CN104147643B - 制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，包括壳聚糖包覆的改性碳纳米管的制备、壳聚糖包覆的碳纳米管－壳聚糖复合支架的制备。本发明该制备方法简单易行、节省时间和材料、重复性好，所构建的导电性的壳聚糖－碳纳米管组织工程支架材料可以广泛应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。对推碳纳米管在组织工程支架材料中的应用具有重要的意义。

Description

制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法

技术领域

本发明涉及一种制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，是一种利用碳纳米管的吸附性制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法。

背景技术

组织工程是指应用工程学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损组织或器官功能的生物学替代物。组织工程支架材料在组织工程中具有重要的地位。理想的支架材料应该具有良好的生物相容性、生物降解性、机械性能和导电性能等。电环境是体内许多细胞的生长的重要微环境之一。在组织工程的体外构建中，电刺激可以促进种子细胞增殖，促进细胞外基质的合成分泌、诱导分化，促进细胞与支架材料黏附。因此构建一种导电性的支架材料对于研究电信号对于细胞行为的影响以及拓展组织工程支架材料都具有重要的意义。

碳纳米管自1991年被发现以来，由于其独特的结构，电学和机械特性而日益受到关注。碳纳米管具有较大的比表面积，相当高的比表面能，良好的吸附性能，是一种多功能材料，通过不同的制备及后处理方法可以获得某些特定的性质，以满足电子、航天、生物医学及化工等方面的需要。自从碳纳米管被发现以来，其生物应用就受到很大的重视。但其差的水溶性以及生物相容性限制了其生物应用。因此，对碳纳米管进行合理的改性，提高其水溶性和生物相容性是拓展碳纳米管在生物学领域应用的关键。其中利用碳纳米管良好的吸附性能，对碳纳米管进行表面改性是一种简单、有效的的方法，广泛应用于碳纳米管的改性研究。

壳聚糖是一种带有多氨基的多糖类物质，其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖类似，具有良好的生物相容性和适当的降解性能，无刺激性、无免疫原性、无热源反应，并具有促进创面愈合的功能，而且来源广泛、成本低廉。目前壳聚糖已广泛应用于医用缝合线、创面敷料以及组织工程多孔支架中。

传统的组织工程支架材料往往只注重其生物相容性、生物降解性、机械性能等方面的性能，而对其电性能却不够重视。然而电环境是体内许多细胞的生长的重要微环境之一，电刺激可以促进种子细胞增殖，促进细胞外基质的合成分泌、诱导分化，促进细胞与支架材料黏附。因此构建一种导电性的支架材料对于研究电信号对于细胞行为的影响以及拓展组织工程支架材料都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以来源广泛的天然生物材料壳聚糖，具有良好吸附性能和导电性的碳纳米管为原料，简便易行壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，以获得具有优良导电性能、适宜降解速率、良好生物相容性的组织工程支架材料。

本发明的技术解决方案是：

一种制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)酸性条件下配置质量浓度为1-5mg/ml的壳聚糖溶液，加入多壁碳纳米管，超声使碳纳米管分散，在匀速磁力搅拌下用稀氨水将溶液的PH值调至7-8，维持原来的匀速搅拌，在溶液中逐滴加入戊二醛溶液作为沉积在碳纳米管表面的壳聚糖大分子的交联剂，将交联后的溶液离心沉淀，所得沉淀物用乙酸和水清洗后，转移至称量瓶中-20℃下冷冻，待液体结晶完全析出后转移至冻干机中冻干,得到壳聚糖包覆的改性碳纳米管；

(2)称取壳聚糖包覆的改性碳纳米管，溶于乙酸溶液中，超声至分散均匀，称取壳聚糖，溶于改性碳纳米管的乙酸溶液中，得到改性碳纳米管与壳聚糖酸性溶液的混合液，滴入戊二醛；搅拌后，真空脱泡，注入孔培养板中。于-20℃下冷冻处理，然后于冷冻－干燥机中冻干，即获得壳聚糖包覆的碳纳米管－壳聚糖复合支架。

