CN115715824A - 一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料及其制备方法，该方法进一步优化了单壁碳纳米管的纯度以及分散性，提高了材料的机械性能和生物安全性能，进一步扩展了单壁碳纳米管在生物医疗相关领域的应用。本发明还提供了一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法。该支架是以改性单壁碳纳米管、复合聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、骨形态发生蛋白为主体的材料制备而成；其具有较好的机械性能、生物相容性及骨修复的特点，这也使得单壁碳纳米管在骨支架领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料及其制备方法。
背景技术
近年来，随着人口老龄化严重，再加上意外事故、疾病等众多原因，这使得人们的骨创伤或骨缺损等问题与日俱增。目前，在骨移植手术中，选用自体骨移植仍是较为常见的治疗手段，其在骨连接、骨修复过程中不会产生排异的问题，并且结合速度快，融合效果好。但是在没有坚固的骨结构条件下进行自体移植，那么自体骨不具有机械支撑作用，也不利于日后正常生活。并且自体骨移植需要在供体部位自体取材，一般手术操作时间比较长；而针对取骨部位又容易产生并发症且不容易忍受术后的疼痛。所以，针对幼儿和老年患者等人群，采用自体骨移植显然是不合时宜的。
由于人们对于骨质的要求以及预后的要求在不断提升，所以科研学者们对于骨修复治疗的支架材料产生了革新的愿望。目前，研究热门的骨支架材料有陶瓷骨、金属及合金等材料。虽然陶瓷骨材料生物相容性好，但是这类材料两极分化严重。不是存在降解性能过差、塑形困难的问题；就是降解速率过快，不能够很好的构建骨传导机制平台。而大部分金属及合金材料往往又存在价格昂贵的问题；并且随着时间流逝也会缓慢降解，其在降解过程中产生的有害离子是骨支架材料发展面临的重大难题。单一的骨支架材料普遍会由于各种各样的原因受限，难以作为最理想的骨修复材料；而复合支架材料能在不同程度上弥补单一支架材料的缺陷，在应用中体现出显著优势。近年来，骨支架复合材料受到国内外学者的广泛关注，并逐渐呈现人工合成材料与天然材料有机结合的趋势。
碳纳米管（CNTs）是一种管状的纳米级石墨晶体，其具有优异的力学性能、导电性能以及结构稳定性和官能团可修饰性，这为生物医疗领域发展骨支架材料提供了新方向。但有资料显示，碳纳米管对细胞可能存在潜在的毒性；并且由于合成技术受限，制得的碳纳米管一般都存在无定形碳、富勒烯、纳米碳颗粒、石墨颗粒和金属催化剂颗粒等杂质，导致碳纳米管纯度低。这些都是影响碳纳米管性能应用的关键因素，所以针对碳纳米管的开发仍然需要不断地进化。碳纳米管又可细分为单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）。目前有关单壁碳纳米管在生物医疗领域的研究比较少，大多都是针对多壁碳纳米管。然而相较多壁碳纳米管而言，单壁碳纳米管拥有卓越的物理性能以及化学普遍性和广泛适用性。单壁碳纳米管在极低添加量下就可达到超出多壁碳纳米管数倍的效果。所以采用一种适宜的方法，优化单壁碳纳米管的纯度和生物安全性能，将在新型骨支架材料设计方面具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种改性单壁碳纳米管的方法。
本发明的另一目的是，提供一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
（1）制备改性单壁碳纳米管（SWCNTs-1）材料：将粗产品单壁碳纳米管放入管式炉中进行煅烧；待煅烧结束、降到室温后，将产物转入砂磨机中，研磨3-5h，待单壁碳纳米管更细碎后，再与乙醇混合、搅拌，制得单壁碳纳米管得乙醇分散液；将所得的分散液超声破碎处理1-4h，然后用一个永久磁极收集铁等磁性粒子，在经过数次清洗、过滤后，将产物用酸处理并油浴加热12-36h；经去离子水清洗至中性后，将其浸渍在-196℃的液氮中，冷冻脆化6-12h；即可获得纯度较高且带有羧基官能团的单壁碳纳米管SWCNTs-1。
所述，纯度的提升主要表现在去除无定形碳、纳米碳颗粒和金属催化剂。
