CN102428105A

CN102428105A - 含有治疗性tpo/epo模拟肽的抗体

Info

Publication number: CN102428105A
Application number: CN2010800183638A
Authority: CN
Inventors: J·P·斯普林霍恩; D·吉斯
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2030-02-18
Also published as: EP2401302A4; JP2015043783A; NZ594638A; EP2401302A1; RU2559526C2; US9493551B2; AU2010218277A1; BRPI1008035A2; AU2010218277B2; SG173680A1; US20120070434A1; CN102428105B; KR20110122846A; EP2752427A1; RU2011139129A; MX2011008936A; WO2010099019A1; JP2012518408A; CA2753438A1; IL214714A0

Abstract

本公开内容的特征在于治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)及其治疗活性片段以及用于制备和使用所述抗体和片段的方法。例如，治疗性抗体及其片段可用于各种诊断和/或治疗应用，例如用于增加受试者的血小板水平的方法。

Description

含有治疗性TPO/EPO模拟肽的抗体

相关申请

本申请要求2009年2月24日提交的美国临时申请顺序号61/208,487的权益，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。

序列表

本申请包括已通过EFS-Web提交的序列表，并通过引用以其整体结合到本文中。在2010年2月18日生成的所述ASCII复本命名为ALXN146WO1.txt，大小为18,946字节。

技术领域

本发明的领域是医学、免疫学、分子生物学和蛋白质化学。

背景

血小板减少症与多种疾病有关，其特征在于通常因血小板产生不足、血小板隔离、缺陷型血小板产生或血小板破坏增加而引起的血液血小板计数异常低下。血小板减少症的症状包括例如不适、瘀伤(例如紫癜)和出血(例如鼻出血或牙龈出血)。血小板减少症相关疾病的一个实例是血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，该病的特征在于在全身小血管中形成广泛性显微镜性血凝块(血栓)。如果不治疗，则患者的情况会迅速恶化成包括重度神经功能缺损(例如木僵或昏迷)、肾衰竭、中风和心脏停搏。未治疗的TTP的死亡率大于90％。

血小板减少症相关疾病也可因辐射暴露(例如放射治疗方案)、癌症、给予某些化合物(例如细胞毒性药物)和对某些疫苗的免疫应答而引起。

血小板生成素(TPO)是一种糖基化生长因子，它刺激巨核细胞这种产生大量血小板的骨髓细胞的产生和分化。(参见例如Kaushansky(2006)N.Engl.J.Med.354(19)：2034-45)。TPO与在巨核细胞祖细胞上表达的c-Mpl受体结合，从而刺激细胞增殖并分化成血小板。事与愿违的是，患者用重组人TPO治疗导致抗TPO中和抗体的产生，该抗TPO中和抗体与患者的天然存在TPO结合并干扰其活性。(参见例如Kuter和Begley(2002)Blood 100：3457-3469；Li等(2001)Blood98：3241-3248；以及Vadhan-Raj等(2000)Ann Intern Med 132：364-368)。因此，需要用于血小板减少症相关疾病的患者的新的更好的治疗方法。

概述

本公开内容涉及含有治疗性肽的有治疗活性的重组抗体(这些抗体在下文中称为“治疗性抗体”)。在一些实施方案中，抗体含有本公开内容的血小板生成素(TPO)模拟肽(这些抗体在下文中称为“TPO模拟抗体”)。本公开内容还涉及治疗性抗体的治疗活性片段(例如TPO模拟抗体的治疗活性片段)。例如，可以在各种诊断和/或治疗应用中使用治疗性抗体及其片段。例如，如工作实施例中所述，TPO模拟抗体和/或其片段可用于治疗需要增加血小板产生的受试者，例如暴露于辐射(例如进行放射治疗的癌症患者)或消耗骨髓、降低血小板产生和/或增加血小板破坏的其它物质的受试者。TPO模拟抗体和/或片段还可用于治疗患有血小板水平不足(血小板减少症)相关病症(例如本文描述的或本领域已知的这类病症中的任一种)的受试者。

与相应的分离的治疗性肽相比，本文所述治疗性抗体及其治疗活性片段具有多个优势。首先，抗体的血清半寿期延长。其次，可稳定抗体支架内治疗性肽的活性区域的构象，就其与靶标结合而言，赋予它比分离的治疗性肽更大的活性和特异性。另外，与其分离的天然TPO肽对应物相比，本文描述的TPO模拟抗体和片段具有多个额外优势。例如，给予哺乳动物受试者(例如人受试者)时，TPO模拟抗体或其治疗活性片段显著降低对天然TPO产生有害免疫应答的可能性。这与采用天然TPO蛋白的重组形式的治疗相反，后者通常导致在患者中产生TPO中和抗体，该抗体干扰患者的天然存在的TPO的活性。参见例如Kuter和Begley(2002)Blood 100：3457-3469；Li等(2001)Blood 98：3241-3248；以及Vadhan-Raj等(2000)Ann Intern Med132：364-368。本文描述的TPO模拟抗体(和治疗活性片段)的又一个优势是在提高受试者的血小板水平方面，单剂量的TPO模拟抗体与多剂量方案一样有效，或者比多剂量方案更有效。

本文所述治疗性抗体的许多优势由治疗性肽在抗体支架内的独特位置造成。如本文详述和工作实施例中举例说明的一样，本发明人开发了含有在轻链多肽恒定区内的独特位置上和/或在重链多肽恒定区内的独特位置上整合的治疗性肽的治疗性抗体。例如，本发明人已证实，将治疗性肽整合到重链多肽铰链区上或附近，导致治疗性抗体具有本文描述的多个优势。同样，通过将治疗性肽整合到结构上允许治疗性肽存在于抗体的中心裂口(central cleft)的轻链恒定区的位置上(例如在轻链多肽恒定区的β转角区或轻链恒定区的羧基端)，产生具有本文描述的多个优势的治疗性抗体。本文使用的抗体的“中心裂口”是指其中完整抗体两“臂”相交的该抗体的区域。也就是说，所有的完整免疫球蛋白(Ig)分子由4条蛋白质链(2条重链多肽和2条轻链多肽)组成，呈三维结构，形状像大写字母“Y”，其由二硫键连接在一起。“Y”结构的“臂”含有抗体可变区，中心裂口区之间位于“Y”结构两臂的连接处。

