CN101793663A

CN101793663A - 跳跃式多分辨率扫描探针显微镜

Info

Publication number: CN101793663A
Application number: CN200910001131A
Authority: CN
Inventors: 耿娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-02-01
Filing date: 2009-02-01
Publication date: 2010-08-04

Abstract

这项发明是应用在扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)上使其首次突破以往的局限能够扫描复杂的细胞组织，并且能够将扫描时间缩短十倍以上。扫描探针显微镜的优点是能在室温下扫描生理溶液中的活细胞，其成像精度为0.1-10纳米。本项发明为跳跃式多分辨率扫描探针显微镜。跳跃式扫描放弃了原有的维持探针和样品之间恒定距离或直接接触细胞表面的扫描模式。这种方法使扫描电镜的探针跳跃着扫描，其跳跃距离是细胞表面高度的5-10倍，防止纳米管在横向移动中撞击细胞组织，从而能够扫描多个复杂的悬浮在溶液中的细胞和三维的细胞网络。多分辨率式扫描法首次发明了在同一扫描区域内使用不同成像分辨率，用高分辨率扫描感兴趣的细胞，低分辨率扫描非感兴趣的背景部分。

Description

跳跃式多分辨率扫描探针显微镜

技术领域

这项发明是应用在扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)，以下简称扫描显微镜。它包括：扫描电子探针显微镜(Scanning Ion Conductance Microscope)，原子力探针显微镜(Atomic Force Microscope)，扫描通道探针显微镜(Scanning Tunnelling Microscope)。

背景技术

光学显微镜是目前比较普遍应用的，也是实验室里量基本的一种观察仪器。但是由于光的衍射，它的成像精度被限制在200-250纳米之间，对于细胞组织的观察，其分辨率还不够精确。另外一种方法是采用电子显微镜，其成像精度能够达到1纳米，但是缺点是要在真空下扫描，细胞要在扫描之前被固定或者在其表面镀金，从而杀死活细胞。所以在现有条件下传统的电子显微镜是无法被用来扫描活细胞的。目前许多对活细胞的成像和测量方法是基于扫描探针技术，即使用一种锋利的探针在距离样品表面的非常近的距离上(小于50纳米)或直接接触下进行扫描。扫描显微镜的工作原理是把探针和样品表面产生的相互作用(化学或物理作用)作为样品表面特性的函数，从而来绘制出样品表面的轮廓或纹理(详情请参考Hansma et al.Science 243：641-3)。扫描显微镜的特点是能够在室温下和大气压下扫描浸泡在生理溶液中的活细胞。但是探针也同样会对细胞表面进行干扰，例如探针的压力迫使细胞表面塌陷或破损，从而在成像的过程中造成不真实或错误的影像。活细胞在此状态下扫描的也是受压迫的，而非是自然态下的。细胞都是生命体的重要组成部分，无论是动物还是植物。对自然态下细胞的结构和性质的研究，可以使我们对生物体中的最基本的生命活动进行了解。这就需要有一种技术能够在实时的，非入侵性(非毁灭性的)的和在溶液中扫描自然态下的活细胞，这也就是本项发明的初始目的和最终所实现的。几种通常被用来观察活细胞的并且分辨率在50纳米以下的扫描显微镜是：原子力显微镜(Aromic Force Microscope)和电子探针扫描显微镜(Scanning Ion Conductance Microscope)。原子力显微镜是目前最广泛的被用来扫描活细胞的一种扫描显微镜。它工作的原理是测量探针和样品表面之间的原子作用力。在扫描过程中，通过维持探针和样品之间的作用力恒定，可以使探针沿着样品表面扫描，最终勾画出样品的纹理(图像)。但是同时原子力显微镜也会在细胞表面产生作用力，使非常柔软的细胞膜踏陷，从而无法扫描自然条件下的柔软细胞。另外在使用时，由于探针和细胞表面之间的直接接触或紧密的相互作用，原子力显微镜探针通常会被污染和磨损，同时也会造成细胞表面的机械损伤。电子探针扫描显微镜是也是一种扫描显微镜(详情请参考Hansma et al.Science 243：641-3)，它比原子力显微镜更适用于扫描活细胞。对比原子力显微镜，它的主要优点是可以迅速的获取高清晰(分辨率小于10纳米)的自然态下的柔软细胞的图像。因为其探针并不和样品表面接触，也就不会对样品表面产生任何的作用力更不会造成机械损伤。电子探针扫描显微镜是用一种注有电解液或生理溶液的玻璃纳米管作为其探针，来扫描浸泡在生理溶液中的活细胞(如图1)。玻璃纳米管的材料是硼硅或者石英，其纳米管尖端部是一个成45度-60度的圆锥。硼硅纳米管管口(即圆锥的锥尖)的外直径是200纳米，内直径是100纳米。石英纳米管管口的外直径是20纳米，内直径是10纳米。两个镀银/氯化银的电极被分别放置在纳米管中和放置样品的溶液中，当把一定的电压加载在两个电极上，溶液中的带电离子就会经过纳米管管口涌向两个电极，从而产生了电流。当纳米管管口距离样品表面远远大于其内部半径时，溶液中的离子可以自由的通过纳米管管口。当纳米管管口距离样品表面相当于其内部半径时(50纳米)，一部分从管口游动出来的离子会被细胞表面所阻挡，从而无法到达电极，于是产生的电流就减小了。所以电流的大小与纳米管管口和样品表面之间的距离成正比函数。其反馈控制系统是在扫描时维持电流的恒定，所以当电流减小的时候也就意味着纳米管和样品之间的距离变小了，于是反馈系统会提升纳米管的高度来维持恒定的电流(即调制模式modulation/AC control mode)，从而来维持恒定的间距。所以在通常的扫描情况下，纳米管与样品之间的距离被始终维持在50纳米，纳米管从不接触样品。纳米管横向地逐行扫描细胞(如图2)。在同一个扫描的区域上，只应用一种预设的的单一的扫描精度(分辨率)。