（2）基于改性单壁碳纳米管制备（SWCNTs-1/PLGA / BMP）骨支架复合材料：将PLGA溶解在异丙醇中，制得0.5-1g/L的PLGA溶液，然后将步骤（1）制得的SWCNTs-1与PLGA溶液超声搅拌0.5-3h，待充分吸附后，将混合液置于零下50至零下20℃下冷冻12-24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24-48h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将BMP提取液与6%的聚乙烯醇按1：5的体积比例充分混合并放入喷头中，将SWCNTs-1/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，固定好喷头与接收板之间的距离，然后进行雾化喷涂，最后在40-50℃温度区间内真空干燥12-24h，即可获得SWCNTs-1/PLGA / BMP支架。
所述，SWCNTs-1、PLGA与BMP的质量比0.01：（0. 03-2）：（0.0022-0.01）。所述，SWCNTs-1、PLGA溶液与BMP提取液的质量体积比0.01g：（0.72-8）mL：（0.1-1）mL。
优选的，步骤（1）所述的煅烧温度为350-450℃，煅烧时间为2-5h，升温速率为2℃/min。
优选的，步骤（1）和步骤（2）所述的超声温度为4-10℃，超声功率为120-300 W。
优选的，步骤（1）中所述酸为8%-20%的盐酸、20%-50%硫酸或者20%-50%的硝酸中的一种或几种，其中碳纳米管与酸的质量体积比为10g：（0.3-1.5）L。
优选的，步骤（1）所述的油浴温度为100-130℃。
优选的，步骤（2）所述的PLGA为LA/GA=（72-85）/（28-15）。
优选的，步骤（2）所述的喷头与接收板之间的距离为8-15cm。
优选的，步骤（2）所述的喷头喷洒速度为60-150ml/h。
上述制备方法制得的SWCNTs-1/PLGA / BMP复合材料应用于骨支架相关的研究。
本发明的优点在于：
1、本发明制备的SWCNTs-1通过煅烧、剪切、超声、磁吸、酸洗、冷冻干燥以及过滤等处理手段，去除了与碳有关的杂质和金属催化剂，进一步提高了单壁碳纳米管的纯度、亲水性以及分散性。当它作为基体材料时，对PLGA和BMP展示出强吸附特性，为后续与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）以及骨形态发生蛋白（BMP）复合提供了更好的融合效果。
2、本发明制备的SWCNTs-1/PLGA / BMP复合材料主要以改性单壁碳纳米管SWCNTs-1、PLGA 和BMP为主要合成原料，三者对骨支架的构建提供了良好的效果。其中SWCNTs-1通过表面改性，引入羧基官能团，改善了SWCNTs的分散性、生物安全性和生物相容性；PLGA通过调节聚羟基乙酸（PGA）和聚乳酸（PLA）的比例来控制降解速率，使其能在人体保持较长的时间，其具有良好的生物相容性、无毒、良好的成膜的性能，当和BMP结合使用时，可以增强骨骼再生的能力；BMP能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞，对骨骼的胚胎发育和再生修复可以起到重要的作用。所以当三者结合应用于骨支架研究，这不仅有利于骨结构的支撑，还有利于细胞附着、生长与修复，从而维护内环境运行稳定。
附图说明
图1是本发明的粗样品单壁碳纳米管SWCNTs的扫描电镜图；
图2是本发明实施例1改性前后的单壁碳纳米管的扫描电镜图；其中图2(a)和(b)为改性后单壁碳纳米管的扫描电镜图，图2(c) 为改性前的粗样品单壁碳纳米管的扫描电镜图；
图3是本发明实施例1和对比例1的热重曲线图；
图4 是本发明实施例1-2和对比例1-2的杨氏模量数据图；
图5是本发明实施例1和对比例1的接触角数据图；
图6 是本发明实施例1和对比例1对细胞毒性的检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
（1）制备改性单壁碳纳米管（SWCNTs-1）材料：将1g粗产品单壁碳纳米管放入管式炉中，以2℃/min的升温速率升温至350℃，煅烧3h，取出碳等杂质；然后将煅烧后的产物用砂磨机研磨4h，再与100mL乙醇混合、搅拌；将所得的分散液转移到烧瓶中，并在4℃以及200W功率下超声3h；然后用一个永久磁极收集铁等磁性粒子，在经过5次清洗、过滤后，将产物用100mL,15%的盐酸浸泡5h，然后转移到油浴锅中，在105℃下回流加热24h；然后经去离子水清洗至中性，将其浸渍在-196℃的液氮中，冷冻脆化10h；即可获得纯度较高且带有羧基官能团的单壁碳纳米管SWCNTs-1。
