CN102430154A - 含碳纳米管的三维多孔支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物医用材料技术领域的一类含有碳纳米管的三维多孔支架材料及制备方法。该支架材料由具有良好生物相容性的高分子材料聚乳酸PLA、天然多糖甲壳素纺织成的高强纤维CHI以及具有较高蛋白吸附能力和能够促进细胞向成骨质方向分化以及骨组织生成的碳纳米管CNTs组成。制备过程主要包括物理混合和超声波分散技术相结合的方法。为了使CHI更好地起到增强作用，采用蛋白交联试剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC交联了CHI和PLA。本发明是一种新颖的用于骨修复的支架材料，具有三维多孔结构；具有良好的生物相容性和骨诱导性，很有希望作为骨组织缺损用修复材料在临床上得到广泛应用。

Description

含碳纳米管的三维多孔支架材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域。更确切地说，本发明涉及用于骨组织缺损修复的一种含有碳纳米管的三维多孔支架材料及制备方法。

背景技术

组织工程可以实现组织再生。组织工程用支架材料通常需制备成三维多孔材料以便于细胞、血管和组织等的长入。对于骨组织工程用支架材料还需具有一定的力学性能。

目前，越来越多的纳米材料用于生物医用，甚至组织工程。具有代表性之一的碳纳米管(CNTs)，由于其独特的性能，正在受到越来越多的关注。到目前为止，大量的研究表明，其可用于生物医用，尤其与骨关联细胞有较好的相容性。成骨细胞以及骨关联细胞在CNTs上的贴附和生长性好于在胶原(天然骨的主要有机成分)上，然而CNTs的价格仅仅是胶原的数百分之一，而且其资源远远比胶原丰富；CNTs能够凭借其独特的性能能够吸附大量的特定蛋白，而这些蛋白可以促使细胞向成骨质细胞分化；天然骨的主要无机成分，纳米羟基磷灰石能在CNTs上自组装形成；CNTs有很好的骨组织相容性；与I型胶原相比，能更好地直接或间接促进骨组织生成(Li XM，Gao H，Uo M，Sato Y，Akasaka T，Feng QL，Cui FZ，Liu XH，Watari F.Effect of carbon nanotubes on cellular functions in vitro.J Biomed Mater Res.A 2009，91A：132-139；Li XM，Gao H，Uo M，Sato Y，Akasaka T，Abe S，Feng QL，Cui FZ，Watari F.Maturation of osteoblast-like SaoS2 induced by carbon nanotubes.Biomedical Materials 2009，4，article number：015005；Li XM，Fan YB，Watari F.Current investigations into carbon nanotubes forbiomedical application.Biomedical Materials 2010；5，article number：022001；Usui Y，Aoki K，Narita N，Murakami N，Nakamura I，Nakamura K，Ishigaki N，Yamazaki H，Horiuchi H，Kato H，Taruta S，Kim YA，Endo M，Saito N.Carbon nanotubes with high bone-tissue compatibility andbone-formation acceleration effects.Small 2008，4：240-246.)。可见，CNTs很可能适用于制备骨组织工程支架材料，而且价格比较低廉。

目前国内外关于含有CNTs的骨修复材料的研究相对不是很多，主要局限于致密材料，二维薄膜材料以及粉体材料等。将单纯的CNTs制备成具有一定力学性能的三维多孔材料相对来讲比较困难。如果用聚乳酸(PLA)和CNTs复合，这样既可利用高分子聚合物的优良的力学性能和成型性又可利用CNTs的独特性能。

PLA是最早被美国食品药品管理局(FDA)批准用于生物医用的材料之一。目前其作为支架材料被广泛用于组织工程领域。然而，植入PLA，尤其是植入量较大时，极有可能会导致局部组织pH值明显下降、引发无菌性炎症等不良反应。所以，为了进一步优化CNTs和PLA复合而成的支架材料，需要加入另外一种材料以改善和抵消PLA的不足。

