CN201654064U - 基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置 - Google Patents
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Abstract
一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、SICM样品扫描台、SICM负反馈扫描控制电路、SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台、商用膜片钳前置电流功率放大器及膜片钳数模/模数转换器；本实用新型的优越性：本实用新型的高分辨率的膜片钳技术可被方便地用于研究多种细胞膜上纳米尺度微结构中离子通道的“开”、“闭”动力学、离子通透性等，从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能的关系提供了全新的技术手段。
Description
(一)技术领域：
本实用新型属于生物用膜片钳技术领域，特别是指一种基于扫描纳米玻璃探针显微镜技术的探测活体细胞膜表面离子通道活性的高分辨率膜片钳技术，即一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置。
(二)背景技术：
电生理学的产生与发展从一开始就与电子仪器的革新与进步紧密相连，仪器设备灵敏度和分辨率的提高为深入探知生物电本质创造了条件。1976年德国马普研究所的Erwin Neher和Bert Sakmann博士创建膜片钳技术(patch-clamp techniques)以来，它给电生理学和细胞生物学的发展乃至整个生物学研究带来了一场革命，人们因此对离子通道本质的认识有了一个质的飞跃。这一伟大的贡献使Neher和Sakmann获得了1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。膜片钳技术的发展对离子通道的功能及细胞功能的调控研究起到了巨大的推动作用，其为阐明离子通道病的发病机理并探索治疗的新途径提供了有效的研究方法。然而，任何技术与方法都不是尽善尽美的，膜片钳技术自发明伊始就从未停止过被改进和完善。根据特定的试验条件又发展出了多种模式的膜片钳技术，从而保证了该技术可用于多种细胞功能的研究。现在，每年都有数千篇膜片钳技术方法及其应用方面的文献报道，该技术在生物学领域里的广泛应用已成为现代生物学的主要内容之一。大量的膜片钳技术研究结果表明：大量的膜片钳技术研究结果表明：细胞膜的离子通道并不是均一分布的，而是通常分布在细胞表面的微观结构中，离子通道的这种分布方式与细胞生理功能紧密相连。如具有保钠排钾功能的肾上皮细胞，其特异性咪吡嗪敏感的上皮细胞Na+通道和电压敏感型K+通道多分布在约100纳米大小的微绒毛上。离子通道与细胞表面亚细胞微观结构及其生理功能紧密相关的现实，向传统的膜片钳技术发起了新的挑战。传统的膜片钳技术须先借助光学显微镜来在细胞膜表面进行玻璃微电极针尖定位后再进行离子通道的记录，由于光学衍射极限的限制使普通光学显微镜的最高分辨率很难突破200纳米，导致传统的膜片钳技术不能准确研究离子通道与小于200纳米的细胞表面微结构的关系。加之，许多生物样品的光透过性不好，这更加降低了传统膜片钳技术的分辨率。因此，低分辨率的传统膜片钳技术已不能满足目前生物学研究的需要。
随着纳米技术的飞速发展及扫描探针显微镜技术(SPM)在生物领域的广泛应用，使高分辨率地实时探测活体生物样品成为可能。1989年，加州大学的Hansma教授利用扫描探针显微镜的负反馈控制技术，用玻璃微探针作为扫描探针设计出了非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanningion conductance microscopy，SICM)(见图1)。但是由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品表面接触并导致针尖或样品的毁损，所以扫描离子电导显微镜技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的PET薄膜的扫描成像。1997年英国伦敦帝国理工学院的Korchev教授对扫描离子电导探针显微镜的负反馈控制等技术进行重大改进后，使该显微镜技术实现了对活体生物样品表面结构的非接触三维实时探测，并逐步成为纳米生物医学研究领域具有发展潜力及应用前景的一种扫描纳米玻璃探针显微镜技术。SICM可以实时高分辨率地非接触式探测活体生物样品表面形貌，其纳米尺度玻璃微滴管扫描探针与膜片钳用玻璃微电极相似且同样在电解液中工作，因此为建立高分辨率的膜片钳技术提供了技术保障。
(三)实用新型内容：
本实用新型的目的在于提供一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置，它针对传统膜片钳技术分辨率的不足，提供了一种利用扫描探针显微镜非接触式扫描的高分辨率来精确定位膜片钳玻璃微滴管电极，建立了一种基于非接触扫描探针显微镜扫描控制技术的高分辨率膜片钳技术，从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能(离子通道特性)的关系提供了全新技术手段。
本实用新型的技术方案：一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、SICM样品扫描台、SICM负反馈扫描控制电路、SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台、商用膜片钳前置电流功率放大器及膜片钳数模/模数转换器；所说的充满电解液的玻璃微探针和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接；所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模/模数转换器连接；所说的膜片钳数模/模数转换器与SICM负反馈扫描控制电路连接；所说SICM负反馈扫描控制电路与SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；所说的内含细胞与细胞培养液的培养皿置于SICM样品扫描台上。
上述所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳技术。
上述所说的膜片钳数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳技术。