步骤(1)所述的酸性条件是使用醋酸。

步骤(2)中戊二醛的浓度为1％。

步骤(1)中-20℃冷冻时间为3小时，冻干时间为24小时。

步骤(2)中-20℃冷冻时间为1小时，冻干时间为24小时。

本发明以天然生物材料壳聚糖、具有优良导电性能的碳纳米管为原料，利用碳纳米管的吸附性能，通过物理包覆壳聚糖的方法对碳纳米管进行改性，将改性后的碳纳米管分散到壳聚糖支架薄膜中，制备了一种导电性的壳聚糖－碳纳米管组织工程复合支架。改性后的碳纳米管表现出良好的水溶性和低的细胞毒性。碳纳米管复合后，可有效提高壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的导电性，且这种复合支架材料具有良好的时间稳定性和温度稳定性。该制备方法简单易行、节省时间和材料、重复性好，所构建的导电性的壳聚糖－碳纳米管组织工程支架材料可以广泛应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。对推碳纳米管在组织工程支架材料中的应用具有重要的意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的壳聚糖溶液改性的碳纳米管的红外谱图。

图2是浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的壳聚糖溶液改性的碳纳米管的热重分析结果示意图。

图3是未改性的碳纳米管的扫描电镜图。

图4是1mg/ml壳聚糖改性碳纳米管扫描电镜图。

图5是2mg/ml壳聚糖改性碳纳米管扫描电镜图。

图6是5mg/ml壳聚糖改性碳纳米管扫描电镜图。

图7是未改性的碳纳米管的透射电镜图。

图8是1mg/ml壳聚糖改性碳纳米管透射电镜图。

图9是2mg/ml壳聚糖改性碳纳米管透射电镜图。

图10是5mg/ml壳聚糖改性碳纳米管透射电镜图。

图11是浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的壳聚糖溶液改性的碳纳米管的的毒性示意图。

图12是1mg/ml壳聚糖改性碳纳米管，复合支架中改性碳纳米管的含量1％的导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的微观断面形貌。

图13是2mg/ml壳聚糖改性碳纳米管，复合支架中改性碳纳米管的含量1％的导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的微观断面形貌。

图14是2mg/ml壳聚糖改性碳纳米管，复合支架中改性碳纳米管的含量0.5％的导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的微观断面形貌。

图15是2mg/ml壳聚糖改性碳纳米管，复合支架中改性碳纳米管的含量2％的导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的微观断面形貌。

图16是1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的壳聚糖溶液改性的碳纳米管对复合支架电阻率的影响。

图17是0.5％、1％、2％改性碳纳米管含量的复合支架的电阻率。

图18是存放时间对复合支架导电率的影响。

图19是存放温度对复合支架导电率的影响。

具体实施方式

实施例1：

利用碳纳米管的吸附性制备导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖，溶于100ml1％乙酸中，配制成1mg/ml的壳聚糖溶液；另称取0.1g多壁碳纳米管，分散上述壳聚糖溶液中。，将溶液置于超声清洗器中超声半个小时(每5分种换一次水，以保证良好的超声效果)。在上步溶液的烧杯中放入干净搅拌子，并置于搅拌器上，转速由低到高缓缓调至高档。在匀速搅拌下慢慢加入1％的稀氨水，边滴加边用PH试纸测溶液的PH值。当PH值调至7－8时停止。维持原来的匀速搅拌，在溶液中逐滴加入2ml1％的戊二醛溶液作为沉积在碳纳米管表面的壳聚糖大分子的交联剂。加入交联剂后，继续匀速搅拌1小时，待壳聚糖分子交联完全。用移液枪将交联完全后的溶液分别注入2ml离心管中，在5000转/分的转速下，离心5分钟。用移液枪取出上层清液，并在留有沉淀物的离心管中注入0.1％的乙酸。震荡5分钟后，待沉淀物分散开，在5000转/分的转速下离心5分钟。用移液枪取出上层清液(即用0.1％的乙酸清洗沉淀)。用0.1％的乙酸和三蒸水分别清洗沉淀物三次。收集得到的沉淀转移到洁净的称量瓶中。于－20℃下冻干3小时，待液体结晶完全后转移至冻干机中，24小时后取出，得到1mg/ml壳聚糖包覆的改性碳纳米管。

(2)称取0.002g1mg/ml壳聚糖包覆的改性碳纳米管，溶于10ml3％的乙酸溶液中。超声至分散均匀，称取0.2g壳聚糖，溶于上步改性碳纳米管的乙酸溶液中，得到改性碳纳米管与2％壳聚糖酸性溶液的混合液，在磁力搅拌下用移液枪慢慢滴入200μl1％戊二醛。搅拌三小时后，真空脱泡，以24孔板为复合支架的制备模具，以每孔0.4ml注入24孔培养板中。于-20℃下冷冻一小时，然后于冷冻－干燥机中冻干24小时，即获得含量为1％的用1mg/ml壳聚糖包覆的碳纳米管－壳聚糖复合支架。