因此，一方面，本公开内容的特征在于治疗性抗体或抗体的治疗活性片段，其中抗体或片段包含至少两个治疗性肽，且其中至少一个治疗性肽在结构上允许治疗性肽存在于抗体中心裂口的位置上整合到轻链多肽的恒定区。治疗性抗体或其片段还可含有重链多肽，所述重链多肽含有至少一个治疗性肽。所述至少一个治疗性肽如下整合到铰链区：(a)整合到重链多肽的铰链区中；(b)整合在铰链区的氨基端与铰链区上游的重链多肽区之间的连接处；(c)整合在铰链区的羧基端与铰链区下游的重链多肽区之间的连接处；或(d)整合在始于重链多肽铰链区的氨基端上游少于20个氨基酸或者重链多肽铰链区的羧基端下游少于20个氨基酸内的位置上。

另一方面，本公开内容的特征在于治疗性抗体或抗体的治疗活性片段，其中抗体或片段包含至少两个治疗性肽，且其中抗体的重链多肽包含至少一个如下整合到重链中的治疗性肽：(a)整合到重链多肽的铰链区中；(b)整合在铰链区的氨基端与铰链区上游的重链多肽区之间的连接处；(c)整合在铰链区的羧基端与铰链区下游的重链多肽区之间的连接处；或(d)整合在始于重链多肽铰链区的氨基端上游少于20个氨基酸或者重链多肽铰链区的羧基端下游少于20个氨基酸内的位置上。治疗性抗体或其治疗活性片段还可含有轻链多肽，其中轻链多肽的恒定区包含至少一个治疗性肽。治疗性肽(例如TPO模拟肽)在结构上允许治疗性肽存在于抗体中心裂口的位置上整合到轻链多肽的恒定区。

在本文描述的任何治疗性抗体或其片段的一些实施方案中，治疗性肽可因在轻链多肽恒定区的β转角区内的插入和/或置换而整合。在本文描述的任何治疗性抗体或其片段的一些实施方案中，治疗性肽可因添加至轻链多肽的羧基端而整合。在一些实施方案中，治疗性肽可因多肽中最终的β折叠下游的轻链多肽恒定区某一区域的插入和/或置换而整合。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，重链的整个铰链区被治疗性肽置换。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，轻链多肽的羧基端包含至少一个治疗性肽，重链多肽包含至少一个治疗性肽。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，抗体或片段包含至少3个(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12或15或更多个)治疗性肽。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，至少两个治疗性肽是相同的。在一些实施方案中，至少两个治疗性肽彼此不同。例如，至少两个不同的治疗性肽可具有不同的氨基酸序列，但却具有相同类型的治疗活性(例如两个TPO模拟物具有不同的氨基酸序列)，或者至少两个不同的治疗性肽可具有不同的氨基酸序列和不同的治疗活性(例如TPO模拟物和EPO模拟物)。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，所有治疗性肽是相同的。在一些实施方案中，所有治疗性肽彼此不同(例如一个或两个不同的氨基酸序列和不同的治疗活性)。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，治疗性抗体或其治疗活性片段的至少一个抗原结合部位保持与抗原结合的能力。在一些实施方案中，治疗性抗体或其治疗活性片段的至少两个抗原结合部位保持与抗原结合的能力。

在一些实施方案中，任何治疗性抗体或其治疗活性片段可包括作为至少一个治疗性肽的氨基端的间隔基氨基酸序列和/或作为至少一个治疗性肽的羧基端的间隔基氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔基氨基酸序列可存在于治疗性肽的氨基端和羧基端两端。两个间隔基可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，至少一个治疗性肽是拮抗剂肽。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，至少一个治疗性肽是激动剂肽。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，至少一个治疗性肽是肽模拟物(例如TPO模拟物或EPO模拟物)。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，所有治疗性肽是TPO模拟物(例如含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所述氨基酸序列组成的TPO模拟物)。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，治疗性抗体可含有包含SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽和/或包含SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，抗体含有包含SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽和包含SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽，或者由所述轻链多肽和所述重链多肽组成。在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，抗体由包含SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽和包含SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽组成。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，抗体可以是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合化抗体(chimerized antibody)、嵌合抗体、去免疫化人抗体(deimmunized human antibody)、完全人抗体或F(ab’)₂片段。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，治疗活性片段可选自Fd片段、Fab片段和Fab’片段，其中治疗活性片段含有至少两个治疗性肽以及至少部分的重链多肽铰链区或至少部分的轻链多肽羧基端。

在任何治疗性抗体或其治疗活性片段的一些实施方案中，抗体或治疗活性片段含有异源部分。

在一些实施方案中，本文描述的任何治疗活性片段包括抗体轻链多肽和/或重链多肽的可变区的至少部分或全部。部分可变区包括至少2个(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31。32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或超过100个)轻链多肽和/或重链多肽的氨基酸。至少部分可变区可包括一个或多个轻链(LC)多肽或重链(HC)多肽CDR(例如LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3)、构架区(FR)(例如LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3、LC-FR4、HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4)或任何前述部分的任何组合。在一些实施方案中，治疗活性片段不是抗体的Fc片段。

另一方面，本公开内容的特征在于任何治疗性抗体或其治疗活性片段和药学上可接受的载体的组合物。例如，在一些实施方案中，组合物可含有本文描述的任何TPO模拟抗体。

在一些实施方案中，可配制本文描述的任何组合物用作单剂量。在一些实施方案中，可配制本文描述的任何组合物用于多剂量。

在一些实施方案中，本文描述的任何组合物还可含有至少一种用于降低辐射暴露的副作用或用于降低化学治疗的副作用的活性剂。至少一种活性剂可选自抗生素、麻醉剂、止吐药、类固醇、螯合剂和利尿药。

在一些实施方案中，本文描述的任何组合物还可包括至少一种用于增加受试者的血小板产生的其它活性剂。至少一种其它活性剂可为例如艾曲波帕(eltrombopag)、奥普瑞白介素、罗米司亭(romiplostim)、培非司亭、红细胞生成素刺激剂(ESA)或本文描述的或本领域已知的任何其它合适的物质。

又一方面，本公开内容的特征在于用于增加受试者的血小板产生的方法。所述方法包括将治疗有效量的包含本文描述的任何TPO模拟抗体或其治疗活性片段的组合物给予有需要的受试者的步骤。

