CN115015176B - 一种光学衍射层析成像增强方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种光学衍射层析成像增强方法和装置，所述方法包括：获取标记预处理后的生物样品，其中，标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变初始生物样品内目标结构的物理光学属性；基于标记预处理后的生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据，其中，光学衍射层析成像用于实现标记预处理后的生物样品的特异性成像和超分辨检测。本发明基于生物样品折射率的特异性调控，实现光学衍射层析成像的特异性成像功能。
Description
技术领域
本发明涉及光学成像技术领域，尤其涉及一种光学衍射层析成像增强方法和装置。
背景技术
光学成像是指利用基于光学原理的成像手段结合光学探针对生物样品（如细胞、组织乃至生物体）进行光学探测，来获得其中生物学信息的方法。目前，光学成像被广泛应用于细胞生物学、神经科学、脑科学等科学研究领域。常用的光学成像大多基于荧光成像原理，使用荧光标记物来对特定分子或物质进行标记进行特异性成像，但仍存在标记不均匀、光毒性、光漂白、荧光剂干扰细胞功能、荧光剂无法标记小分子等问题，同时，使用荧光成像进行亚细胞器结构研究时，只能同时看到3-4 个亚细胞器结构的变化，而实际过程中，生物样品在某些实验刺激下（如光、电、pH值变化、温度、湿度、二氧化碳浓度、氧气等）会发生多种细胞器的同时变化，因此，使用荧光成像无法实现对细胞全貌的监测。
现有技术中，光学衍射层析技术（ODT）是一种新型非标记、非侵入的三维显微成像技术。基于光场的衍射效应和定量相位成像技术，ODT可以精确地测量生物样品的三维折射率信息，在细胞生物学中得到了广泛的应用。然而，ODT的成像效果取决于样品折射率的相对折射率分布。各类细胞器在细胞内的三维空间排列紧密，导致折射率相近的细胞器无法很好的区分识别。如高尔基体此类单层膜细胞器，虽然扁平囊的直径为1 μm（远高于ODT的分辨率），但膜厚仅仅6~7 nm，中间呈囊腔状，周缘多呈泡状，折射率与周边细胞器或细胞内液体环境的折射率相似，导致该高尔基体无法被识别；此外，ODT无标记的特点也导致了其无法对某些特定的细胞器实现追踪，限制了ODT在生命医学研究中的应用。
发明内容
本发明提供一种光学衍射层析成像增强方法和装置，用以解决现有技术中荧光成像干扰生物样品生理过程、无法检测细胞全貌的缺陷，实现生物样品折射率的特异性调控和特异性成像。
本发明提供一种光学衍射层析成像增强方法，包括：
获取标记预处理后的生物样品，其中，所述标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变所述初始生物样品内目标结构的物理光学属性；
基于所述标记预处理后的生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据，其中，所述光学衍射层析成像用于实现所述标记预处理后的生物样品的特异性成像和超分辨检测；
所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种；
所述直接标记包括如下至少一种：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法，所述间接标记包括基因敲除方法。
根据本发明提供的光学衍射层析成像增强方法，所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种，包括：
在所述标记预处理包括直接标记的情况下，基于共孵育方式将靶向性探针标记至所述初始生物样品上，改变所述初始生物样品内目标靶点的物理光学属性。
根据本发明提供的光学衍射层析成像增强方法，所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种，包括：
在所述标记预处理包括间接标记的情况下，将报告基因引入所述初始生物样品内，基于所述报告基因翻译后的标记结构，改变所述初始生物样品内靶向细胞器的物理光学属性，其中，所述报告基因翻译后的标记结构包括以下任一项：酶、受体、蛋白。
本发明还提供一种光学衍射层析成像增强装置，包括：
标记预处理模块，用于对初始生物样品进行标记预处理；
样品池模块，用于为基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品提供所需的测试环境，其中，所述标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变所述初始生物样品内目标结构的物理光学属性；