发明内容

本项发明跳跃式多分辨率扫描法，最先应用在电子探针扫描显微镜，因为这种显微镜是扫描自然态下的活细胞的显微镜的首选。在原有的基础上，本项发明发明了跳跃式反馈系统，放弃了其维持恒定的纳米管和样品间的距离的理念(调制模式反馈系统)，创立前所未有的跳跃式扫描探针显微镜。并且同时发明了能够在同一区域应用多种不同的分辨率的扫描方法，即多分辨率扫描法。

a)跳跃式扫描法(Hopping Scanning Protocol)

跳跃式扫描模式放弃了原有的恒定间距扫描模式(即调制模式)，而是在每一个扫描(成像)点，把纳米管提升到距离样品表面一个非常高的高度(通常在1-40微米，是样品表面高度的5-10倍)(如图3)。这个高度足以使纳米管在平行移动到下一个扫描点的过程中，越过任何悬浮在溶液中的细胞组织，而不会导致纳米管横向的撞入这些组织。这是一个至关重要的创新发明，让新的跳跃式反馈系统更加灵敏以及能够扫描三维的复杂细胞网络。原先的系统只能扫描单一的置放在玻璃器皿里的细胞，一旦扫描多细胞或三维细胞网络，就难以避免探针撞如细胞(如图2)。这是因为原有的模式是让纳米管贴着细胞表面扫描(间隔距离＝50纳米)，这样的反馈系统就只能对纳米管尖端处正下方50纳米处的样品表面的高低变化进行反馈。而悬浮在纳米管尖端上部两侧的细胞组织将不会被检测到，从而导致其反馈系统只专注于纳米管尖端而对纳米管本身的保护失灵(如图2)。

新的跳跃式反馈系统解决了这一问题，因为纳米管会纵向跃起，然后在离任何细胞组织都很远的地方横向移动，也就不可能发生纳米管横向撞击细胞的问题(如图3)。跳跃式反馈系统，抛弃了调制反馈的繁琐计算控制，只检测电流的大小，从而将系统的扫描速度提高了至少5倍以上。当电流下降到某个特定值的时候(即纳米管与样品表面之间的距离缩小到某个特定距离)，跳跃式反馈系统会立刻跃起纳米管，并记下这时的纳米管的位置用来绘图。纳米管会纵向跃起，然后在远离任何细胞组织的上方，横向移动到下一个扫描点，然后纵向下降直至纳米管检测到细胞表面。这个过程会一直重复，直到扫描区域上的每一个扫描点都被扫描过。

b)多分辨率式扫描法(Compression/Multi-resolution Scanning Protocol)

原有的扫描程序是对同一片区域使用单一的成像分辨率，即在扫描区域内任意一处的分辨率都是相同的。这对扫描细胞样品来说，是不符合实际的。因为细胞样品中，有一部分是有细胞组织的，其他部分是没有样品的(例如，培养皿表面)，或者有一部分是科研人员感兴趣的而另一部分是不感兴趣的细胞组织。如果把单一的分辨率用来扫描他们，在感兴趣和非感兴趣的区域花等同的时间扫描，倒不如用更多的时间扫描感兴趣的区域，较少的时间扫描非感兴趣的区域。所以本项发明中的多分辨率式扫描法，也就是在同一个区域上应用不同的分辨率来扫描。用高分辨率的扫描精度来扫描科研人员感兴趣的细胞组织，用低分辨率来扫描不感兴趣的部分，例如空的没有任何细胞的培养皿表面。

b.1)区域扫描

为了在扫描区域上应用不同的分辨率，扫描区域被分成一个个的等大的正方形(如图4)。每一个正方形可以用不同的分辨率来扫描，所以整个扫描区域就有多个不同的分辨率。正方形的大小可以预先改变，但在扫描的时候他们都必须等大并且都拥有同样多的扫描点。结合跳跃式扫描法，纳米管从一个正方形的左下角的第一个扫描点开始竖直向下移动，直到反馈系统检测到表面，然后纳米管纵向跃起，在离样品很远的地方，横向移动到下一个扫描点，然后重复整个过程直到这个正方形里所有的点得被扫描，然后探针会挪到下一个正方形重复这个步骤。