甲壳素是自然界中广泛存在的一种天然多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性。其降解产物N-乙酰葡萄糖和氨基葡萄糖具有明显碱性，在体内不堆积，对人体无毒、无害、无免疫原性，可以中和聚乳酸的酸性降解产物(Li XM，Feng QL，Liu XH，Dong W，Cui FZ.Collagen-based implants reinforced by chitin fibres in a goat shank bone defect model.Biomaterials2006，27：1917-1923；Li XM，Feng QL，Cui FZ.In vitro degradation of porousnano-hydroxyapatite/collagen/PLLA scaffold reinforced by chitin fibres.Mater Sci Eng.C 2006，26：716-720；Li XM，Liu XH，Dong W，Feng QL，Cui FZ，Uo M，Akasaka T，Watari F.In vitroevaluation of porous poly(L-lactic acid)scaffold reinforced by chitin fibers.J Biomed Mater Res.B 2009，90B(2)：503-509.)。目前甲壳素已广泛用于生物医用，例如用做手术缝线、骨缺损填充材料等。通过适当改性和湿法纺丝工艺，可将甲壳素纺织成高强纤维，目前可从市场购买其用。可用甲壳素纤维制备纤维增强材料(Li XM，Feng QL，Jiao YF.Collagen-based scaffoldsreinforced by chitosan fibres for bone tissue engineering.Polym Int.2005，54(7)：1034-40)。甲壳素在体内是溶菌酶催化水解，与聚乳酸的本体水解机理不同，其强度衰减方面慢于聚乳酸(LiXM，Feng QL，Cui FZ.In vitro degradation of porous nano-hydroxyapatite/collagen/PLLA scaffoldreinforced by chitin fibres.Mater Sci Eng.C 2006，26：716-720)。所以加入甲壳素纤维(CHI)有望改善PLA本身的不足。

本发明用碳纳米管CNTs、聚乳酸PLA和甲壳素纤维CHI为原材料，从骨组织工程支架材料的结构和性能要求出发，制备一类新颖的三维多孔复合材料。

发明内容

本发明的目的在于制备一类含有碳纳米管CNTs的三维多孔支架材料，以利用CNTs能够促进细胞向成骨质方向分化以及骨组织生成的优良性能。

所述支架材料除了含有碳纳米管CNTs之外，还含有生物可降解高分子材料聚乳酸PLA和高强天然多糖甲壳素纤维CHI。三者采用物理混合和超声波分散技术相结合的方法复合而成。附图中如图1所示为碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维三维多孔支架材料扫描电镜图，图2所示为骨髓间充质干细胞在碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维三维多孔支架材料上粘附后的扫描电镜图。显示细胞在材料上粘附得很好，细胞伪足紧密贴附在材料表面。

所述碳纳米管CNTs为多壁的，直径为20-40nm，表面积为100-120m²/g.

所述生物可降解高分子材料聚乳酸PLA为聚L-乳酸，分子量为1.0×10⁵-3.0×10⁵kDa。

所述高强天然多糖甲壳素纤维CHI的断裂强力为4.5-4.7cN，其表面经过脱乙酰基处理，表面脱乙酰度为80-85％。

所述的甲壳素纤维CHI的功能之一是起增强作用，通过蛋白交联试剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC与聚乳酸PLA进行交联以增加增强效果；功能之二是因为它本身具有明显的碱性，因而在体内可以中和聚乳酸降解产物的酸性。聚乳酸PLA和甲壳素纤维CHI具体添加比例需要考虑复合物降解产物的酸碱性。

所述含有碳纳米管CNTs的三维多孔支架材料的制备方法包括下列各步骤：

(1)确定一个合适的PLA和CHI添加比例。PLA和CHI按不同比例分别浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分别在2、4、8、12、24周测定浸泡液的pH值，最后选用pH值波动较小的PLA和CHI的添加比例。经过反复实验得出当CHI的体积含量为25-30％时，体外降解浸泡液pH波动最小。

(2)交联PLA和CHI。为了使材料的力学性能和结构更加优良，将CHI和PLA进行交联。将CHI、PLA和交联剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC溶于二氯甲烷中，在0℃下下经过磁力搅拌2-4小时后放置过夜以完成交联，此后将CHI从溶液中取出并用二氯甲烷清洗，从而得到经过与PLA交联的CHI。通过尝试不同添加比例的三种物质对最终支架材料力学性能的影响，确定了CHI、PLA和DCC的最佳加入量之比为5∶12∶4。

(3)确定经过与聚乳酸PLA交联的甲壳素纤维CHI的最佳长度。纤维只有在其长度大于一个临界长度的情况下，才能对基体产生增强作用。但是在纤维含量一定的情况下，如果纤维的长度大于这个值，增强材料的压缩强度会略有下降。在本试验所能涉及的范围内，经过多次重复，得到经过与PLA交联的CHI的最佳长度为1.0-1.2mm。

(4)纯化和切割碳纳米管CNTs。为了去除CNTs的杂质，首先将CNTs加热到500℃并保温1-3小时，冷却后将其放入6M盐酸中加热到60℃并保温2-5小时，最后用蒸馏水将其冲洗干净。由于CNTs长度较长，易于团聚，不便于与其它组分混匀，用硫酸(98％)和硝酸(60％)的混合液切割CNTs。将CNTs放置于该混合液体中，经超声波作用2-6小时后用去离子水漂洗即得到纯化的经过切割的碳纳米管CNTs。

