胞收缩时,探针跟随细胞向上移动;当心肌细胞舒张时,探针跟随细胞向下移动,从而在心肌细胞跳动周期内,探针与心肌细胞始终为恒力接触,因此,探针与心肌细胞膜的封接稳定,获得可靠的信号波形。
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