CN110514634A - 基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，包括如下步骤：(1)将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管；(2)工作电极选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对纳米管进行调整至纳米管尖端插入细胞，通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加200‑800mV的直流电压，通电2‑8min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内；(3)通过叠氮/炔键反应生成正交荧光团标记。本发明提供了一种高精确性单细胞表面的聚糖标记的成像检测，将时间大大缩短，提高了检测的特异性和灵敏度，并且采用纳米电极标记技术减少了非自然糖的实验用量且在操作得当下可进行重复实验。

Description

基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法
技术领域
本发明涉及细胞活体成像分析技术，具体地说，涉及基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法。
背景技术
近年来，研究表明细胞表面聚糖的表达可以为阐明其如结构组成、细胞识别、疾病发生等方面的生物功能作用及其对人类疾病的影响提供有价值的信息。随着使用代谢标记检测细胞表面聚糖这一方法的蓬勃发展，其解决了利用从植物或动物中提取的凝集素对于糖类的识别时选择性差的缺点，大大提高了特异性和成像效果。
所有细胞的表面都装饰着密集的糖链。单糖作为各种糖缀合物的前体，被细胞摄取以构建各种糖基结构。单细胞表面膜聚糖的监测和调控能力在糖生物学、细胞生物学和病理学中发挥着重要作用。因此我们使用了人工糖进行代谢标记，然而，由于代谢标记需要使用非天然糖，这些人工糖通常不加区分地进入细胞，导致大量细胞中聚糖的全局标记。这一限制否定了在单细胞水平上研究聚糖表达谱的能力。研究表面上相同细胞的聚糖表达多样性，对于提高我们在单细胞水平上对遗传异质性的理解至关重要。目前，单细胞技术，特别是单细胞成像技术的发展取得了重大进展。纳米线、纳米管、纳米电极等纳米尺度器件由于具有较高的时空分辨率，在单细胞研究中显示出巨大的应用前景。值得注意的是，插入基于玻璃纳米管的无损装置可以分析单个活细胞中的特定分子。纳米管制备方便，使用方便。纳米管具有超小的尖端面积(直径小于100纳米)，为精确定位和运输单个活细胞提供了良好的工具，且损伤小。
目前，多种检测细胞表面聚糖的方法已被提出。其中传统检测方法是通过体外内吞作用从而进行表达，时间长且选择性差，无法实现单细胞的研究分析。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可快速检测单个细胞表面聚糖的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管；
(2)纳米管中有一个电极作为工作电极插入充满细胞的溶液中，另一个电极作为参比电极浸入培养基中，工作电极选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对纳米管进行调整至纳米管尖端插入细胞，通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加200-800mV的直流电压，通电2-8min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内；
(3)将步骤(2)选定的细胞放回培养箱中继续孵育使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育，使带有炔基的荧光染料与细胞表面含叠氮基的糖结合，或者带有叠氮基的荧光染料与细胞表面含炔基的糖结合，随后用细胞培养液冲洗，使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。
作为一个优选方案，所述纳米管的孔径为50-100nm。
作为一个优选方案，步骤(1)中采用离心方法将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管，离心时的参数优选为3000rpm，3min。
作为一个优选方案，步骤(2)施加400mV的直流电压，通电5min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内。
作为一个优选方案，步骤(3)中将选定的细胞放回培养箱中继续孵育6-15h使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育30-40min。
作为一个优选方案，所述含叠氮基或炔基的糖是指含叠氮基或炔基的甘露糖、岩藻糖或葡萄糖。
本发明的优点在于，
(1)针对传统方法操作复杂、特异性不高且操作时间长的问题，本方法提供了一种高精确性单细胞表面的聚糖标记的成像检测，将时间大大缩短，提高了检测的特异性和灵敏度。
