CN102453704A - 植物抗光氧化胁迫基因crtiso及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗光氧化胁迫基因及其应用。本发明揭示了一种对于提高植物抗光氧化胁迫能力有用的基因——类胡萝卜素异构酶(简称CRTISO)基因。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境(如高强光)的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育抵抗高强光的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

Description

植物抗光氧化胁迫基因CRTISO及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术以及植物学领域；更具体地，涉及植物抗光氧化胁迫基因及其应用。

背景技术

光合作用是作物产量的基础，在合适条件下，光合作用所需要的水和二氧化碳并不缺乏，光合作用过程中部分能量转换步骤效率也比较高。可是由于将光能转化与固定为化学能的过程中涉及到一系列复杂的酶促反应，这些酶促反应很容易受不合适温度、光照等外界因素的影响，使光能利用效率显著地降低，如水稻、小麦等主要作物的光能利用率仅为0.5～1.5％，离理论值的5％相差甚远。因此，选育具有抗逆性强的品种是提高作物光合作用重要途径之一。

植物的光合机构对外界因素变动的适应有许多调控途径。类胡萝卜素在高等植物体内具有非常重要的作用，它参与叶绿体光反应系统的组装、光合作用所需光能的吸收与传递以及在胁迫条件下的淬灭过剩激发能的光保护过程。其中，β-carotene、zeaxanthin、violaxanthin、neoxanthin和lutein是参与光合作用的主要色素，它们在叶片中的相对含量是影响植物光保护及其适应外界变化环境的重要因素。此外，类胡萝卜素还是ABA和strigolactones等激素合成的前体分子，因此能间接调节植物的生长与发育过程。

类胡萝卜素的合成在植物的生长过程中受到严格的调控，尤其是种子萌发、光形态建成和果实发育。在类胡萝卜素的合成途径中，类胡萝卜素异构酶(carotenoid isomerase，简称CRTISO)是影响类胡萝卜素的合成并且调节各种色素之间比例的关键酶。缺失了异构酶基因的拟南芥和水稻突变体，lutein的含量都显著下降，其他胡萝卜素的含量不降低。此外，在水稻等高等植物中，叶绿体的光合电子传递途径分为两条，其一是从光系统II至光系统I的线性电子传递链，在这个过程中产生的ATP和NADPH，供给植物细胞以能量和还原力，用于CO₂的同化；其二是围绕光系统I的循环电子传递途径，产生的ATP可以使细胞获得额外的能量、清除有害的活性氧分子。

然而，本领域目前没有关于CRTISO在抗光氧化胁迫方面的发挥作用的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供植物抗光氧化胁迫基因及其应用。

本发明的目的在于提供过表达水稻的种子，转化过表达所需的质粒或农杆菌，以及基因信息。

在本发明的第一方面，提供一种类胡萝卜素异构酶(简称CRTISO)或其编码基因的用途，用于提高植物抗光氧化胁迫能力。

在一个优选例中，所述类胡萝卜素异构酶还用于：

提高植物的株高；

提高植物组织(如叶片)中光系统I的循环电子传递速率；或

减少高光胁迫条件下光合作用热耗散能力的下降。

在另一优选例中，所述类胡萝卜素异构酶是：

(a)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物抗光氧化胁迫能力功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的类胡萝卜素异构酶的编码基因是SEQ ID NO：1中第1941-6017位所示的核苷酸序列；或是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或是它们的简并序列。

在另一优选例中，所述的类胡萝卜素异构酶来源于禾本科植物。

在另一优选例中，所述的类胡萝卜素异构酶来源于水稻。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物抗光氧化胁迫能力的方法，所述方法包括：提高植物中类胡萝卜素异构酶的表达或活性。

在另一优选例中，所述的方法包括：将类胡萝卜素异构酶的编码基因转入植物中。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有类胡萝卜素异构酶的编码基因；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述类胡萝卜素异构酶的编码基因转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了类胡萝卜素异构酶的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种抗光氧化胁迫的植物，其是由前述方法制备获得的转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的启动子，其特征在于，所述的启动子是类胡萝卜素异构酶的启动子(即位于类胡萝卜素异构酶的编码基因上游的启动子；较佳地位于类胡萝卜素异构酶的编码基因上游-1～-3000bp；更佳地位于类胡萝卜素异构酶的编码基因上游-1～-2500bp；更佳地位于类胡萝卜素异构酶的编码基因上游-1～-2000bp)。

在另一优选例中，选自下组：

(1)如SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列的启动子；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达功能的启动子；或