利用红外谱图检测碳纳米管外包覆的壳聚糖。将未改性碳纳米管，用1mg/ml,2mg/ml,5mg/ml碳纳米管包覆的壳聚糖用纯净溴化钾压片，并用衰减全反射傅立叶变换红外光谱仪(ATR-FTIR，BRUKERVECTOR22)进行扫描，见图1。3480/cm左右为羟基(-OH)的伸缩振动峰；3264为氮氢键(N-H)的伸缩振动峰；2960-2840为碳氢键(C-H)的伸缩振动峰；1650，1555，1310为酰胺键对应的三个谱带，但在壳聚糖等分子中，由于受到脱乙酰作用的影响，这三个峰逐渐消失，而在1599处出现氨基(-NH2)的弯曲振动峰。从红外光谱上可以看出，各种改性碳纳米管上确实包覆有壳聚糖。

将未改性碳纳米管和用1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的壳聚糖包覆的碳纳米管进行50℃-800℃的热重分析，升温速率控制在10℃/分钟，结果见图2。各种改性碳纳米管均在340℃左右出现大幅度的重量损失，即壳聚糖的分解温度。5mg/ml的壳聚糖溶液包覆的改性碳纳米管的失重明显大于用1mg/ml,2mg/ml的壳聚糖包覆的改性碳纳米管，用2mg/ml的壳聚糖包覆的改性碳纳米管的失重明显高于用1mg/ml的壳聚糖包覆的改性碳纳米管。由热重分析可以定性看出，随着用于包覆碳纳米管的壳聚糖溶液的浓度的增加，被吸附在碳纳米管管外并形成包覆的壳聚糖的量也有所增加。

图3、图4、图5、图6分别为0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml改性的碳纳米管的扫描电镜图。从图中可以看出，随着壳聚糖浓度的增加，碳纳米管越来越粗，包覆量随壳聚糖浓度的增加而增加。

图7、图8、图9、图10分别为将0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml改性的碳纳米管溶于3％的乙酸中得到的透射电镜照片。在3％的乙酸中，未改性碳纳米管之间有较多缠结，甚至出现团聚；用壳聚糖包覆的改性碳纳米管的可分散性较好，碳管与碳管之间的缠结较少，甚至出现单根的碳管。TEM结果显示，用壳聚糖包覆的物理改性方法可以大幅改善碳纳米管的可分散性。

称取未改性，1mg/ml,2mg/ml,5mg/ml的壳聚糖包覆的改性碳纳米管各5mg，放入离心管中。制备浸出液之前，用三蒸水清洗-离心三遍。在离心管中加入4mlDMEM完全培养液，于37度下浸泡三天。在1000转每分钟的转速下，离心五分钟，取上层清液备用。将4～8代的成纤维细胞浓缩为5×104cells/ml细胞悬液，注射200μl细胞悬液到96孔板的特定孔中后置于37oC，5％CO2的培养箱孵化4小时。在各培养时间点，在培养液中加入20μlMTT，置于培养箱中孵育3小时后，小心吸去培养液，再加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡均匀后，吸取150μl液体采用酶标仪(Biorad,model550)测定紫色物质于570nm处的吸光度，见图11。结果表明通过在碳纳米管表面包覆一定量的壳聚糖，对碳纳米管的生物安全性有不同程度的改善。

实施例2：

利用碳纳米管的吸附性制备导电性壳聚糖－碳纳米管组织工程支架的方法，包括以下步骤：

(1)酸性条件下配置质量浓度分别为1、2、5mg/ml的100ml壳聚糖溶液，并分别加入0.1g多壁碳纳米管，超声使碳纳米管分散，在匀速磁力搅拌下分别用1％的稀氨水将溶液的PH值调至7-8，维持原来的匀速搅拌，在上述各溶液中分别逐滴加入2、4、10ml1％的戊二醛溶液作为沉积在碳纳米管表面的壳聚糖大分子的交联剂，加入交联剂后，继续匀速搅拌1小时，待壳聚糖分子交联完全，将交联后的溶液离心沉淀，所得沉淀物分别用0.1％的乙酸和三蒸水分别清洗三次后，转移至称量瓶中－20℃下冻干3小时，待液体结晶完全析出后转移至冻干机中，24小时后取出，得到1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml壳聚糖包覆的改性碳纳米管。其微观断面形貌见图12-15。图中可以看出，支架呈现疏松多孔的结构，且孔径分布均匀。