(2)本实验中所用到的非自然糖的价格昂贵，依照传统方法进行实验用量多花费巨大，而采用纳米电极标记技术则减少了实验用量且在操作得当下可进行重复实验。
(3)该纳米电极标记技术还可对于单个细胞间的差异性，特异性可做进一步的研究。
(4)针对单细胞层面聚糖标记分析手段缺乏的问题，本发明采用生物正交标记技术以及荧光成像技术，待人工糖进入细胞在膜表面表达后，利用显微镜对细胞进行原位成像，实现了单细胞层面上聚糖检测。
(5)本发明设计的快速检测单个细胞表面聚糖，并将其用于活细胞内聚糖的原位成像检测，为研究膜表面聚糖在糖生物学、细胞生物学和病理学中发挥的重要作用提供了新方法。
附图说明
图1是纳米管标记单细胞糖基示意图。
图2在不同孵育时间，注射时间及施加电压下的荧光效果图。
图3为对比传统方法与纳米电极辅助方法间的荧光效果图。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
本发明中我们采用了一种基于微侵袭的玻璃纳米管的单细胞靶向代谢糖标记策略的开发。纳米管中有一个Ag/AgCl电极作为工作电极，另一个Ag/AgCl作为参比电极浸入培养基中，纳米粒子的超小尖端能够精确定位所选的单个活细胞，纳米管利用电渗流将人工叠氮甘露糖分子(ManNAz)注入细胞质。进一步，通过与唾液酸生物合成途径结合在细胞表面表达(SiaNAz)，通过叠氮/炔键反应生成正交荧光团标记。
实施例1.
(1)根据已有文献，拉制100nm左右的玻璃管。将采用P-2000型激光拉制器，以石英毛细管(外径1.00mm，内径0.7mm)为原料，采用单拉循环法制备纳米管。最优孔径为100nm，该拉制参数为Line1:heat-650,fil-3,vel-35,del-145and pul-75；Line2:heat-920,fil-2,vel-15,del-128and pul-200。在该参数下，纳米管的平均孔径约为100nm。
(2)细胞采用传统方法进行培养。MCF-7细胞培养：RPMI 1640、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。HeLa,RAW264.7细胞培养：DMEM、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。培养瓶和培养皿中的细胞均在37℃，5％的二氧化碳环境下培养。
(3)将含叠氮基的甘露糖(ManNAz)离心(3000rpm,3min)至管底后，加入0.2mmol的PBS缓冲溶液后稀释至10mmol。再用微量注射器从拉制成的玻璃管的后端缓慢注入10μL的ManNAz后，采用离心方法(3000rpm,3min)从而保证溶液能够完全到达管尖。在离心过程中采用蓝钉固定纳米管，防止针尖破坏。
(4)为了形成电连接，将银电极与移液管体内的溶液连接，另一端插入充满细胞的溶液中。选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对玻璃管进行调整至玻璃管尖端插入细胞。通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加400mV的直流电压，通电,5min将该甘露糖注入细胞质内。
(5)将该细胞放回培养箱中继续孵育6h使该甘露糖在细胞表面表达后，加入15μL的带有炔基的生物正交荧光团再孵育40min使其与细胞表面的人工糖结合，随后用细胞培养液冲洗三次。最后使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。
实施例2.
(1)根据已有文献，拉制80nm左右的玻璃管。
(2)细胞采用传统方法进行培养。MCF-7细胞培养：RPMI 1640、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。HeLa,RAW264.7细胞培养：DMEM、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。培养瓶和培养皿中的细胞均在37℃，5％的二氧化碳环境下培养。
(3)将含炔基的岩藻糖离心(3000rpm,3min)至管底后，加入0.2mmol的PBS缓冲溶液后稀释至10mmol。再用微量注射器从拉制成的玻璃管的后端缓慢注入10μL的含炔基的岩藻糖后，采用离心方法(3000rpm,3min)从而保证溶液能够完全到达管尖。在离心过程中采用蓝钉固定纳米管，防止针尖破坏。
(4)为了形成电连接，将银电极与移液管体内的溶液连接，另一端插入充满细胞的溶液中。选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对玻璃管进行调整至玻璃管尖端插入细胞。通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加600mV的直流电压，通电3min将该甘露糖注入细胞质内。
(5)将该细胞放回培养箱中继续孵育8h使该岩藻糖在细胞表面表达后，加入15μL的带有叠氮基的生物正交荧光团再孵育30min使其与细胞表面的人工糖结合，随后用细胞培养液冲洗三次。最后使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。
实施例3.