(3)与SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列具有90％以上(优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上)相同性且具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达功能的启动子。

在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达。

在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的启动子。

在另一优选例中，所述构建物中，受光氧化胁迫环境诱导的启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的受光氧化胁迫环境诱导的启动子可操作性连接，用于插入目的基因。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：

所述的启动子；和

目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

在本发明的另一方面，提供一种启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的方法，所述的方法包括：将构建物转化植物，所述的构建物含有所述的受光氧化胁迫环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。

在另一优选例中，所述方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的受光氧化胁迫环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织、器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：转基因植株的GUS染色鉴定。其中，左边为野生型9522的组织；右边是转基因植株的组织，呈绿色。

图2：转基因植株的插入拷贝数鉴定；左边是标准分子量标记，第1道是野生型9522，第2道和第3道是转基因植株oecrtisol(简称oel)的两个重复，箭头所示的是2条阳性条带，说明转基因植株中有2个外源基因的拷贝。

图3：转基因植株插入位点示意图。

图a显示插入在LOC_Os06g02260.1基因的3’-UTR和相邻基因LOC_Os06g02250.1的3’-UTR中间的一个拷贝；

图b显示插入位点是LOC_Os08g08030.1基因的第一个内含子上第653位核苷酸上的拷贝。

图4：转基因植株OsCRTISO基因的表达量检测；半定量RT-PCR结果显示3个oel的重复中目的基因OsCRTISO基因的表达量都高于9522。

图5：过表达植株oecrtisol抗高光氧化胁迫的特性分析；在2000μmol.m^-2.s^-1条件下处理3小时后，oecrtisol较野生型9522(WT)的光能热耗散NPQ更高，说明过表达植株oecrtisol更适应高强光胁迫的环境。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，找到一种对于提高植物抗光氧化胁迫能力有用的基因——类胡萝卜素异构酶(简称CRTISO)基因。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境(高强光)的抵抗力。本发明为运用转基因等分子育种技术培育抵抗高强光的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

本发明中，对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物；特别是单子叶植物。例如，所述的植物包括(但不限于)：水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物、十字花科植物、蔷薇科植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：禾本科的水稻，小麦，大麦，黑麦；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是禾本科的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的类胡萝卜素异构酶”、“分离的CRTISO蛋白”或“分离的CRTISO多肽”是指CRTISO蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CRTISO蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“高(强)光环境”或“光氧化胁迫环境”是指一种环境，其中光的强度大于常规环境。例如光强度高于1000μmol m^-2 s^-1；更佳地高于2000μmol m^-2 s^-1。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括CRTISO蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的CRTISO蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“CRTISO蛋白”指具有提高植物抗光氧化胁迫能力的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗光氧化胁迫能力的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CRTISO蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与CRTISO蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CRTISO蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含CRTISO蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了CRTISO蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有CRTISO蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供CRTISO蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然CRTISO蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“CRTISO蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn

Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明CRTISO蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1中第1941-6017位或SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2序列的蛋白，但与SEQ ID NO：1中第1941-6017位或SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的CRTISO蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CRTISO蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CRTISO蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码CRTISO蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，CRTISO蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CRTISO蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用CRTISO蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CRTISO蛋白的转录产物。

本发明还涉及一种改良作物的方法，该方法包括提高所述植物中CRTISO基因的表达或蛋白活性。从而使得所述植物具有更优良的抗逆境(特别是对抗高强光环境)能力。

增加CRTISO基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带CRTISO编码基因的表达构建物使植株过表达CRTISO；或可通过用强启动子驱动从而增强CRTISO基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该CRTISO基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

作为本发明的一种优选方式，获得CRTISO高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有CRTISO蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该CRTISO蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述CRTISO蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明还包括CRTISO蛋白或其编码基因的激动剂。由于CRTISO的激动剂可调节CRTISO的活性或表达，因此，所述的CRTISO的激动剂也可通过对CRTISO的影响来提高植物的抗逆境能力(特别是对抗高强光环境)，从而达到性状改良的目的。

所述的CRTISO的激动剂是指任何可提高CRTISO的活性、维持CRTISO的稳定性、促进CRTISO表达、延长CRTISO有效作用时间、或促进CRTISO的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物的抗逆境(特别是高强光环境)能力有用的物质。

所述的CRTISO蛋白或其编码基因还可作为植物抗高光胁迫能力分析的一种分子标记。通过鉴定植物组织中CRTISO基因的表达情况，可得知植物抗高光胁迫能力。

启动子及其应用

本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列的多核苷酸；或

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达功能的多核苷酸。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达的功能。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％(例如95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。