(2)称取0.002g2mg/ml(或1mg/ml、5mg/ml)壳聚糖包覆的改性碳纳米管，溶于10ml3％的乙酸溶液中。超声至分散均匀，称取0.2g壳聚糖，溶于上步改性碳纳米管的乙酸溶液中，得到改性碳纳米管与2％壳聚糖酸性溶液的混合液，在磁力搅拌下用移液枪慢慢滴入200ul1％戊二醛。搅拌三小时后，真空脱泡，以24孔板为复合支架的制备模具，以每孔0.4ml注入24孔培养板中。于-20℃下冷冻一小时，然后于冷冻－干燥机中冻干24小时，即获得含量为1％的用2mg/ml((或1mg/ml、5mg/ml))壳聚糖包覆的碳纳米管－壳聚糖复合支架。同样的方法(通过调整壳聚糖包覆的改性碳纳米管与壳聚糖的用量比例)制备改性碳纳米管含量为0.5％和2％的碳纳米管-壳聚糖复合支架。

用四脚探针测定复合支架的电阻率，以电阻率反映复合支架的导电性。每种样品平行测定3次。保持碳纳米管含量为1％，测定用0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml壳聚糖包覆的碳纳米管复合支架的电阻率，研究不同的改性方法对复合支架导电性的影响，见图16。结果表明，各种复合支架的导电性均优于纯壳聚糖膜，碳纳米管的混入对壳聚糖支架的导电性有一定的改善。各种不同改性方法得到的碳纳米管-壳聚糖复合支架中，1mg/ml的壳聚糖包覆的碳纳米管中含碳量最大，相应的复合支架的导电性也最优，而5mg/ml的壳聚糖包覆的碳纳米管的含碳量最小，相应的复合支架的导电性也最差。

用四脚探针测定复合支架的电阻率，以电阻率反映复合支架的导电性。每种样品平行测定3次。保持包覆碳纳米管的壳聚糖浓度为2％，测定碳纳米管含量为0％、0.5％、1％、2％的复合支架的电阻率，研究碳纳米管含量对复合支架导电性的影响，见图17。结果显示，对于同样以2mg/ml的壳聚糖包覆的碳纳米管与壳聚糖形成的复合支架中，复合支架的导电性则随着复合支架中改性碳纳米管混入比例的增加而增加。

固定一种改性方法和比例的复合支架(以1mg/ml壳聚糖包覆且改性碳纳米管的浓度为1％的复合支架为例)，于37℃下在PBS溶液中分别浸泡半天，1天，2天，4天，6天后，取出，冷冻冻干成膜。每个时间点取3个样，测电阻率，见图18。由图可知，在PBS溶液中浸泡后，复合支架的电阻率有所下降，但存放时间对复合支架的电阻率影响不大。

固定一种改性方法和比例的复合支架(以1mg/ml壳聚糖包覆且改性碳纳米管的浓度为1％的复合支架为例)，分别于4℃，37℃，60℃下在PBS溶液中浸泡1天，取出，冷冻冻干成膜。每组取3个样，测电阻率，见图19。从图中可以看出，存放温度对复合支架的电阻率影响不大。

Claims (5)

1.一种制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)酸性条件下配置质量浓度为1-5mg/ml的壳聚糖溶液，加入多壁碳纳米管，超声使碳纳米管分散，在匀速磁力搅拌下用稀氨水将溶液的pH值调至7-8，维持原来的匀速搅拌，在溶液中逐滴加入戊二醛溶液作为沉积在碳纳米管表面的壳聚糖大分子的交联剂，将交联后的溶液离心沉淀，所得沉淀物用乙酸和水清洗后，转移至称量瓶中-20℃下冷冻，待液体结晶完全析出后转移至冻干机中冻干,得到壳聚糖包覆的改性碳纳米管；

(2)称取壳聚糖包覆的改性碳纳米管，溶于乙酸溶液中，超声至分散均匀，称取壳聚糖，溶于改性碳纳米管的乙酸溶液中，得到改性碳纳米管与壳聚糖酸性溶液的混合液，滴入戊二醛；搅拌后，真空脱泡，注入孔培养板中。于-20℃下冷冻处理，然后于冷冻－干燥机中冻干，即获得壳聚糖包覆的碳纳米管－壳聚糖复合支架。

2.根据权利要求1所述的制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：步骤(1)所述的酸性条件是使用醋酸。

3.根据权利要求1所述的制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：步骤(2)中戊二醛的浓度为1％。

4.根据权利要求1所述的制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：步骤(1)中-20℃冷冻时间为3小时，冻干时间为24小时。

5.根据权利要求1所述的制备壳聚糖－碳纳米管导电组织工程支架的方法，其特征是：步骤(2)中-20℃冷冻时间为1小时，冻干时间为24小时。