b.2)扫描分辨率

根据上面所述，扫描区域被分割成多个等大的正方形，每一个正方形里都拥有同样多的扫描点，但可以有不同的分辨率。不同的扫描分辨率是通过以下步骤被实现的：

1.高扫描分辨率，选用这个正方形中的全部或较多的扫描点来用探针扫描成像。

2.低扫描分辨率，选用这个正方形中的没有或较少的扫描点来用探针扫描成像。

3.没有被真正用探针扫描成像的扫描点的成像值，将被估算成与其相邻的被真正用探针扫描的点的数值。

b.3)预扫描

每一个正方形的扫描分辨率，是由这个正方形的预扫描来决定的(如图5)。预扫描模式扫描每一个正方形的四个顶点。然后用这四个点之间的最大高度落差来决定为这个正方形里的细胞表面的粗糙度。当正方形的粗糙度大于一个预先设定的阀值时，这个正方形的扫描分辨率就会用高分辨率。反之，则被定为低高分辨率。

b.4)总扫描

预扫描只扫描一个正方形的四个顶点来决定它的粗糙度，但并不收集成像数据。总扫描紧跟在预扫描之后，用预扫描所决定的分辨率来扫描这个正方形并成像(成像步骤请参见b.1和b.2)。

附图说明

图表1显示了电子扫描显微镜扫描细胞时的结构图。

图表2显示了原有的横向扫描方法，导致了纳米管管壁撞击细胞组织。

图表3显示了发明的创新跳跃式扫描方法，避免了纳米管撞击细胞。

图表4显示了多分辨率扫描模式下的区域扫描。

图表5显示了多分辨率扫描模式下的预扫描和总扫描。

具体实施方式

典型的扫描显微镜是由扫描探针(scanning probe)，压电驱动器及其组成部分(piezo actuator and scanningelements)，控制器件(control elements)和一台计算机(a computer)。所有这些器件可以被搭建在一台倒置显微镜(尼康TE200)的周围。压电驱动器可以被用来移动纳米管和样品。典型的压电驱动器的移动范围通常在30-100微米之间，其移动精度在1-10纳米之间，例如Physik Instrumente E505(德国)。玻璃纳米管是从硼硅或者是石英的玻璃管制造出来的。把玻璃管安装在激光纳米管牵拉器上(Laserbased pipette plller，Shutter Instrument，(美国))，然后用激光的热度来融化玻璃管的中部，再把两边的牵拉器向相反的方向牵拉，这样一次可制造两个纳米管。硼硅纳米管管口的内直径是100纳米。石英纳米管管口的内直径是10纳米。控制器件用数字处理信号系统(DSP Board M44，Innovative Integration，美国)，来控制X，Y和Z三个方向上的压电驱动器，并且内部设有反馈系统处理反馈信号。电流是在0.001-0.01纳安的范围之内通过电流放大器(Amplifier)放大到0.1-10伏，然后输送进数字处理信号系统进行反馈处理。

Claims

1.跳跃式扫描探针显微镜，一种采用跳跃式探针技术的扫描探针显微镜，跳跃式扫描法的定义包括以下几个步骤：

a)重复式的把扫描探针提升到高于被扫描的样品任何组成部分的高度。

b)在这个高度上平行移动探针或样品，并同时测量探针的作用与样品的相互作用(例如电流或原子力)来决定基准作用值。

c)当平行移动完成后，把探针下降到到距离样品表面的一个距离，能使得被测量的作用值从基准值减小到特定的阀值。

d)然后立即记录此刻的探针高度，作为此个扫描点的成像值来回图。

e)重复，a)，b)，c)和d)直到整个扫描区域都扫描完毕。

2.多分辨率式扫描探针显微镜，一种采用多分辨率来扫描同一区域的扫描显微镜。用高分辨率来扫描科研人员感兴趣的部分，用低分辨率扫描其他不感兴趣的背景部分。这种方法包括以下的几个步骤(方式)：

a)扫描区域被分成等大的多个正方形。

b)每一个正方形有着等同多的扫描(成像)点。

c)扫描分为有预扫描和总扫描。

d)高反辨率扫描是扫描每个正方形中的全部或大多数扫描点，并且成像。低分辨率扫描是扫描每个正方形中的少数或零个扫描点，并且成像。

e)预扫描是扫描正方形的四个顶点，并且计算每个正方形的粗糙度。

f)总扫描是紧跟在预扫描后，用其决定的粗糙度来扫描每个正方形并最后成像。

g)没有被用探针成像的扫描点，其成像值将等于紧邻的被探针成像的扫描点的成像值。

3.应用了权利要求1和2的扫描电子探针显微镜(Scanning Ion Conductance Microscope)。

4.应用了权利要求1和2的原子探针力显微镜(Atomic Force Microscope)。

5.应用了权利要求1和2的扫描通道探针显微镜(Scanning Tunnelling Microscope)。