CN101430321A - 非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜及其工作方法 - Google Patents

Abstract

一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜，其特征在于它包括纳米玻璃探针、两个电极、高速Z向平板压电陶瓷、前置电流放大器、锁相放大器、数据采集模块、DSP控制模块、高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台及计算机；工作方法为：离子电流信号输入给DSP控制模块；Z向平板压电陶瓷的上下高速运动；控制高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台上生物样品与高速Z向运动的纳米玻璃探针的非接触状态；生成生物样品的三维拓扑图。优越性在于：既有效防止了探针与生物样品表面的接触，又因为玻璃微探针有足够的运动幅度和运动速度，进而弥补了传统扫描控制方法扫描高度差异大的形态复杂的生物样品时的不足。

Description

非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜及其工作方法

(一)技术领域：

本发明属于生物学探测用扫描探针显微镜技术领域，特别是指一种在生理培养液体中非接触式实时探测活体生物样品的扫描纳米玻璃探针显微镜技术，即一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜及其工作方法。

(二)背景技术：

随着纳米技术的飞速发展，高分辨率地实时探测活体生物样品一直以来都是纳米生物医学专家，尤其是那些从事纳米尺度生物样品显微成像的专家们所必需面对的技术挑战。普通光学显微镜由于受到光学衍射极限的限制，其用于生物样品探测的最高分辨率很难突破250纳米。电镜尽管具有足够高的分辨率，但需要对生物样品进行固化和特别处理以实现样品的导电性，这势必会改变、甚至破坏样品表面的微观结构，因此不适合活体生物样品的实时观测。

1981年美国IBM公司设在瑞士苏黎士的实验室，研制出了世界上第一台具有原子分辨率的扫描隧道显微镜(scanning tunnelling microscopy，STM)，并带来了纳米技术的迅猛发展，成为了人类认识微观世界的有力工具。近年来，在STM的原理与结构的基础上，相继产生了一系列利用探针与样品的不同相互作用来探测纳米尺度下表面或界面性质的扫描探针显微镜技术(scanning probe microscopy，SPM)。为了弥补STM只限于观测导体和半导体表面结构的缺陷，Binnig等人发明了原子力扫描探针显微镜技术(atomicforce microscopy，AFM)^[1]。AFM是一种专为研究非导电样品而设计的基于STM控制技术的SPM，它通过探测探针尖端的原子与样品表面的原子之间产生极其微弱的相互作用力，并利用该原子之间作用力的微弱变化来负反馈控制探针在样品表面扫描。AFM因采用轻敲模式(Tapping mode)克服了接触模式的某些不足，使高分辨率研究活体生物样品成为可能^[2]。由于AFM显微镜技术利用探针与生物样品表面间的作用力为负反馈控制来进行扫描，AFM扫描过程中需要探针与生物样品表面进行或多或少的接触，即使是探针与生物样品表面间的轻微接触也会对样品细胞活性及表面微结构产生或多或少的影响^[3]。国内一些单位也逐步尝试用非接触模式的AFM来探测生物样品，控制探针在样品表面上方一定距离处扫描且始终不与样品表面接触，因而针尖不会对样品造成污染或产生破坏，避免了轻敲模式中遇到的一些问题。然而，在非接触模式下，虽然采用针尖振动调制控制可以增加AFM显微镜的灵敏度，但相对较长的针尖-样品间距使得分辨率要低于轻敲模式。加之在实际操作中，由于针尖很容易被样品表面吸附气体的表面压吸附到样品表面，造成图像数据的不稳定和对样品的损坏，使非接触模式的AFM操作及在液体中成像比较困难，因而不能适应柔软活体细胞在生理状态下进行实时探测的需要。

1989年，加州大学的Hansma教授利用扫描探针显微镜的负反馈控制技术，用玻璃微探针作为扫描探针设计出了非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanning ion conductance microscopy，SICM)^[4]。但是由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品表面接触并导致针尖或样品的毁损，所以扫描离子电导显微镜技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的PET薄膜的扫描成像。1997年英国伦敦帝国理工学院的Korchev教授对扫描离子电导探针显微镜的负反馈控制等技术进行重大改进后，使该显微镜技术实现了对活体生物样品表面结构的非接触三维实时探测^[5]，并逐步成为纳米生物医学研究领域具有发展潜力及应用前景的一种扫描探针显微镜技术^[6]。扫描离子电导显微镜技术与目前使用的用于生物样品探测的其它显微镜技术相比，具有以下特点：非接触式探测，样品制备简单，可以直接用于生理液态培养环境下活体生物样品表面微观结构的高分辨率实时探测。