（2）基于改性单壁碳纳米管制备（SWCNTs-1/PLGA / BMP）骨支架复合材料：将5gPLGA溶解在200mL异丙醇中，制得2.5g/L的PLGA溶液，然后将步骤（1）制得的0.1g SWCNTs-1与70mL PLGA（LA/GA=82/18）溶液超声搅拌2h，待充分吸附后，将混合液置于零下30℃下冷冻24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将3ml BMP 提取液和15ml,6%的聚乙烯醇充分混合并放入喷头中，将SWCNTs-1/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，喷头距离接收板10㎝，喷头喷洒速率调控为100ml/h，然后开始进行雾化喷涂，最后在40℃环境中进行24h真空干燥，即可获得SWCNTs-1/PLGA / BMP支架。
图1和图2(c)为粗样品的单壁碳纳米管的扫面电镜图，从图中可直观的观察到一些相互交错、甚至缠绕的单壁碳纳米管束, 单壁碳纳米管内径约为2nm；
图2(a)和图2(b)为实施例1中的改性后的单壁碳纳米管，与图2(c) 粗样品的单壁碳纳米管相比，可观察到实施例1中的改性后的单壁碳纳米管的长度被剪切，这是由于砂磨造成的，这避免了单壁碳纳米管在后续处理时出现团聚、缠绕等问题，并且经剪切、酸化后，单壁碳纳米管能够均匀稳定的分散，这有利于后续和PLGA 、BMP复合。
实施例2
（1）制备改性单壁碳纳米管（SWCNTs-1）材料：将1g粗产品单壁碳纳米管放入管式炉中，以2℃/min的升温速率升温至350℃，煅烧3h，取出碳等杂质；然后将煅烧后的产物用砂磨机研磨4h，再与100mL乙醇混合、搅拌；将所得的分散液转移到烧瓶中，并在4℃以及200W功率下超声3h；然后用一个永久磁极收集铁等磁性粒子，在经过5次清洗、过滤后，将产物用100mL,15%的盐酸浸泡5h，然后转移到油浴锅中，在105℃下回流加热24h；然后经去离子水清洗至中性，将其浸渍在-196℃的液氮中，冷冻脆化10h；即可获得纯度较高且带有羧基官能团的单壁碳纳米管SWCNTs-1。
（2）基于改性单壁碳纳米管制备（SWCNTs-1/PLGA / BMP）骨支架复合材料：将5gPLGA溶解在200mL异丙醇中，制得2.5g/L的PLGA溶液，然后将步骤（1）制得的0.1g SWCNTs-1与50mL PLGA（LA/GA=82/18）溶液超声搅拌1h，待充分吸附后，将混合液置于零下30℃下冷冻24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将3ml BMP提取液和15ml,6%的聚乙烯醇充分混合并放入喷头中，将SWCNTs-1/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，喷头距离接收板10㎝，喷头喷洒速率调控为100ml/h，然后开始进行雾化喷涂，最后在45℃环境中进行24h真空干燥，即可获得SWCNTs-1/PLGA / BMP支架。
实施例3
（1）制备改性单壁碳纳米管（SWCNTs-1）材料：将1g粗产品单壁碳纳米管放入管式炉中，以2℃/min的升温速率升温至350℃，煅烧3h，取出碳等杂质；然后将煅烧后的产物用砂磨机研磨4h，再与100mL乙醇混合、搅拌；将所得的分散液转移到烧瓶中，并在4℃以及200W功率下超声3h；然后用一个永久磁极收集铁等磁性粒子，在经过5次清洗、过滤后，将产物用100mL,15%的盐酸浸泡5h，然后转移到油浴锅中，在105℃下回流加热24h；然后经去离子水清洗至中性，将其浸渍在-196℃的液氮中，冷冻脆化10h；即可获得纯度较高且带有羧基官能团的单壁碳纳米管SWCNTs-1。
（2）基于改性单壁碳纳米管制备（SWCNTs-1/PLGA / BMP）骨支架复合材料：将5gPLGA溶解在200mL异丙醇中，制得2.5g/L的PLGA溶液，然后将步骤（1）制得的0.1g SWCNTs-1与100mL PLGA（LA/GA=80/20）溶液超声搅拌1h，待充分吸附后，将混合液置于零下30℃下冷冻24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将10ml BMP 提取液和50ml,6%的聚乙烯醇充分混合并放入喷头中，将SWCNTs-1/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，喷头距离接收板10㎝，喷头喷洒速率调控为100ml/h，然后开始进行雾化喷涂，最后在45℃环境中进行24h真空干燥，即可获得SWCNTs-1/PLGA / BMP支架。