另一方面，本公开内容的特征在于用于增加受试者的血小板产生的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的本文描述的任何TPO模拟抗体或其治疗活性片段的组合物给予有需要的受试者。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人或非人类灵长类动物。在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者患有与血小板计数不足相关的病症。所述病症可为例如以下中的任一种：伯-索综合征(Bernard-Soulier syndrome)、特发性血小板减少性紫癜、威-奥综合征、脾功能亢进、血栓性微血管病、弥散性血管内凝血、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、冯维勒布兰德病(von Willebrand disease)、变型冯维勒布兰德病(variant von Willebrand disease)、因HIV感染所致的血小板减少症、因慢性肝病所致的血小板减少症或格兰兹曼血小板机能不全(Glanzmann’s thrombasthenia)。在一些实施方案中，所述病症可因治疗受试者的病毒感染、癌症或炎性疾病而引起。例如，病症可因细胞毒性药物疗法所致(例如药物诱导性血小板机能不全)。在一些实施方案中，可因给予受试者放射治疗方案而引起所述病症。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，受试者可能患有癌症，例如但不限于肺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症(hematological cancer)、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，血小板机能不全由化学治疗药引起。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，已经给予或将要给予受试者化学治疗方案或放射治疗方案。化学治疗方案可包括将一种或多种选自以下的细胞毒性剂给予受试者：环磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、顺铂、诺考达唑、羟基脲、长春新碱、长春碱、依托泊苷(etopiside)、多柔比星、博来霉素、卡铂、吉西他滨、紫杉醇、托泊替康和硫鸟嘌呤。放射治疗方案可包括X射线或γ辐射。放射治疗方案可包括将放射性试剂给予受试者。在一些实施方案中，可在化学治疗方案或放射治疗方案之前将组合物给予受试者。在一些实施方案中，可在化学治疗方案或放射治疗方案期间或之后将组合物给予受试者。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，可以静脉内、皮下、腹膜内或肌内给予受试者组合物。在本文所述任何方法的一些实施方案中，按单剂量或不止一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个或更多个)剂量的组合物，将组合物给予受试者。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，可以在化学治疗方案或放射治疗方案(i)之前和(ii)期间或之后将组合物给予受试者。

在本文所述任何方法的一些实施方案中，化学治疗方案或放射治疗方案与在不给予所述组合物的情况下可能是安全可行的相比，可(i)更有效，或(ii)更频繁地给予受试者。

在一些实施方案中，本文所述任何方法还可包括给予受试者至少一种用于降低化学治疗方案或放射治疗方案的副作用的其它物质。所述至少一种物质可选自抗生素、麻醉剂、止吐药和类固醇，例如雄烯二醇。在一些实施方案中，本文所述任何方法还可包括给予受试者至少一种增加血小板产生的其它物质。所述至少一种增加血小板产生的其它物质可选自以下之一：艾曲波帕、奥普瑞白介素、罗米司亭、培非司亭和ESA。

在一些实施方案中，本文所述任何方法还可包括在给予组合物后，监测受试者的血小板水平的提高。

又一方面，本公开内容的特征在于用于增加受试者的血小板产生的方法，所述方法包括将单剂量的增加血小板产生量的本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段给予有需要的受试者。本公开内容的特征还在于用于治疗受试者的辐射暴露或降低血小板水平的化学治疗方案的方法。所述方法包括将单剂量的增加血小板产生量的本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段给予受试者。受试者可以是已经进行、很可能进行或按计划进行化学治疗方案或放射治疗方案的受试者。受试者可以是已经暴露、可能暴露或按计划暴露于辐射的受试者。

又一方面，本公开内容的特征在于用于增加受试者的血小板产生的方法，所述方法包括将多次(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次)剂量的增加血小板产生量的本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段给予有需要的受试者。本公开内容的特征还在于用于治疗受试者的辐射暴露或降低血小板水平的化学治疗方案的方法。所述方法包括将多剂量的增加血小板产生量的本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段给予受试者。受试者可以是已经进行、很可能进行或按计划进行化学治疗方案或放射治疗方案的受试者。受试者可以是已经暴露、很可能暴露或按计划暴露于辐射的受试者。

另一方面，本公开内容的特征在于编码含有至少一种(例如至少2、3、4、5、6或8种)TPO模拟肽的多肽的核酸，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所述氨基酸序列有至少80％(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。在一些实施方案中，所述核酸编码具有与SEQ ID NO：10的氨基酸1-214有至少80％同一性或与SEQ ID NO：10的氨基酸1-218有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：10的氨基酸219-232在所述氨基酸序列和SEQ ID NO：10之间有100％同一性。在一些实施方案中，所述核酸编码具有与SEQ ID NO：12的氨基酸1-234有至少80％同一性和与SEQ ID NO：12的氨基酸249-461有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：12的氨基酸235-248在所述氨基酸序列和SEQ ID NO：12之间有100％同一性。在一些实施方案中，核酸编码与SEQ ID NO：12的氨基酸1-232有至少80％同一性和与SEQ ID NO：12的氨基酸251-461有至少80％同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：12的氨基酸235-248在所述氨基酸序列和SEQ ID NO：12之间有100％同一性。

将百分比(％)氨基酸序列或核酸序列同一性定义为在比对序列和必要时引入空位以达到最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参比序列的氨基酸或核酸相同的氨基酸或核酸的百分比。可按本领域技术人员掌握的不同方法实现用于确定百分比序列同一性目的的比对，例如，应用可公开获取的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。测定比对的合适参数，包括对在比较中的全长序列内获得最大比对所需的任何算法，可通过已知方法确定。

除非另有说明，否则本文使用的全部科技术语都具有本公开内容所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。万一发生抵触，则以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法与材料，然而类似或等同于本文描述的方法与材料也可用于实施或检验本发明公开的方法和组合物。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。

根据下面的说明书、实施例和随附权利要求书，本公开内容的其它特征和优势(例如用于增加受试者的血小板产生的方法)是显而易见的。

附图简述

图1是表示重组人TPO和若干TPO模拟物组合物的多剂量方案对小鼠血小板水平的作用的线图。Y轴表示血小板计数，单位为10⁶/mL。X轴表示开始治疗方案后的天数。如双箭头所示，治疗进行了5天。黑色圆圈表示用在F(ab’)₂抗体的重链CDR3区和轻链CDR2区含有TPO模拟物的F(ab’)₂抗体片段治疗的小鼠。空心圆圈表示用不含TPO模拟物的抗补体成分C5抗体(5G1.1)治疗的小鼠。黑色正方形表示用重组人TPO治疗的小鼠，黑色菱形表示用在CDR3区含有TPO模拟物的抗补体成分C5抗体(5G1.1)治疗的小鼠。含有TPO模拟物的抗C5抗体不与C5结合。抗C5抗体的重链恒定区是IgG2/IgG4恒定区融合物。