光学衍射层析成像模块，用于对所述样品池模块内的基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据；
所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种；
所述直接标记包括如下至少一种：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法，所述间接标记包括基因敲除方法。
根据本发明提供的光学衍射层析成像增强装置，所述光学衍射层析成像模块，包括：
照明单元，用于为所述样品池模块内的基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的特异性成像提供照明光线；
采集单元，用于采集基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的成像数据；
分析单元，用于处理并定量分析所述成像数据，获取分析数据。
本发明提供的一种光学衍射层析成像增强方法和装置，通过对初始生物样品进行基于直接标记或间接标记的标记预处理，实现对初始生物样品内目标结构的物理光学属性的特异性调控，使得光学衍射层析成像获得特异性，实现高清晰度的超分辨显微成像，提高成像信噪比，且光学衍射层析成像使用的激光功率密度低，产生的光毒性较低，对生物样品的正常生理过程无影响；基于光学衍射层析成像技术，实现对生物样品长时程、三维、多通道和无创的超分辨检测，配合标记预处理，不仅实现从“看的见”到“看的清”的转变，还实现从“看不见”到“看得见”的转变，实现“点面兼顾”的目的，弥补了现有生化技术的短板。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的光学衍射层析成像增强方法的流程示意图之一；
图2是本发明提供的光学衍射层析成像增强方法的流程示意图之二；
图3是本发明提供的光学衍射层析成像增强装置的结构示意图之一；
图4是本发明提供的光学衍射层析成像增强装置的结构示意图之二。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合图1-图2描述本发明的光学衍射层析成像增强方法。
图1是本发明提供的光学衍射层析成像增强方法的流程示意图之一，图2是本发明提供的光学衍射层析成像增强方法的流程示意图之二，如图1-图2所示，该方法包括：
步骤110，获取标记预处理后的生物样品，其中，标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变初始生物样品内目标结构的物理光学属性。
可选地，标记预处理包括直接标记和间接标记的一种。
可选地，在标记预处理包括直接标记的情况下，基于共孵育方式将靶向性探针标记至生物样品上，改变生物样品内目标靶点的物理光学属性。直接标记不涉及生物样品的遗传修饰，靶向性探针在体外培养时可主动与生物样品进行结合，进而改变生物样品内目标靶点的物理光学属性。
可选地，直接标记包括但不限于：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法。
示例地，以高尔基体为例进行质粒转染。由于特定生物样品的折射率与其微环境相差较小，导致其在无标记光学衍射层析成像下是不可见的，特定生物样品包括但不限于：高尔基体、肌动蛋白、单微管。设计可调控目标细胞器折射率的融合蛋白，并使用质粒转染方法，让生物样品表达这种融合蛋白，最终可以使成功转染的生物样品中目标细胞器的折射率远远高于其微环境的折射率，从而实现光学衍射层析成像下特定目标细胞器从“不可见”到“可见”的突破，即为光学衍射层析成像增加特异性成像的能力。将单个细胞视为一个充满蛋白质溶液的容器，细胞有效折射率如式（1）所示：
（1）
其中，为水或者细胞内浆的折射率，/>为折射率增量，/>为蛋白质的质量密度。可知，细胞有效折射率与细胞内蛋白质浓度呈线性关系。基于上述原理，为提高光学衍射层析成像对高尔基体的特异性成像能力，采用对高尔基体具有靶向能力的“Golgi-增强蛋白”对细胞进行质粒转染。转染前，将细胞平铺在培养皿上，并将培养皿放置于含5 %的CO2恒温培养箱中培育孵化24 h，温度恒定为37 ℃，直至实验当日细胞密度应达到60-80%。用无血清培养基洗涤细胞2-3 次，加入1 ml的无血清培养基，随后加入转染试剂，按十字方向轻摇混匀，CO2恒温培养箱中37 ℃再培养24 h；随后将转染液倒出，换为完全培养基继续培养，培养3-4 天后检测蛋白表达量，而未经转染处理的细胞作为对照组用于对比实验。将质粒转染预处理后的生物样品以及对照组生物样品置入样品池模块202中，并使用光学衍射层析成像模块203对其进行显微成像，收集并定量分析相对应的成像数据。