本发明的启动子是诱导目的基因在逆境(光氧化胁迫环境)下表达的。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使CRTISO特异地在光氧化胁迫环境下表达。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。

所述的重组载体一般包括可操作性连接的(通常从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

通常，所述的目的基因位于所述受逆境(光氧化胁迫环境)诱导的启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够在适当的环境下表达蛋白质。

本发明的主要优点在于：

本发明为运用转基因等分子育种技术培育能够抵抗高强光氧化胁迫能力的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、利用水稻CRTISO基因构建9522的转基因植株

将OsCRTISO基因全长4086个碱基(编码区和3’-UTR区域)加上上游1940个碱基(CRTISO基因自身的启动子序列)及下游349个碱基(非转录区域)，一共6375个碱基的片段(见SEQ ID NO：1)通过KpnI和XbaI酶切位点克隆到载体pCAMBIA1301(CAMBIA公司)上，得到pCAMBIA1301-OsCRTISO载体。克隆CTRISO基因使用的模板是9522的基因组DNA；使用的引物是：

5’-CGGGGTACCCTCGCTAGTCACCAAGTATGA-3’(SEQ ID NO：4)，和

5’-GCTTCTAGATTATAAGTATTTGACTCTCTGCGGA-3’(SEQ ID NO：5)。

将构建的转化质粒转入农杆菌后按常规方法转化突变体(胡萝卜素异构酶低表达的突变体)的愈伤组织后筛选出一百多株具有抗潮霉素的小苗，大部分转基因苗都恢复了野生型的表型。得到转基因苗后，取少量的新鲜的水稻叶片，置于Eppendorf管中，加入缓冲液(0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，10mM EDTA-Na₂，0.5mM K₃Fe(CN)₆，PH7.0，0.2mM X-Gluc)。次日将GUS染色液吸出，把材料取出在显微镜下观察有无GUS表达。检测结果显示转基因苗组织被染成蓝色，有外源基因的表达(图1)。

实施例2、对转基因植株的插入位点的筛选和遗传鉴定

T₀代的种子发苗为T1代植株，取T1代水稻叶片提取其基因组后，经限制性酶HindIII酶切后，DNA用1％的琼脂糖凝胶分离，然后转移至带正电荷的尼龙膜上，经2000焦耳的紫外线照射将DNA交联至膜上。Southern杂交的探针以潮霉素(HYG)基因为模板，合成HYG基因所用的一对引物是：

5’-TCTCGTGCTTTCAGCTTCGA-3’(SEQ ID NO：6)，和

5’-GCCTCGCTCCAGTCAATGAC-3’(SEQ ID NO：7)。

用地高辛(DIG)标记PCR产物作为探针用于后续的杂交。Southern杂交的结果见图2。结果显示，转基因植株中含有2个拷贝的CRTISO基因，即该植株为过表达CRTISO的植株，命名为oecrtisol(oel)。

利用Tail-PCR的方法，本发明人鉴定出了oecrtisol的两个插入位点。Tail-PCR所用的引物是：

左边界特异性引物：

L1：5’-GTTTCGCTCATGTGTTGAGCA-3’(SEQ ID NO：8)；

L2：5’-TCAGTACATTAAAAACGTCCGCA-3’(SEQ ID NO：9)；

L3：5’-ACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTT-3’(SEQ ID NO：10)；

右边界特异性引物：

R1：5’-GTTTTTATGATTAGAGTCCCGC-3′(SEQ ID NO：11)；

R2：5’-AATATAGCGCGCAAACTAGGA-3′(SEQ ID NO：12)；

R3：5′GATCGGGAATTAAACTATCAGTG-3′(SEQ ID NO：13)；

任意简并引物：

OSAD1：5’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3′(SEQ ID NO：14)；

OSAD2：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’(SEQ ID NO：15)；

OSAD3：5’-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3′(SEQ ID NO：16)；

OSAD4：5’-AGTGNAGAANCAAAGG-3’(SEQ ID NO：17)。

其中，序列表中A/T以W表示，G/C以S表示。

经过PCR和测序比对分析，两个插入位点其一是，LOC_Os06g02260.1基因的3’-UTR和相邻基因LOC_Os06g02250.1的3’-UTR中间，插在非编码区域；第二个插入位点是LOC_Os08g08030.1基因的第一个内含子上，第653位核苷酸，插入位点分析见图3。这两个位点的插入没有引起水稻的突变表型，对9522的水稻生长和发育没有产生不利影响。