扫描离子电导显微镜技术的基本操作原理如文献报道^[7，8]。具体来说，如图1所示：将Ag/AgCl电极置于充满电解液的玻璃微探针中作为扫描探针，内含生物样品与细胞培养液的培养皿置于扫描离子电导显微镜的样品扫描台上，参比电极置于培养皿的细胞培养液中，并通过负反馈电路实时监测探针内电极与参比电极之间电导的变化。当探针接近生物样品表面时，由于允许离子流入玻璃微探针针尖自由空间的减小，离子电导也随之减小。在扫描过程中，扫描离子电导显微镜控制电路通过压电陶瓷来操控玻璃微探针上下移动以保持电导守恒，从而保持玻璃微探针以接近针尖尖端内半径r的距离d在生物样品表面非接触地扫过，图中带箭头的虚线代表了玻璃微探针在样品表面扫描的轨迹，通过电脑记录扫描范围内的玻璃微探针的位置及扫描轨迹便可获得该生物样品扫描范围表面的三维拓扑形貌。

目前普遍采用交流调制(AC)负反馈控制模式并以经调制的流入玻璃微探针的离子电流(I_AC)作为负反馈信号来调节探针与样品之间的距离^[9]。在AC模式下，为了保持稳定的负反馈控制，玻璃微探针与细胞表面间保持的恒定距离d应接近于玻璃微探针的内半径r，更重要的是随着探针与样品间的距离越来越近时，I_AC的变化对针尖-样品距离的变化越来越敏感，微小距离的改变便可引起I_AC产生很大的改变，这种AC负反馈控制模式使我们在实验过程中可以对因直流漂移、电极堵塞、溶液离子强度变化和电压变化造成的离子电流变化进行有效的补偿^[11]，从而保证了扫描过程中玻璃微探针与平整的活体生物样品之间的非接触。然而，因为扫描离子电导显微镜的分辨率与玻璃微探针尖端内半径尺寸的数量级相同，随着对扫描离子电导显微镜的纳米尺度分辨率要求的提高，扫描用玻璃微探针越来越细、尖端内半径尺寸越来越小，导致负反馈控制下的扫描纳米玻璃微探针离生物样品越来越近。如要达到50纳米的高分辨率，探针在负反馈控制下距生物样品50纳米左右的高度扫过生物样品表面。由于探针离生物样品太近，在扫描高度差异很大的形态复杂的生物样品时，目前的扫描离子电导显微镜探针的扫描轨迹不能很好地跟随生物样品表面形貌的复杂高度变化，甚至会在扫描时意外地与高度急剧变化的生物样品表面接触并导致针尖或样品的毁损使其研究领域和扫描速度受到了很大限制。如呈三角形或多角形的神经细胞，可以分为胞体、树突和轴突这三个区域，胞体的大小差异很大，直径从5～6μm到100μm以上；突起的形态、数量和长短也大不相同，其中轴突直径约15-25微米；树突直径0.5-1微米。由于这三个区域的高度差异大于数十微米，在扫描离子电导显微镜用纳米尺度的玻璃微探针进行的神经细胞形态观察中，若想在同一次扫描中同时得到三个区域的纳米尺度的高分辨率成像，显微镜负反馈控制系统必需控制玻璃微探针在距离样品表面纳米尺度的距离的同时，并频繁进行数十微米高度的快速位置变化，这在目前的扫描离子电导显微镜扫描控制模式下难以迅速实现。

(三)发明内容：

本发明的发明目的在于设计一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜及其工作方法，它针对现有扫描离子电导显微镜扫描控制技术中的不足，提供一种既能够有效防止与生物样品接触的高分辨率的快速扫描控制方法，又能保证扫描离子电导显微镜技术可以完成活体生物样品表面复杂形貌的快速非接触扫描探测。

本发明的技术方案：一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜，其特征在于它包括纳米玻璃探针、两个电极、高速Z向平板压电陶瓷、前置电流放大器、锁相放大器、数据采集模块、DSP控制模块、高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台及计算机；其中一个电极置于固定于高速Z向上下运动的平板压电陶上的纳米玻璃探针中，另一电极置于细胞培养液中作为参比电极，两电极之间产生的流入纳米玻璃探针的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；所说的锁相放大器的输出端连接数据采集模块的输入端；所说的数据采集模块的输出端连接DSP控制模块的输入端；所说的DSP控制模块与计算机呈双向连接；所说的DSP控制模块包括调制控制单元和负反馈控制单元，其中调制控制单元的输出端连接高速Z向平板压电陶瓷的输入端，负反馈控制单元的输出端连接高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台；所说的高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台的输出端连接计算机的输入端。

上述所说的电极为Ag/AgCl电极。

上述所说的计算机包括信号处理分析单元及图像生成单元。

一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜的工作方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)两电极之间产生的流入纳米玻璃探针的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；再经数据采集模块进行模数转换后，输入给DSP控制模块；

(2)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，通过调制控制单元调制控制固定有纳米玻璃探针的独立Z向平板压电陶瓷的上下高速运动，完成纳米玻璃探针针尖对生物样品表面形貌的感知；

(3)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，对流入纳米玻璃探针的离子电流信号进行处理分析，再通过实时DSP负反馈控制单元来控制高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台上生物样品与高速Z向运动的纳米玻璃探针的非接触状态；