示例地，基于抗原抗体特异性反应的原理，将已知的抗体/抗原标记上生物蛋白，再用修饰过的抗体/抗原作为分子探针，检测生物样品内的目标蛋白，在生物样品目标细胞器处形成属于生物大分子的抗原/抗体络合物。采用光学衍射层析成像观察经标记预处理的生物样品，由于抗原/抗体络合物的存在，生物样品的折射率与其周围环境的折射率发生较大变化，因此，成像数据的信噪比提升，可清晰地看到生物样品内目标细胞器，从而便于对目标蛋白所形成的结构进行进一步的分析。
示例地，以靶向性探针靶向结合线粒体为例。传统探针中，无论是有机探针、无机探针、小分子化合物、大分子聚合物，其物理属性与生物样品内的相关介质均有较大的差距，相关介质包括胞浆、各种细胞器。因此，采用具有靶向亚细胞器能力的靶向性探针实现光学衍射层析成像的特异成像，靶向性探针包括但不限于：量子点、碳纳米管、上转换材料、下转换材料、有机小分子、有机共轭聚合物。为提高光学衍射层析成像对线粒体的成像信噪比，设计了可靶向线粒体的探针，通过分子工程将通常用作线粒体靶向基团的亲脂性阳离子链接到分子探针上，其中，分子工程包括但不限于：点击化学反应、脱水缩合反应，亲脂性阳离子包括但不限于：三苯基TPP。具体步骤为：将生长状态良好的细胞或者细菌及各种微生物样品，以适宜的密度接种于多个培养皿上，将培养皿放置于含5 %的CO2恒温培养箱中，并在37 ℃下恒温培育孵育24 h。待细胞样品贴壁，达到使用状态后，从CO2恒温培养箱中取出培养皿，使用移液枪将培养皿中的培养基吸出，加入适合浓度的靶向各类细胞器的分子探针。对生物样品进行标记预处理后，将培养皿放入含5 %的CO2恒温培养箱中37 ℃下继续培育孵育4 h后拿出备用。
可选地，在标记预处理包括间接标记的情况下，将报告基因引入生物样品内，基于报告基因翻译后的标记结构，改变生物样品内靶向细胞器的物理光学属性，其中，报告基因翻译后的标记结构包括以下任一项：酶、受体、蛋白。间接标记包括但不限于基因敲除方法。
步骤120，基于标记预处理后的生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据，其中，光学衍射层析成像用于实现标记预处理后的生物样品的特异性成像和超分辨检测。
本发明提供的光学衍射层析成像增强方法，通过对初始生物样品进行基于直接标记或间接标记的标记预处理，实现对初始生物样品内目标结构的物理光学属性的特异性调控，使得光学衍射层析成像获得特异性，实现高清晰度的超分辨显微成像，提高成像信噪比，且光学衍射层析成像成像时的激光功率密度低，产生的光毒性较低，对生物样品的正常生理过程无影响；基于光学衍射层析成像技术，实现对生物样品长时程、三维、多通道和无创的超分辨检测，配合标记预处理，不仅实现从“看的见”到“看的清”的转变，还实现从“看不见”到“看得见”的转变，实现“点面兼顾”的目的，弥补了现有生化技术的短板。
下面对本发明提供的光学衍射层析成像增强装置进行描述，下文描述的光学衍射层析成像增强装置与上文描述的光学衍射层析成像增强方法可相互对应参照。
图3是本发明提供的光学衍射层析成像增强装置的结构示意图之一，如图3所示，光学衍射层析成像增强装置200包括：标记预处理模块201、样品池模块202、光学衍射层析成像模块203，其中：
标记预处理模块201，用于对初始生物样品进行标记预处理；
样品池模块202，用于为基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品提供所需的测试环境，测试环境包括但不限于：温度、湿度、CO2浓度、pH值，其中，标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变初始生物样品内目标结构的物理光学属性；
光学衍射层析成像模块203，用于对样品池模块202内的基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据。
本发明提供的光学衍射层析成像增强装置，通过对初始生物样品进行基于直接标记或间接标记的标记预处理，实现对初始生物样品内目标结构的物理光学属性的特异性调控，使得光学衍射层析成像获得特异性，实现高清晰度的超分辨显微成像，提高成像信噪比，且光学衍射层析成像成像时的激光功率密度低，产生的光毒性较低，对生物样品的正常生理过程无影响；基于光学衍射层析成像技术，实现对生物样品长时程、三维、多通道和无创的超分辨检测，配合标记预处理，不仅实现从“看的见”到“看的清”的转变，还实现从“看不见”到“看得见”的转变，实现“点面兼顾”的目的，弥补了现有生化技术的短板。
可选地，
标记预处理包括直接标记和间接标记的一种。
可选地，
在标记预处理包括直接标记的情况下，基于共孵育方式将靶向性探针标记至生物样品上，改变生物样品内目标靶点的物理光学属性。直接标记包括：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法。