图2是表示TPO模拟抗体的多剂量方案对小鼠血小板水平的作用的线图。Y轴表示血小板计数，单位为10⁶/mL。X轴表示开始治疗方案后的天数。如双箭头所示，治疗进行了5天。黑色菱形表示用在重链CDR3区含有TPO模拟物的抗补体成分C5抗体(5G1.1)治疗的小鼠。含有TPO模拟物的抗C5抗体不与C5结合，且抗C5抗体的重链恒定区是IgG2/IgG4恒定区融合物。空心正方形表示用不含TPO模拟物并具有IgG1同种型恒定区的抗炭疽抗体治疗的小鼠。黑色三角形(左下角为直角)表示用抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中每条轻链多肽在其羧基端含有TPO模拟肽。黑色三角形(右下角为直角)表示用抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中每条重链多肽在铰链区附近含有TPO模拟物。黑色正方形表示用抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中每条轻链多肽和重链多肽含有TPO模拟肽。含有TPO模拟物的各种抗炭疽抗体还含有IgG2/IgG4融合重链恒定区。

图3表示TPO模拟抗体的单剂量方案对小鼠血小板水平的作用的线图。Y轴表示血小板计数，单位为10⁶/mL。X轴表示开始治疗方案后的天数。实心正方形表示用在CDR3区含有TPO模拟物的抗补体成分C5抗体(5G1.1)治疗的小鼠。含有TPO模拟物的抗C5抗体不与C5结合。含有TPO模拟物的各种抗C5抗体还含有IgG2/IgG4融合重链恒定区。星号表示用不含TPO模拟物的抗炭疽抗体治疗的小鼠。抗炭疽抗体含有IgG1同种型重链恒定区。实心三角形表示用抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中各轻链多肽含有TPO模拟肽。空心三角形表示用抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中各轻链多肽和重链多肽含有TPO模拟肽。抗炭疽抗体含有IgG2/IgG4融合重链恒定区。菱形表示用不含TPO模拟物的抗炭疽抗体治疗的小鼠，其中重链恒定区为IgG2/IgG4恒定区。

图4是表示在骨髓抑制疗法后CDR-TPO抗体对血小板水平的作用的线图。Y轴表示血小板计数，单位为10⁶/mL。X轴表示开始治疗方案后的天数。实心圆圈表示用丝裂霉素C(MMC)和不含TPO模拟物的抗C5抗体(5G1.1)治疗的小鼠。实心正方形表示用MMC和CDR-TPO抗体(含有插入CDR3的TPO模拟物的抗C5抗体(5G1.1))治疗的小鼠。含有TPO模拟物的抗C5抗体不与C5结合。实心菱形表示未用抗体或MMC治疗的小鼠。各种含有TPO模拟物的抗C5抗体还含有IgG2/IgG4融合重链恒定区。

详述描述

本公开内容的特征在于治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)及其治疗活性片段以及用于制备和使用所述抗体和片段的方法。在不以任何方式予以限制的同时，下面对示例性抗体和片段、缀合物、药物组合物和制剂以及使用任何前述物质的方法进行详细说明，并且在工作实施例中举例说明。

治疗性抗体及其治疗活性片段

本文描述的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)含有至少两个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)治疗性肽(例如TPO模拟肽)，其中(i)抗体的轻链多肽包含至少一个治疗性肽(例如TPO模拟肽)和/或(ii)抗体的重链多肽包含至少一个治疗性肽(例如TPO模拟肽)。至少一个治疗性肽(例如TPO模拟肽)如下整合到重链中：(a)整合到铰链区本身；(b)整合到铰链区氨基端和重链上游区之间的连接处；(c)整合到铰链区羧基端和重链下游区之间的连接处；或(d)整合到始于铰链区氨基端上游少于20(例如少于19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)个氨基酸内的位置上或者始于铰链区羧基端下游少于20(例如少于19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)个氨基酸内的位置上。

按照本公开内容，至少一个治疗性肽(例如TPO模拟肽)在结构上允许治疗性肽存在于抗体中心裂口的位置上整合到轻链多肽的恒定区。在轻链多肽恒定区情况下，本文使用的“结构上允许的”区域或位置是指在轻链恒定区内的这样的区域或位置：其(1)可容许插入、置换和/或添加治疗性肽而又基本上不影响恒定区的三维结构，和(2)允许治疗性肽存在于抗体的中心裂口而又不影响治疗性肽的治疗活性。例如，治疗性肽可如下整合：(a)添加至轻链多肽的恒定区羧基端，或(b)在轻链多肽恒定区最终的羧基端β折叠结构下游的位置上插入和/或置换氨基酸。在一些实施方案中，可将治疗性多肽整合到轻链多肽恒定区的β转角区，所述β转角在结构上位于允许整合的治疗性肽存在于抗体的中心裂口的位置上。

本领域普通技术人员应了解的是如何测定轻链多肽恒定区内哪个氨基酸或氨基酸序列可适于这类添加、插入或置换。例如，许多免费可获得的计算机程序可用来对抗体或其片段的三维结构建模，例如以鉴定治疗性肽可整合到其中的合适的轻链恒定区β转角区。合适的计算机程序包括例如C3nD和Rasmol，两者可分别以电子形式获自美国国家生物技术信息中心/国立卫生研究院和美国国家科学基金会(U.S.National Center for Biotechnology Information/National Institutesof Health and the U.S.National Science Foundation)。其它程序包括例如JMol、YASARA、Oscail、TINKER、MAGE、ArgusLab和SwissPDBViewer。