(5)将分子量为1.0×10⁵-3.0×10⁵kDa的聚乳酸PLA溶于1，4-二氧六环中，配成浓度为20-100g/L的溶液。然后按体积含量为25-30％加入经过与PLA交联的甲壳素纤维CHI，在常温下经过2-4小时的磁力搅拌并超声波分散1-3小时，此后按CNTs与PLA的质量比为(0.5-1.5)∶1的比例加入经过纯化和切割的CNTs，在常温下经过1-3小时的磁力搅拌并超声波分散2-5小时，制得碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维混合液体。

(6)采用冷冻干燥的方法制备碳纳米管CNTs/聚乳酸PLA/甲壳素纤维CHI三维多孔支架材料。将上述第四步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20℃冰箱中冷冻18-24小时后，将模具转移到冷冻干燥机中冷冻干燥48-72小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在40-60℃的真空干燥箱中烘干24-36小时。

(7)将上述第六步制得的材料用环氧乙烷蒸气消毒3-6小时，即为含有碳纳米管的三维多孔支架材料。

本发明的有益效果是通过上述方法得到三维多孔碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维复合材料具有以下且不限于以下的优点：

(1)由于含有碳纳米管CNTs，该支架材料细胞贴附性好；具有较强的特定蛋白吸附能力，从而促进细胞向成骨质方向分化，具有促进骨组织生成的能力。

(2)充分利用了高分子聚合物聚乳酸PLA成型性好的优点；加入高强甲壳素纤维CHI既可以中和PLA的酸性降解产物又能进一步增强材料，并通过用蛋白交联试剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC交联CHI和PLA，使得CHI的增强作用得到较大程度地发挥。

(3)制备的支架材料具有较高的孔隙率，约为75-85％，通过调整混合液浓度可控孔隙率，混合液浓度越小孔隙率越大。既含有200μm以上的较大孔隙，以有助于细胞、血管和组织等的长入；又含有10μm以下的微孔，以有助于增大材料的表面积、增强蛋白吸附能力从而促进骨组织生成。

所以，本发明是一种新颖的用于骨修复的支架材料，具有三维多孔结构；具有良好的生物相容性和骨诱导性，很有希望作为骨组织缺损用修复材料在临床上得到广泛应用。

具体实施方式

本发明为满足由创伤、肿瘤、感染等造成的骨组织缺损修复的需求而提供一类含有碳纳米管CNTs的三维多孔支架材料。所述支架材料除了含有碳纳米管CNTs之外，还含有聚乳酸PLA和甲壳素纤维CHI，三组份采用物理混合和超声波分散相结合的方法复合而成。

经过多次反复实验确定，所述甲壳素纤维CHI的最佳长度为1.0-1.2mm，其在与PLA混合物中的最佳体积含量为25-30％。

所述碳纳米管CNTs需经过纯化以去除杂质，并经过切割以免在与PLA和CHI混合过程中形成团聚。

所述甲壳素纤维CHI通过蛋白交联试剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC与聚乳酸PLA进行交联以便在支架材料制备过程中增大增强效果。并确定了交联过程中，CHI、PLA和DCC的最佳加入量之比为5∶12∶4。

所述支架材料采用冷冻干燥以获得三维多孔结构。为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料在真空干燥箱中进一步烘干。

下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但该实施例并不限制本发明的保护范围。

(1)将5克长度为1.1mm的甲壳素纤维CHI、12克聚乳酸PLA以及4g交联剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC溶于二氯甲烷中，在0℃下经过磁力搅拌3小时后放置24小时，然后将CHI从溶液中取出并依次用二氯甲烷清洗三次、去离子水漂洗三次，在40℃的真空干燥箱中烘干即得到经过与聚乳酸PLA交联的甲壳素纤维CHI。

(2)将6g碳纳米管CNTs加热到500℃并保温2小时，冷却后将其放入6M盐酸中加热到60℃并保温3小时，最后用蒸馏水将其冲洗干净，得到经过纯化的CNTs。随后将纯化后的CNTs放置于硫酸(98％)和硝酸(60％)的混合液中。将CNTs放置于该混合液体中，经超声波作用5小时后用去离子水漂洗三次即得到纯化的经过切割的碳纳米管CNTs。

(3)将6g聚乳酸PLA溶于1，4-二氧六环中，配成浓度为50g/L的溶液。然后按体积含量为25％加入第一步完成的经过与PLA交联的甲壳素纤维CHI，在常温下经2小时的磁力搅拌并超声波分散1.5小时。此后加入6g第二步完成的经过纯化和切割的CNTs，在常温下经过3小时的磁力搅拌并超声波分散4.5小时，制得碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维混合溶液。