可选地，
在标记预处理包括间接标记的情况下，将报告基因引入生物样品内，基于报告基因翻译后的标记结构，改变生物样品内靶向细胞器的物理光学属性，其中，报告基因翻译后的标记结构包括以下任一项：酶、受体、蛋白。间接标记包括基因敲除方法。
可选地，图4是本发明提供的光学衍射层析成像增强装置的结构示意图之二，如图4所示，光学衍射层析成像模块203包括：照明单元2031、采集单元2032、分析单元2033，其中：
照明单元2031，用于为样品池模块202内的基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的特异性成像提供照明光线；
采集单元2032，用于采集基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的成像数据；
分析单元2033，用于处理并定量分析成像数据，获取分析数据。
可选地，光学衍射层析成像模块203正对着样品池模块202，照明单元2031包括多处位于样品池模块202上方的照明光路，采集单元2032包括位于样品池模块202下方的收集信号光路。
可选地，分析单元2033采用如Image J的图像处理软件对采集的数据进行定量分析，包括但不限于：增强对比度和信号强度的分析。与荧光成像相比，光学衍射层析成像模块203中使用的激光功率极低，产生的光毒性、光漂白等不良反应较弱，不会对细胞的正常生理反应产生影响。同时，在图像分析中优化图片质量和分辨率的同时，也需确保图片仍能反映其原始信息。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种光学衍射层析成像增强方法，其特征在于，包括：
获取标记预处理后的生物样品，其中，所述标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变所述初始生物样品内目标结构的物理光学属性；
基于所述标记预处理后的生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据，其中，所述光学衍射层析成像用于实现所述标记预处理后的生物样品的特异性成像和超分辨检测；
所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种；
所述直接标记包括如下其中一种：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法，所述间接标记包括基因敲除方法；
在所述标记预处理包括直接标记的情况下，基于共孵育方式将靶向性探针标记至所述初始生物样品上，改变所述初始生物样品内目标靶点的物理光学属性；
在所述标记预处理包括间接标记的情况下，将报告基因引入所述初始生物样品内，基于所述报告基因翻译后的标记结构，改变所述初始生物样品内靶向细胞器的物理光学属性，其中，所述报告基因翻译后的标记结构包括以下任一项：酶、受体、蛋白。
2.一种光学衍射层析成像增强装置，其特征在于，包括：
标记预处理模块，用于对初始生物样品进行标记预处理；
样品池模块，用于为基于标记预处理后的生物样品和对照组生物样品提供所需的测试环境，其中，所述标记预处理用于对初始生物样品进行成像标记，改变所述初始生物样品内目标结构的物理光学属性；
光学衍射层析成像模块，用于对所述样品池模块内的基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品，进行光学衍射层析成像，获取特异性成像数据及分析数据；
所述标记预处理包括直接标记和间接标记的一种；
所述直接标记包括如下其中一种：质粒转染方法、抗体特异性结合方法、具有靶向性的纳米粒子靶向结合方法，所述间接标记包括基因敲除方法；
在所述标记预处理包括直接标记的情况下，基于共孵育方式将靶向性探针标记至所述初始生物样品上，改变所述初始生物样品内目标靶点的物理光学属性；
在所述标记预处理包括间接标记的情况下，将报告基因引入所述初始生物样品内，基于所述报告基因翻译后的标记结构，改变所述初始生物样品内靶向细胞器的物理光学属性，其中，所述报告基因翻译后的标记结构包括以下任一项：酶、受体、蛋白。
3.根据权利要求2所述的光学衍射层析成像增强装置，其特征在于，所述光学衍射层析成像模块，包括：
照明单元，用于为所述样品池模块内的基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的特异性成像提供照明光线；
采集单元，用于采集基于所述标记预处理后的生物样品和对照组生物样品的成像数据；
分析单元，用于处理并定量分析所述成像数据，获取分析数据。
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