对比例1
本发明对比例1与上述实施例1的区别为单壁碳纳米管未改性，直接和PLGA 、BMP复合。
将5g PLGA溶解在200mL异丙醇中，制得2.5g/L的PLGA溶液，然后将0.1g SWCNTs与70mL PLGA（LA/GA=82/18）溶液超声搅拌2h，待充分吸附后，将混合液置于零下30℃下冷冻24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24h，即可获得多孔的SWCNTs/PLGA支架；然后将3ml BMP提取液和15ml,6%的聚乙烯醇充分混合并放入喷头中，将SWCNTs/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，喷头距离接收板10㎝，喷头喷洒速率调控为100ml/h，然后开始进行雾化喷涂，最后在40℃环境中进行24h真空干燥，即可获得SWCNTs/PLGA /BMP支架。
对比例2
本发明对比例2与对比例1的区别为与PLGA 、BMP复合的是多壁碳纳米管。
将5g PLGA溶解在200mL异丙醇中，制得2.5g/L的PLGA溶液，然后将0.1g MWCNTs与70mL PLGA（LA/GA=82/18）溶液超声搅拌2h，待充分吸附后，将混合液置于零下30℃下冷冻24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将3ml BMP 提取液和15ml,6%的聚乙烯醇充分混合并放入喷头中，将MWCNTs/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，喷头距离接收板10㎝，喷头喷洒速率调控为100ml/h，然后开始进行雾化喷涂，最后在40℃环境中进行24h真空干燥，即可获得MWCNTs/PLGA /BMP支架。
图3是实施例1和对比例1的热重曲线图，随着温度不断升高，材料损失逐渐增大，直到加热到800℃时，达到平衡。从图中可观察到他们的失重率分别为93.5%和82.8%。其中实施例1制备的SWCNTs-1/PLGA / BMP复合材料主要的失重区间为450-650℃，其具有较少量的剩余物，约为6.5%，一般损失的是材料中的有机物；而对比例1制备的SWCNTs/PLGA /BMP复合材料的失重温度从350℃开始，这说明未改性的单壁碳纳米管里有很多碳杂质。这也从侧面说明了，改性后的SWCNTs-1得到了进一步的纯化。
图4 是本发明实施例1-2和对比例1-2的杨氏模量数据图，杨氏模量体现了碳纳米管结构在拉伸或压缩下承受的长度变化。从图中数据可观察到他们的杨氏模量依次为1205GPa，1012GPa，1078GPa，570GPa。本发明实施例1-2和对比例1都是单壁碳纳米管为主要成分的材料，其杨氏模量均高于对比例2，这也体现了单壁碳纳米管相较多壁碳纳米管具有更优异的机械性能，具有更强的机械支撑作用；而实施例1-3的杨氏模量又高于对比例1，这说明了改性后的单壁碳纳米管的机械性能得到了进一步的提升。
从图5数据可观察到实施例1和对比例1的接触角分别为100°和30°，改性后的单壁碳纳米管的接触角大幅度降低，表明其具有极好的亲水性，也进一步提高了材料的分散稳定性，这都可归因于羧基官能团带来的影响。
为了进一步研究单壁碳纳米管用于骨支架的可行性，对本发明实施例1和对比例1制备的样品进行细胞毒性检测。 该测试使用的骨细胞是采购于北纳生物BNCC255176的人SV40转染的成骨细胞（hFOB1.19），将其作为细胞毒性的试验对象。该测试使用的细胞培养液为CM9-1 培养液，其包含了90%DMEM-H/F12、10%FBS以及0.3mg/mL的G418；其中DMEM-H/F12是由含有谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM高糖培养液与F12培养液按1:1比例混合的。该细胞毒性检测实验的具体步骤如下：
（1）将hFOB1.19细胞接种于96 孔培养板中，每孔体积为100μl，每孔有5000细胞，然后加入CM9-1 培养液使其悬浮；再将细胞置于34℃、5% CO2、95%空气的细胞培养箱中培养24 h；