在一个实例中，技术人员可使用C3nD观察人抗破伤风类毒素Fab抗体片段的分子结构，参见Faber等(1998)Immunotechnology3(4)：253-270。(另参见MMDB Id No.6997)。技术人员可在片段内鉴定出轻链羧基端β转角序列：“EQWKSHK”(SEQ ID NO：13)作为整合治疗性肽的可能的合适部位。技术人员还可在片段内鉴定出轻链羧基端氨基酸序列：“PAECS”(SEQ ID NO：14)作为整合治疗性肽的可能的合适部位。在其它实例中，C3nD可用来观察与HIV-1 gp140内的表位结合的2F5抗体的人Fab片段分子结构。(参见MMDB Id No.65747)。因此，技术人员可按照与本公开内容治疗性肽的整合潜在地结构上的相容性，在片段内鉴定出轻链羧基端β转角序列：“SDEQLKS”(SEQ IDNO：15)和“ADYEKH”(SEQ ID NO：16)和/或轻链羧基端氨基酸序列：“GEC”。可使用例如Kabat等(1991)“Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学所关心的蛋白质序列)”，第1卷，第5版，美国卫生与公众服务部国立卫生研究院(U.S.Department of Healthand Human Services，National Institutes of Health)(NIH公布号91-3242)，鉴定其它抗体的结构上相似区域的氨基酸序列。

在这类实施方案中，可将治疗性肽插入轻链多肽的主题恒定区(例如恒定区的β转角区或最终的β折叠结构下游的区域)，和/或肽的整合可全部或部分置换轻链多肽的主题恒定区。本文使用的“部分轻链多肽恒定区”是指该区域的至少1个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或更多个)氨基酸。因此，在一些实施方案中，轻链多肽恒定区的至少5个氨基酸可被治疗性肽(例如TPO模拟肽)置换。要理解的是，置换不必是一对一，即原轻链恒定区的一个氨基酸被治疗性肽(例如TPO模拟肽)的一个氨基酸置换。例如，轻链恒定区的最后五(5)个氨基酸可以缺失，并被14个氨基酸的TPO模拟肽(例如具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的TPO模拟肽)置换，从而导致轻链羧基端区域的部分置换，并在轻链末端有效添加9个氨基酸。在另一个实例中，轻链多肽恒定区β转角区的五(5)个氨基酸可被14个氨基酸的TPO模拟肽(例如具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的TPO模拟肽)置换，从而导致β转角区部分置换，并有效插入9个氨基酸。

在其中治疗性肽(例如TPO模拟肽)整合到铰链区本身的实施方案中，治疗性肽可为插入物和/或全部或部分铰链区可被治疗性肽置换。本文使用的“部分铰链区”是指抗体铰链区的至少1个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多)氨基酸。因此，在一些实施方案中，铰链区的至少5个氨基酸可被治疗性肽(例如TPO模拟肽)置换。部分铰链区可包括重链多肽铰链区的氨基端或羧基端上的氨基酸，或者该部分可包括铰链区内部的氨基酸。要理解的是，置换不必一对一，即原铰链区的一个氨基酸被治疗性肽(例如TPO模拟肽)的一个氨基酸置换。例如，铰链区氨基端的五(5)个氨基酸可缺失，并被14个氨基酸的TPO模拟肽(参见例如SEQ ID NO：1)置换，从而导致铰链的部分置换，并在重链恒定区1(CH1)和部分铰链之间有效插入9个氨基酸。然而，在一些实施方案中，例如，铰链区的14个氨基酸可被治疗性肽(例如具有SEQ ID NO：1或2所述氨基酸序列的TPO模拟肽)等量的14个氨基酸置换。在一些实施方案中，完整铰链区被治疗性肽置换。在其中部分或全部铰链区被治疗性肽置换的实施方案中，可能是有益的是，包括位于肽的氨基端和羧基端中的一个或两个的侧翼的间隔基氨基酸序列(见下文)。

因此，在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)可含有两(2)个各自含有至少一个治疗性肽的轻链多肽和不含治疗性肽的两个重链多肽。在一些实施方案中，本文描述的治疗性抗体可含有各自含有至少一个治疗性肽(例如TPO模拟肽)的2个重链多肽和不含治疗性肽的2个轻链多肽。在又一个实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)可含有2条重链和2条轻链，其中重链和轻链多肽的每一个含有至少一个本公开内容的治疗性肽(例如TPO模拟肽)。

在一些实施方案中，各轻链多肽和重链多肽中的治疗性肽可以是相同的治疗性肽。例如，各轻链多肽和重链多肽可具有相同的TPO模拟肽(例如具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的TPO模拟肽)。在一些实施方案中，轻链多肽的治疗性肽可不同于重链多肽中的治疗性肽。例如，抗体可包括2个轻链多肽和2个重链多肽，每个轻链多肽含有第一种TPO模拟肽(例如具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列)，每个重链多肽含有第二种TPO模拟肽(例如具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列)。

在一些实施方案中，治疗性抗体可以是双重治疗性的，因为治疗性抗体的一“臂”(例如Fab区)含有一种类型的本公开内容的治疗性肽(例如TPO模拟肽)，而治疗性抗体的第二“臂”(例如第二Fab区)含有不同类型的本公开内容的治疗性肽(例如EPO模拟肽)(见下文)。

要了解的是，治疗性抗体可含有多于2个(例如多于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或15个或更多个)治疗性肽，只要按照本公开内容将至少一个治疗性肽整合到重链或轻链中即可。在其中治疗性抗体含有多于2个治疗性肽的一些实施方案中，按照本公开内容将至少一个治疗性肽整合到轻链中，且按照本公开内容将至少一个治疗性肽整合到重链中。

抗体重链内铰链区的位置和氨基酸序列为本领域技术人员所熟知。示例性的铰链区氨基酸序列如PCT公布号WO07/048022的图28中所述，其公开内容(特别是图28)通过引用以其整体结合到本文中。

在一些实施方案中，治疗性抗体的至少一个(例如2、3、4个或全部)治疗性肽包括具有IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO：1)或IEGPTLRQWLAARAP(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的TPO模拟肽，或者由该TPO模拟肽组成。在一些实施方案中，治疗性抗体的至少一个(例如2、3、4个或全部)治疗性肽包括具有美国专利申请公布号20030049683图5中描述的氨基酸序列的TPO模拟肽，或者由该TPO模拟肽组成，其公开内容(特别是图5)通过引用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，治疗性抗体的至少一个(例如2、3、4个或全部)治疗性肽包括具有美国专利号6,083,913表1或表2中所述的氨基酸序列的TPO模拟肽，或者由该TPO模拟肽组成，其公开内容(特别是表1和表2)通过引用以其整体结合到本文中。