(4)将第三步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20℃冰箱中冷冻18小时后，将模具转移到冷冻干燥机中冷冻干燥60小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在60℃的真空干燥箱中烘干24小时。最后，将材料用环氧乙烷蒸气消毒5小时，即制得含有碳纳米管的三维多孔支架材料。

Claims (4)

1.一类含有碳纳米管CNTs的三维多孔支架材料，以利用CNTs促进骨组织形成的性能。所述支架材料除了含有碳纳米管CNTs之外，还含有生物降解性高分子材料聚乳酸PLA和高强天然多糖甲壳素纤维CHI。

2.根据权利要求1所述碳纳米管CNTs为多壁的，直径为20-40nm，表面积为100-120m²/g；生物降解性高分子材料聚乳酸PLA为聚L-乳酸，分子量为1.0×10⁵-3.0×10⁵kDa。高强天然多糖甲壳素纤维CHI的断裂强力为4.5-4.7cN，其表面经过脱乙酰基处理，表面脱乙酰度为80-85％。

3.根据权利要求1所述的甲壳素纤维CHI的功能之一是起增强作用，通过蛋白交联试剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC与聚乳酸PLA进行交联以增加增强效果；功能之二是因为它本身具有明显的碱性，因而在体内可以中和聚乳酸降解产物的酸性。聚乳酸PLA和甲壳素纤维CHI具体添加比例需要考虑混合物降解产物的酸碱性。

4.根据权利要求1所述含有碳纳米管CNTs的三维多孔支架材料采用物理混合和超声波分散技术相结合的方法复合而成。制备方法包括下列各步骤：

(1)确定一个合适的PLA和CHI添加比例。PLA和CHI按不同比例分别浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分别在2、4、8、12、24周测定浸泡液的pH值，最后选用pH值波动较小的PLA和CHI的添加比例。经过反复实验得出当CHI的体积含量为25-30％时，体外降解浸泡液pH波动最小。

(2)交联PLA和CHI。为了使材料的力学性能和结构更加优良，将CHI和PLA进行交联。将CHI、PLA和交联剂N，N’-二环己基碳酰亚胺DCC溶于二氯甲烷中，在0℃下下经过磁力搅拌2-4小时后放置过夜以完成交联，此后将CHI从溶液中取出并用二氯甲烷清洗，从而得到经过与PLA交联的CHI。通过尝试不同添加比例的三种物质对最终支架材料力学性能的影响，确定了CHI、PLA和DCC的最佳加入量之比为5∶12∶4。

(3)确定经过与聚乳酸PLA交联的甲壳素纤维CHI的最佳长度。纤维只有在其长度大于一个临界长度的情况下，才能对基体产生增强作用。但是在纤维含量一定的情况下，如果纤维的长度大于这个值，增强材料的压缩强度会略有下降。在本试验所能涉及的范围内，经过多次重复，得到经过与PLA交联的CHI的最佳长度为1.0-1.2mm。

(4)纯化和切割碳纳米管CNTs。为了去除CNTs的杂质，首先将CNTs加热到500℃并保温1-3小时，冷却后将其放入6M盐酸中加热到60℃并保温2-5小时，最后用蒸馏水将其冲洗干净。由于CNTs长度较长，易于团聚，不便于与其它组分混匀，用硫酸(98％)和硝酸(60％)的混合液切割CNTs。将CNTs放置于该混合液体中，经超声波作用2-6小时后用去离子水漂洗即得到纯化的经过切割的碳纳米管CNTs。

(5)将分子量为1.0×10⁵-3.0×10⁵kDa的聚乳酸PLA溶于1，4-二氧六环中，配成浓度为20-100g/L的溶液。然后按体积含量为25-30％加入经过与PLA交联的甲壳素纤维CHI，在常温下经过2-4小时的磁力搅拌并超声波分散1-3小时，此后按CNTs与PLA的质量比为(0.5-1.5)∶1的比例加入经过纯化和切割的CNTs，在常温下经过1-3小时的磁力搅拌并超声波分散2-5小时，制得碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维混合溶液。

(6)采用冷冻干燥的方法制备碳纳米管CNTs/聚乳酸PLA/甲壳素纤维CHI三维多孔支架材料。将上述第四步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20℃冰箱中冷冻18-24小时后，将模具转移到冷冻干燥机中冷冻干燥48-72小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在40-60℃的真空干燥箱中烘干24-36小时。

(7)将上述第六步制得的材料用环氧乙烷蒸气消毒3-6小时，即为碳纳米管/聚乳酸/甲壳素纤维三维多孔支架材料。

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