上述所说的SICM负反馈控制电路采用英国IONSCOPE公司的ICnanoSICM非接触式扫描离子电导显微镜技术。
上述所说的SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台采用英国IONSCOPE公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜技术。
本实用新型的工作过程为：(1)用SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台及SICM负反馈扫描控制电路控制玻璃微探针在细胞表面非接触地扫描并获得细胞膜表面的高分辨率成像；(2)在SICM负反馈扫描控制电路的作用下膜片钳玻璃微探针非接触地精确定位于样品表面待研究的特定纳米尺度微结构上；(3)关闭SICM负反馈扫描控制电路，再像传统膜片钳一样完成玻璃微探针与细胞膜片接触并形成兆欧姆封接；(4)细胞膜片上的离子通道电流通过膜片钳前置电流功率放大器放大、膜片钳数模/模数转换器采集，从而实现离子通道记录。
本实用新型的工作原理：Ag/AgCl电极置于充满电解液的玻璃微探针中作为扫描探针，内含细胞与细胞培养液的培养皿置于SICM样品扫描台上，参比电极置于培养皿的细胞培养液中，并通过负反馈电路实时监测探针内电极与参比电极之间电导的变化。当探针接近细胞表面时，由于允许离子流入玻璃微探针针尖自由空间的减小，离子电导也随之减小。在扫描过程中，SICM负反馈控制电路通过高精度XYZ三维压电陶瓷来保持玻璃探针电极与细胞表面距离的恒定(即非接触)。
本实用新型的优越性：本实用新型的高分辨率的膜片钳技术可被方便地用于研究多种细胞膜上纳米尺度微结构中离子通道的“开”、“闭”动力学、离子通透性等，从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能的关系提供了全新的技术手段。
(四)附图说明：
图1为现有技术非接触式的扫描离子电导显微镜技术的结构示意图。
图2为本实用新型所涉一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置的结构示意图。
图3为本实用新型所涉一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置的工作流程图。
(五)具体实施方式：
实施例：我们利用英国IONSCOPE公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜技术融合美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳技术，来建立新型的基于非接触扫描探针显微镜技术扫描控制技术的高分辨率膜片钳。主要用Axon商用膜片钳系统的前置电流功率放大器和数模/模数转换器来替代SICM显微镜自有电流放大器(见图2)。图中，Ag/AgCl电极置于充满电解液的玻璃微探针中作为扫描探针，内含细胞与细胞培养液的培养皿置于SICM样品扫描台上，参比电极置于培养皿的细胞培养液中，并通过负反馈电路实时监测探针内电极与参比电极之间电导的变化。当探针接近细胞表面时，由于允许离子流入玻璃微探针针尖自由空间的减小，离子电导也随之减小。在扫描过程中，SICM负反馈控制电路通过高精度XYZ三维压电陶瓷来保持玻璃探针电极与细胞表面距离的恒定(即非接触)。
在高分辨率膜片钳实施例的具体操作步骤中(图3)，首先用SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台及负反馈扫描控制系统控制玻璃电极探针在细胞表面非接触地扫描并获得细胞膜表面的高分辨率成像；在负反馈和扫描控制系统帮助下膜片钳玻璃电极非接触精确定位于样品表面待研究的特定纳米尺度微结构上；关闭负反馈和扫描控制系统，再像传统膜片钳一样完成玻璃电极与细胞膜片兆欧姆封接及进行离子通道记录。这种高分辨率的膜片钳技术可被方便地用于研究多种细胞膜上纳米尺度微结构中离子通道的“开”、“闭”动力学、离子通透性等，从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能的关系提供了全新的技术手段。
以上所述仅为本实用新型基于英国IONSCOPE公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微镜技术融合美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳技术所建立的活体细胞的高分辨率膜片钳技术手段，应当指出，对于本领域的技术人员来说，依据本实用新型的构成方式和操作原理，还可以将其他扫描探针显微镜技术与其他商用膜片钳系统相结合而建立类似的高分辨率膜片钳系统，这些均落入本实用新型的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳装置，其特征在于它包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、SICM样品扫描台、SICM负反馈扫描控制电路、SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台、商用膜片钳前置电流功率放大器及膜片钳数模/模数转换器；所说的充满电解液的玻璃微探针和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接；所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模/模数转换器连接；所说的膜片钳数模/模数转换器与SICM负反馈扫描控制电路连接；所说SICM负反馈扫描控制电路与SICM高精度XYZ三维压电陶瓷扫描台；所说的内含细胞与细胞培养液的培养皿置于SICM样品扫描台上。
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| CN106868089A (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-20 | 上海家化联合股份有限公司 | 一种利用皮肤成纤维细胞钾离子通道评价抗衰老功效的方法 |
| CN110514634A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-29 | 华东理工大学 | 基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法 |
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