可包括在本文描述的治疗性抗体中的其它治疗性肽包括例如其它模拟肽，例如但不限于EPO模拟肽。例如，合适的EPO模拟肽包括例如DYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO：3)或例如美国专利号5,835,382和5,830,851中描述的任何EPO模拟物。其它实例包括与由配体诱导的同二聚化激活的受体结合的肽，包括具有G-CSF活性、GHR活性和催乳素活性的活性片段，参见Whitty和Borysenko(1999)Chem Biol.4：R107-18。合适肽的其它实例包括得自CD环的神经生长因子模拟物，参见Zaccaro等(2000)Med.Chem.43(19)：3530-40；IL-2模拟物，参见Eckenberg等(2000)J.Immunol.165(8)：4312-8；胰高血糖素样肽-1，参见Evans等(1999)Drugs R.D.2(2)：75-94；能够促进细胞凋亡并参与例如T细胞稳态、免疫特权(immune privilege)和母体耐受(maternal tolerance)的FasL肽(参见例如Sheikh等(2000)Leukemia14(8)：1509-1513)；胰岛素c-肽；胰岛素β-链；以及刺激促分裂原活化B细胞增殖的四肽I(D-赖氨酸-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-酪氨酸)，参见Gagnon等(2000)Vaccine 18(18)：1886-92。治疗性肽(例如模拟肽)对于其关联配体或受体可具有激动剂或拮抗剂活性。例如，用于本文描述的治疗性抗体的具有受体拮抗活性的肽可包括例如vMIP-II的氨基端肽作为CXCR4的拮抗剂用于治疗HIV，参见Luo等(2000)Biochemistry 39(44)：13545-50；用于抗血栓疗法的凝血酶受体的拮抗剂肽配体“AFLARAA”(SEQ ID NO：4)，参见Pakala等(2000)Thromb.Res.100(1)：89-96；用于减小对麻醉品的耐受性的肽CGRP受体拮抗剂CGRP(8-37)，参见Powell等(2000)Br.J.Pharmacol 131(5)：875-84；甲状旁腺激素(PTH)-1受体拮抗剂，参见Hoare等(2000)Pharmacol.Exp.Ther.295(2)：761-70；用于治疗冠状动脉血栓形成、哮喘、炎性肠病和/或癌症的整联蛋白特异性肽模拟物拮抗剂，参见例如PCT公布号WO97/36858、Tcheng等(1995)Circulation 91：2151和Bovy等(1994)Bioorg.Med Chem 2：881；阿片样物质生长因子，参见Zagon等(2000)Int.J.Oncol.17(5)：1053-61；高亲和力I型白介素1受体拮抗剂，参见Yanofsky等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7381-7386和Vigers等(2000)J.Biol.Chem.275(47)：36927-36933；酸性成纤维细胞生长因子结合肽，参见Fan等(2000)IUBMBL Life 49(6)：545-48；以及可用于治疗受试者的血管生成的模拟肽，参见例如Mazitschek等(2002)Mini RevMed Chem 2(5)：491-506。

用于鉴定其它治疗性肽(例如肽模拟物(peptidomimetics))的方法是本领域已知的。例如，为了鉴定参与特定生物学功能的蛋白质区域，研究构成该蛋白质的较短的肽片段可揭示履行责任的线性肽表位。或者，通过研究随机肽的文库，可以发现模拟天然蛋白质的活性的表示最佳线性表位或不连续表位的肽。一种选择方法称为肽噬菌体展示。在这种方法中，产生随机肽表位文库，使得肽存在于噬菌体颗粒的表面。然后，可研究肽的这些集合体或文库中能够与特定的固定化靶蛋白结合的肽。参见例如Kieber-Emmons等(1997)Curr Opin Biotechnol8(4)：435-441；Gentilucci等(2006)Curr Med Chem 13(20)：2449-2466；Pasqualini等(1995)J.Cell Biol.130：1189-1196；Wrighton等(1996)Science 273：458-463；Cwirla等(1997)Science 276：1696-1699；Koivunen等(1993)J.Biol Chem.268：20205-20210；Koivunen等(1995)Bio/Technol.13：265-270；Healy等(1995)Biochem.34：3948-3955；Pasqualini等(1995)J.Cell Biol.130：1189-1196。备选的肽选择系统也是可行的，包括细胞表面展示和核糖体展示。

本文使用的“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指任何氨基酸的肽键链，不论长度或翻译后修饰。

在一些实施方案中，治疗性肽(例如TPO模拟肽)可在羧基端和氨基端的一个或两个上侧接间隔基氨基酸序列(或间隔基序列)。可使用间隔基序列例如降低对模拟物的结构约束、允许模拟物更容易地采取生物活性构象和/或使肽更有效地存在于抗体支架的环境下。在一些实施方案中，间隔基序列可包括而不限于一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个或更多个)氨基酸。间隔基序列可包括例如一个或多个脯氨酸或甘氨酸残基。在一些实施方案中，间隔基氨基酸序列可以是或者可含有氨基酸ARSL(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，间隔基氨基酸序列可包括或者可以是“PI”(SEQ ID NO：6)、“NP”(SEQ ID NO：7)或“LVG”(SEQ IDNO：8)。在一些实施方案中，TPO模拟物可在氨基端具有“ARSL”间隔基序列，而在羧基端具有“LVG”间隔基序列。

任何抗体(或抗体片段)可用作治疗性肽(例如TPO模拟肽)植入其中的支架序列。然而，如果抗体或其片段用于人时，抗体优选为人抗体或人源化抗体。用作支架的一种合适的抗体是人抗破伤风类毒素(TT)抗体或其片段(例如Fab片段)。参见例如Barbas等(1994)J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162和Barbas等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：2529-2533。用作本公开内容的支架的其它合适的抗体包括例如工作实施例中给出的抗炭疽抗体(例如抗炭疽PA83或抗炭疽PA63抗原抗体)。