实施例3、转基因植株目的基因的过表达检测

根据CRTISO基因的序列设计引物：

E2-E6

F：5’-GATTACACAAGCACTAGAAGC-3’；(SEQ ID NO：18)

R：5’-CATTGGTCACATTAGCCTTG-3’；(SEQ ID NO：19)

E10-E13

F：5’-TGTCCAGGAAGGATTATGAG-3’；(SEQ ID NO：20)

R：5’-GCAAGCGTTCTCAACCATC-3’。(SEQ ID NO：21)

检测转基因植株中目的基因是否有高于野生型9522的表达。半定量RT-PCR分析结果显示，PCR循环数分别是30和34的条件下，oecrtisol的CRTISO基因的mRNA的表达量均高于野生型9522(图4)。说明过表达植株oecrtisol的类胡萝卜素异构酶基因高于同等条件下培养的9522。

实施例4、过表达CRTISO植株的表型及光合特性

过表达植株oecrtisol的表型与野生型9522相似。细微差别在于oecrtisol较野生型9522更高，叶片颜色深绿。在恒温(28℃)、能通透太阳光的人工气候室培养3个月的水稻平均株高分别是野生型为608±44毫米(n＝10)，过表达为655±23毫米(n＝10)。

通过三次测定叶片的围绕光系统I的循环电子传递速率(以P700⁺的还原为衡量指标)，发现过表达植株oecrtisol的循环活性高于野生型。野生型9522的P700⁺还原速率(s^-1)为8.43±0.69，而过表达植株为10.65±0.59，高出野生型26％以上，说明过表达植株更能适应高光高温等逆境环境。

实施例5、过表达CRTISO植株的抗高光氧化胁迫特性

将野生型9522和oecrtisol的离体叶片经高光(2000μmol m^-2 s^-1)处理2小时后，分别测定其围绕光系统I的循环电子传递速率和光合作用热耗散能力(NPQ)得到以下结果。野生型9522的离体叶片的P700⁺还原速率(s^-1)为4.88±0.48，经过高光处理2小时后其还原速率上升为7.63±0.85，上升幅度为56％；oecrtisol处理前后分别是5.25±0.29和9.0±1.38，促进幅度为71％。

由高光强引起的光能热耗散的降低情况也可以说明植物应对胁迫的能力。经同上条件的高光处理后，野生型和oecrtisol在高光强处理后，NPQ的值都有所下降，但是野生型下降的幅度较过表达植株更大(见图5)。以1200μmol m^-2 s^-1的NPQ值为例，野生型处理前后分别是0.803±0.049和0.182±0.020，oecrtisol分别是0.741±0.056和0.256±0.055，下降幅度分别是77％和65％。过表达水稻在高温环境下围绕光系统I的循环电子传递被促进，同时其NPQ下降水平较野生型更少，说明它更能适应高光的胁迫条件。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种类胡萝卜素异构酶或其编码基因的用途，用于提高植物抗光氧化胁迫能力。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述类胡萝卜素异构酶还用于：

提高植物的株高；

提高植物组织中光系统I的循环电子传递速率；或

减少高光胁迫条件下光合作用热耗散能力的下降。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述类胡萝卜素异构酶来源于禾本科植物。

4.一种提高植物抗光氧化胁迫能力的方法，所述方法包括：提高植物中类胡萝卜素异构酶的表达或活性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将类胡萝卜素异构酶的编码基因转入植物中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有类胡萝卜素异构酶的编码基因；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述类胡萝卜素异构酶的编码基因转入植物。

7.一种启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的启动子，其特征在于，所述的启动子是类胡萝卜素异构酶的启动子。

8.如权利要求7所述的启动子，其特征在于，选自下组：

(1)如SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列的启动子；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达功能的启动子；或

(3)与SEQ ID NO：1中第1-1940位所示的核苷酸序列具有90％以上相同性且具有诱导目的基因在光氧化胁迫环境下表达功能的启动子。

9.权利要求7所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达。

10.一种构建物，其特征在于，所述的构建物含有权利要求7所述的启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的启动子。

11.如权利要求10所述的构建物，其特征在于，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：

权利要求7所述的启动子；和

目的基因。

12.一种启动目的基因在光氧化胁迫环境下表达的方法，其特征在于，所述的方法包括：将构建物转化植物，所述的构建物含有权利要求7所述的受光氧化胁迫环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有权利要求7所述的受光氧化胁迫环境诱导的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

Images