(1)根据已有文献，拉制100nm左右的玻璃管。
(2)细胞采用传统方法进行培养。MCF-7细胞培养：RPMI 1640、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。HeLa,RAW264.7细胞培养：DMEM、胎牛血清(10％)，链霉素(100μg mL-1)和青霉素(100μg mL-1)配制培养液。培养瓶和培养皿中的细胞均在37℃，5％的二氧化碳环境下培养。
(3)将含叠氮基的甘露糖(ManNAz)离心(3000rpm,3min)至管底后，加入0.2mmol的PBS缓冲溶液后稀释至10mmol。再用微量注射器从拉制成的玻璃管的后端缓慢注入10μL的ManNAz后，采用离心方法(3000rpm,3min)从而保证溶液能够完全到达管尖。在离心过程中采用蓝钉固定纳米管，防止针尖破坏。
(4)为了形成电连接，将银电极与移液管体内的溶液连接，另一端插入充满细胞的溶液中。选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对玻璃管进行调整至玻璃管尖端插入细胞。通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加不同电压200mV,400mV,600mV,800mV的直流电压，通电5min将该甘露糖注入细胞质内。将该细胞放回培养箱中继续孵育6h使该甘露糖在细胞表面表达后，加入15μL的带有炔基的生物正交荧光团再孵育40min使其与细胞表面的人工糖结合，随后用细胞培养液冲洗三次。最后使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。发现在200-800mV内均有荧光，400mV时荧光最强。
(5)之后在施加400mV电压下，通电5min将该甘露糖注入细胞质内。将该细胞放回培养箱中继续孵育不同时间5h,6h及15h使该甘露糖在细胞表面表达后，加入15μL的带有炔基的生物正交荧光团再孵育40min使其与细胞表面的人工糖结合，随后用细胞培养液冲洗三次。最后使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。发现在6-15h内均有荧光，6h时荧光最强。
(6)最后在施加400mV电压下，通电不同时间2min,3min,5min,8min将该甘露糖注入细胞质内。将该细胞放回培养箱中继续孵育6h使该甘露糖在细胞表面表达后，加入15μL的带有炔基的生物正交荧光团再孵育40min使其与细胞表面的人工糖结合，随后用细胞培养液冲洗三次。最后使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。发现在2-8min内均有荧光，5min时荧光最强(参见图2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管；
(2)纳米管中有一个电极作为工作电极插入充满细胞的溶液中，另一个电极作为参比电极浸入培养基中，工作电极选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对纳米管进行调整至纳米管尖端插入细胞，通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加200-800mV的直流电压，通电2-8min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内；
(3)将步骤(2)选定的细胞放回培养箱中继续孵育使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育，使带有炔基的荧光染料与细胞表面含叠氮基的糖结合，或者带有叠氮基的荧光染料与细胞表面含炔基的糖结合，随后用细胞培养液冲洗，使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。
2.根据权利要求1所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，所述纳米管的孔径为50-100nm。
3.根据权利要求1所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，步骤(1)中采用离心方法将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管。
4.根据权利要求3所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，离心时的参数为3000rpm，3min。
5.根据权利要求1所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，步骤(2)施加400mV的直流电压，通电5min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内。
6.根据权利要求1所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，步骤(3)中将选定的细胞放回培养箱中继续孵育6-15h使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育30-40min。
7.根据权利要求1所述的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，所述含叠氮基或炔基的糖是指含叠氮基或炔基的甘露糖、岩藻糖或葡萄糖。
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