在一些实施方案中，可以足以改变或者部分或完全消除抗体的抗原结合特异性的方式，对支架抗体的一个或多个互补决定区(CDR)进行修饰(例如取代、缺失或翻译后修饰)。用于修饰抗体的CDR的方法是分子生物学领域众所周知的，并可参见例如Sambrook等(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验指南)，第2版”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等(1992)“Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，”Greene Publishing Associates。此外，测定抗体是否与蛋白质抗原结合和/或抗体对蛋白质抗原的亲和力(或丧失亲和力)的方法是本领域已知的。例如，可采用各种技术检测和/或定量测定抗体与蛋白质抗原的结合，例如但不限于蛋白质印迹法、点渍法、等离子表面共振法(例如BIAcore系统；Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，N.J.)或酶联免疫吸附测定(ELISA)法。参见例如Harlow和Lane(1988)“Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验指南)”ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Benny K.C.Lo(2004)“Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体工程：方法与方案)，”Humana Press(ISBN：1588290921)；Borrebaek(1992)“Antibody Engineering，A Practical Guide(抗体工程实用指导)，”W.H.Freeman和Co.，NY；Borrebaek(1995)“Antibody Engineering(抗体工程)”，第2版，Oxford University Press，NY，Oxford；Johne等(1993)J.Immunol.Meth.160：191-198；Jonsson等(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；以及Jonsson等(1991)Biotechniques 11：620-627。另参见美国专利号6,355,245。这类技术还可用于测定在治疗性抗体背景下治疗性肽(例如TPO模拟肽)是否保持与其关联靶标(例如细胞表面受体，例如c-Mpl)结合的能力。例如，工作实施例中给出了测定TPO模拟抗体对c-Mpl的亲和力的合适方法。

在一些实施方案中，可对治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的一个或多个Fc恒定区(例如CH2、CH3或CH4)进行修饰以部分或全部消除其与在宿主细胞上表达的Fc受体结合的能力。修饰包括例如一个或多个Fc恒定区的诱变以及翻译后修饰。在一些实施方案中，可对治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)进行修饰，使得该抗体结合Fc受体的能力小于未修饰治疗性抗体结合Fc受体的能力的50％(例如小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或小于0.01％)。测定抗体是否与Fc受体结合的方法是本领域已知的，可参见例如Lund等(1991)JImmunol.147(8)：2657-62。

在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的至少一部分可包括由SEQ ID NO：9所述核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的至少一部分可包括由SEQ ID NO：11所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)可含有由SEQ ID NO：9所述核苷酸序列编码的轻链氨基酸序列和由SEQ ID NO：11所述核苷酸序列编码的重链氨基酸序列，或者由该轻链氨基酸序列和该重链氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的至少一部分可包括具有下列氨基酸序列的轻链多肽：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGVRNALVWYQQKPGKAP

ERLIYAASILOSGVPSRFSGSGSGTEFTLTIGG1OPEDFATYYCLQH

NSYPWTFGQGTKVEIKR

PI

(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的至少一部分可包括具有下列氨基酸序列的重链多肽：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYAMHWVRQAPGQ

RPEWMGWINGGDGKTKYAQKFQGRLAITRDTSARTAYMELISLTS

EDTAVYYCAKGAEMTVGSWGPGTLVTVSS

(SEQ IDNO：12)。(上文：抗体可变区序列用下划线表示；各个多肽中的TPO模拟肽氨基酸序列用粗体字表示；抗体恒定区氨基酸序列用斜体字表示。未加强显示的氨基酸序列相当于间隔基序列)。

本公开内容全文中使用的术语“治疗性抗体”和“TPO模拟抗体”是指含有至少两个(例如至少2、3或4个)本公开内容的治疗性肽(例如TPO模拟肽)的整个或完整抗体(例如IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)分子。治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)还包括完整抗体，其具有至少两个治疗性肽和杂合恒定区或其部分，例如G2/G4杂合恒定区(参见例如Burton等(1992)Adv.Immun.51：1-18；Canfield等(1991)J.Exp.Med.173：1483-1491；以及Mueller等(1997)Mol.Immunol.34(6)：441-452)。例如(并按照Kabat编号)，IgG1和IgG4恒定区含有G₂₄₉G₂₅₀残基，而IgG2恒定区不含残基249，但却含有G₂₅₀。在其中249-250区域源自G2序列的G2/G4杂合恒定区中，可对该恒定区进行进一步修饰以便在249位引入甘氨酸残基，产生具有G₂₄₉/G₂₅₀的G2/G4融合物。含有G₂₄₉/G₂₅₀的其它恒定结构域杂合体还可用作本公开内容的TPO模拟抗体的支架。

术语“抗体”包括例如嵌合化抗体或嵌合抗体、人源化抗体、去免疫化人抗体和完全人抗体。抗体支架可以在各种物种的任一种中制备或可来源于各种物种的任一种，例如哺乳动物，例如人、非人类灵长类动物(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。

本文使用的术语“治疗活性抗体片段”，或者在某些情况下“抗体片段”或“治疗活性片段”是指以下治疗性抗体片段(例如TPO模拟抗体的片段)：其(i)在结构上保持至少两个(例如至少2、3或4个；见上)治疗性肽(例如TPO模拟肽)存在于本公开内容的完整治疗性抗体上；和(ii)功能上保持至少10％(例如至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％或更多)的完整治疗性抗体的治疗活性。例如，本文描述的TPO模拟抗体的治疗活性片段，可保持至少10％的完整TPO模拟抗体的TPO样活性(见下文的“用于产生治疗性抗体或其治疗活性片段的方法”)。在另一个实例中，含有红细胞生成素(EPO)模拟肽的抗体的治疗活性片段可保持至少10％的完整“EPO模拟抗体”的EPO样活性。治疗性抗体的治疗活性片段包括例如单链抗体、单链Fv片段(scFv)、Fd片段、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)₂片段。scFv片段是包括scFv从其中衍生的抗体的重链和轻链可变区两者的单一多肽链。另外，可以制备与至少部分重链和/或轻链恒定区融合且含有至少两个本公开内容的治疗性肽的微型抗体(minibodies)、三链抗体和双链抗体(参见例如Todorovska等(2001)J Immunol Methods 248(1)：47-66；Hudson和Kortt(1999)J Immunol Methods 231(1)：177-189；以及Poljak(1994)Structure2(12)：1121-1123，所述每份文献的公开内容通过引用以其整体结合到本文中)，并将其用于本文所述方法中。