(4)通过计算机进行信号处理分析得到高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台在不同扫描点的空间位置并生成生物样品的三维拓扑图。

本发明的优越性在于：本发明中纳米玻璃微探针不必紧贴细胞样品表面扫描，从而在生物样品的高分辨率探测中，既有效防止了探针与生物样品表面的接触，又因为玻璃微探针有足够的运动幅度和运动速度，进而弥补了传统扫描控制方法扫描高度差异大的形态复杂的生物样品时的不足。

(四)附图说明：

图1为现有技术中扫描离子电导显微镜的工作原理图(其中，带箭头的虚线代表了玻璃微探针在样品表面接触扫描的相对运动轨迹)。

图2为本发明所涉一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜的工作原理的结构示意图(其中，带箭头的虚线为纳米玻璃微探针在样品表面非接触扫描的相对运动轨迹)。

其中，1为纳米玻璃探针，2为高速Z向平板压电陶瓷，3为电极，4为细胞。

(五)具体实施方式：

实施例：一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜(见图2)，其特征在于它包括纳米玻璃探针1、两个电极3、高速Z向平板压电陶瓷2、前置电流放大器、锁相放大器、数据采集模块、DSP控制模块、高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台及计算机；其中一个电极置于固定于高速Z向上下运动的平板压电陶2上的纳米玻璃探针中，另一电极置于细胞4培养液中作为参比电极，两电极3之间产生的流入纳米玻璃探针玻璃微探针1的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；所说的锁相放大器的输出端连接数据采集模块的输入端；所说的数据采集模块的输出端连接DSP控制模块的输入端；所说的DSP控制模块与计算机呈双向连接；所说的DSP控制模块包括调制控制单元和负反馈控制单元，其中调制控制单元的输出端连接高速Z向平板压电陶瓷2的输入端，负反馈控制单元的输出端连接高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台；所说的高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台的输出端连接计算机的输入端。

上述所说的电极3为Ag/AgCl电极。

上述所说的计算机包括信号处理分析单元及图像生成单元。

一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜的工作方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)两电极3之间产生的流入纳米玻璃探针1的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；再经数据采集模块进行模数转换后，输入给DSP控制模块；

(2)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，通过调制控制单元调制控制固定有纳米玻璃探针1的独立Z向平板压电陶瓷2的上下高速运动，完成纳米玻璃探针1针尖对生物样品表面形貌的感知；

(3)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，对流入纳米玻璃探针1的离子电流信号进行处理分析，再通过实时DSP负反馈控制单元来控制高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台上生物样品与高速Z向运动的纳米玻璃探针1的非接触状态；

(4)通过计算机进行信号处理分析得到高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台在不同扫描点的空间位置并生成生物样品的三维拓扑图。

以上所述仅为本发明用于复杂形貌的活体生物样品的高分辨率非接触快速探测方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，依据本发明的原理，还可以将该技术直接用于导电样品、半导体样品的探测，这些均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1、一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜，其特征在于它包括纳米玻璃探针、两个电极、高速Z向平板压电陶瓷、前置电流放大器、锁相放大器、数据采集模块、DSP控制模块、高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台及计算机；其中一个电极置于固定于高速Z向上下运动的平板压电陶上的纳米玻璃探针中，另一电极置于细胞培养液中作为参比电极，两电极之间产生的流入纳米玻璃探针的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；所说的锁相放大器的输出端连接数据采集模块的输入端；所说的数据采集模块的输出端连接DSP控制模块的输入端；所说的DSP控制模块与计算机呈双向连接；所说的DSP控制模块包括调制控制单元和负反馈控制单元，其中调制控制单元的输出端连接高速Z向平板压电陶瓷的输入端，负反馈控制单元的输出端连接高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台；所说的高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台的输出端连接计算机的输入端。

2、根据权利要求1所说的一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜，其特征在于所说的电极为Ag/AgCl电极。

3、根据权利要求1所说的一种非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜，其特征在于所说的计算机包括信号处理分析单元及图像生成单元。

4、一种上述非接触生物探测扫描纳米玻璃探针显微镜的工作方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)两电极之间产生的流入纳米玻璃探针的离子电流信号经前置电流放大器放大后输入锁相放大器；再经数据采集模块进行模数转换后，输入给DSP控制模块；

(2)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，通过调制控制单元调制控制固定有纳米玻璃探针的独立Z向平板压电陶瓷的上下高速运动，完成纳米玻璃探针针尖对生物样品表面形貌的感知；

(3)DSP控制模块保持与计算机的实时通讯，对流入纳米玻璃探针的离子电流信号进行处理分析，再通过实时DSP负反馈控制单元来控制高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台上生物样品与高速Z向运动的纳米玻璃探针的非接触状态；

(4)通过计算机进行信号处理分析得到高精度XYZ三维平板压电陶瓷扫描台在不同扫描点的空间位置并生成生物样品的三维拓扑图。

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