（2）将实施例1和对比例1制备的单壁碳纳米管分别溶于CM9-1 培养液，超声分散5-10min，随后进行1h的紫外灯消毒处理；然后将步骤（1）中培养完毕的细胞的原培养液吸出，用PBS冲洗1次，再向孔板中加入90μl的新鲜培养液，以及10μl 碳纳米管；再将96孔板放入34℃、5% CO2、95%空气的细胞培养箱中培养24 h，72h；最终将每组材料分别配成了0，50，100μg/ml的3种不同浓度梯度的试液，并分别做了3组平行实验（共计36组试验）；
（3）待单壁碳纳米管作用于hFOB1.19细胞24h，72h后，再次吸出原培养液，经PBS清洗后再注入90μl新鲜的培养液，以及10μl的CCK-8试剂，然后在细胞培养箱内孵育3h；孵育结束后，用酶标仪测定其在450 nm处的吸光度值。
由图6的数据可以看出，实施例1制备的改性后的单壁碳纳米管对在24h，72h作用下的hFOB1.19细胞的存活率皆高于对比例1粗样品的单壁碳纳米管；并且改性后的单壁碳纳米管在24h和72h分别对细胞作用，他们的存活效率相差不大，这表明单壁碳纳米管改性后，显著的提高了生物相容性和生物安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）制备改性单壁碳纳米管（SWCNTs-1）材料：将粗产品单壁碳纳米管放入管式炉中进行煅烧；然后将煅烧后的产物用砂磨机研磨3-5h，再与乙醇混合、搅拌；将所得的分散液超声破碎处理1-4h，然后用一个永久磁极收集铁等磁性粒子，在经过数次清洗、过滤后，将产物用酸处理并油浴加热12-36h；经去离子水清洗至中性后，将其浸渍在液氮中，冷冻脆化后，即可获得纯度较高且带有羧基官能团的单壁碳纳米管SWCNTs-1；
（2）基于改性单壁碳纳米管制备（SWCNTs-1/PLGA /BMP）骨支架复合材料：将PLGA溶解在异丙醇中，制得0.5-2.5g/L的PLGA溶液，然后将步骤（1）制得的SWCNTs-1与PLGA溶液超声搅拌0.5-3h，待充分吸附后，将混合液置于零下50-零下20℃下冷冻12-24h，再取出在零下30℃环境中进行真空干燥24-48h，即可获得多孔的SWCNTs-1/PLGA支架；然后将BMP 提取液与6%的聚乙烯醇按1：5的体积比例充分混合并放入喷头中，将SWCNTs-1/PLGA支架放置于超声喷涂机中心区域的接收板上，进行雾化喷涂，最后进行真空干燥，即可获得SWCNTs-1/PLGA /BMP支架；
所述，SWCNTs-1、PLGA与BMP的质量比0.01：（0. 03-2）：（0.0022-0.01）；
所述，SWCNTs-1、PLGA溶液与BMP提取液的质量体积比0.01g：（0.72-8）mL：（1-10）mL。
2.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的煅烧温度为350-450℃, 煅烧时间为2-5h，升温速率为2℃/min。
3.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）所述的超声温度为4-10℃，超声功率为120-300 W。
4.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述酸为8%-20%的盐酸、20%-50%硫酸或者20%-50%的硝酸中的一种或几种，其中碳纳米管与酸的质量体积比为10g：（0.3-1.5）L。
5.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的油浴温度为100-130℃。
6.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的PLGA为LA/GA=（72-85）/（28-15）。
7.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的喷头与接收板之间的距离为8-15cm。
8.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的喷头喷洒速度为60-150ml/h。
9.根据权利要求1所述的一种基于改性单壁碳纳米管的骨支架材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的真空干燥的温度为40-50℃，时间为12-24h。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的一种基于改性单壁碳纳米管制备的复合材料应用于骨支架相关的研究。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20230228 |