在一些实施方案中，双特异性抗体(或其片段例如F(ab’)₂)可用作引入至少两个本公开内容的治疗性肽的支架。在一些实施方案中，保持了双特异性抗体的至少一个(或两个)抗原结合部位的抗原结合能力。例如，可将两个或更多个治疗性肽整合到本公开内容的双特异性抗体的一个臂(例如Fab区)上，但不整合到双特异性抗体的第二臂(例如第二Fab区)上。在另一个实例中，治疗性肽可整合到双特异性抗体的两个臂(例如两个Fab区)上，其中抗体臂的至少一个(或两个)的抗原结合能力不受治疗性肽的整合的影响。例如，可以使用这种治疗性双特异性抗体(其全部包括在术语“治疗性抗体”中)，以使治疗性抗体的治疗性肽靶定特定靶细胞。例如，如果治疗性双特异性抗体含有TPO模拟肽，则治疗性双特异性抗体的至少一个抗原结合部位可与巨核细胞上的蛋白质标志物结合。合适的巨核细胞蛋白质标志物包括例如CD41(Ilb/IIIa)和CD42(lb)。

用于产生治疗性抗体或其治疗活性片段的方法

可采用分子生物学和蛋白质化学领域已知的各种技术制备治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段。例如，可采用重组DNA技术，例如但不限于PCR重叠、限制性内切酶位点克隆、位点特异性诱变和完全合成法，将编码治疗性肽(例如TPO模拟肽)的DNA序列植入编码抗体的DNA序列中，从而用所述肽序列置换抗体的铰链区。位点特异性诱变可按若干方法实现。一种以dut/ung Kunkel诱变(Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92)为基础。若干基于PCR扩增的诱变方法也是市售的，例如QuickChange位点定向诱变试剂盒和ExSite^TM PCR型位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)。另一种非PCR方法是GeneEditor^TM体外位点定向诱变系统(Promega Corporation，Madison，Wisconsin)。完全合成法也是众所周知的，可参见例如Deng等(1995)Methods Mol.Biol.51：329-42；Kutemeler等(1994)Biotechniques 17(2)：242-246；Shi等(1993)PCRMethods Appl.3(1)：46-53；以及Knuppik等(2000)J.Mol.Biol.296(1)：571-86。

还可应用标准分子生物学技术引入位于治疗性肽(例如TPO模拟肽)的羧基端和/或氨基端侧翼的间隔基氨基酸序列。如上所述，这种侧翼序列可用于例如降低对治疗性肽的结构约束，并允许肽更易于采取生物活性所必需的构象。

在一些实施方案中，侧翼区可包括例如一个或多个脯氨酸残基。参见例如Kini和Evans(1995)Biochem Biophys Res Commun212(3)：115-24和Kini等(1995)FEBS Letters 375：15-17。在一些实施方案中，将一个或多个脯氨酸残基添加至治疗性肽(例如TPO模拟肽)的羧基端。

在一些实施方案中，间隔基氨基酸序列可包括例如任何SEQ IDNOs：5-8中的一个或多个。

可将核酸插入含有转录和翻译调节序列的表达载体中，所述转录和翻译调节序列包括例如启动子序列、核糖体结合部位、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列、转录终止子信号、聚腺苷酸化信号和增强子或激活因子(activator)序列。调节序列包括启动子及转录起始序列和终止序列。另外，表达载体可包括不止一个复制系统，从而可保持在两种不同的生物中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中用于表达，在原核宿主中用于克隆和扩增。

可得到若干可行的载体系统用于在哺乳动物细胞中自核酸表达克隆的重链和轻链多肽。载体的一个类别依赖于所需基因序列整合到宿主细胞基因组中。可通过同时引入抗药基因例如大肠杆菌gpt(Mulligan和Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)或Tn5 neo(Southern和Berg(1982)Mol.Appl.Genet.1：327)，来选择具有稳定整合的DNA的细胞。可将选择标记基因与待表达的DNA基因序列连接，或者通过共转染导入相同细胞中(Wigler等(1979)Cell 16：77)。载体的第二个类别利用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可来源于动物病毒，例如牛乳头瘤病毒(Sarver等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7147)、多瘤病毒(Deans等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1292)或SV40病毒(Lusky和Botchan(1981)Nature293：79)。

可以适于随后的核酸表达的方式，将表达载体导入细胞中。导入方法大部分由下述靶定的细胞类型规定。示例性方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、lipofectin、电穿孔、病毒感染、葡聚糖介导的转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、原生质体融合和直接显微注射。

用于表达治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的合适宿主细胞包括酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。特别关注的是细菌，例如大肠杆菌；真菌，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞，例如SF9；哺乳动物细胞系(例如人细胞系)以及原代细胞系。

在一些实施方案中，治疗性抗体可在转基因动物(例如转基因哺乳动物)中表达和纯化。例如，治疗性抗体可在转基因非人类哺乳动物(例如啮齿动物)中产生，并且从乳汁中分离，参见例如Houdebine(2002)Curr Opin Biotechnol 13(6)：625-629；van Kuik-Romeijn等(2000)Transgenic Res 9(2)：155-159；以及Pollock等(1999)J Immunol Methods231(1-2)：147-157。

通过在以下条件下和持续以下时间量，培养用含有编码治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段的核酸的表达载体转化的宿主细胞，从该细胞中产生所述抗体和片段，所述条件和时间量足以允许蛋白质表达。用于蛋白质表达的这类条件随表达载体和宿主细胞的选择而变化，且本领域技术人员通过常规实验法容易确定。例如，在大肠杆菌中表达的治疗性抗体可从包含体中再折叠(参见例如Hou等(1998)Cytokine 10：319-30)。细菌表达系统及其应用方法是本领域众所周知的(参见Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，Wiley&Sons；以及Molecular Cloning--A Laboratory Manual--3rd Ed.(分子克隆实验室指南第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001))。密码子、合适的表达载体和合适的宿主细胞的选择取决于许多因素而变化，并且可根据需要容易地使之最优化。治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段可在哺乳动物细胞或其它表达系统中表达，包括但不限于酵母、杆状病毒和体外表达系统(参见例如Kaszubska等(2000)Protein Expression and Purification 18：213-220)。

在表达后，可以分离治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段。应用于本文描述的任何蛋白质(例如TPO模拟抗体蛋白质或其片段)的术语“纯化的”或“分离的”是指从天然与之相伴(例如表达蛋白质的原核生物中的其它蛋白质、脂质和核酸)的组分(例如蛋白质或其它天然存在的生物分子或有机分子)中分离或纯化的多肽。通常，当多肽构成样品中总蛋白质重量的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％或99％)时，该多肽是纯的。

可以本领域技术人员已知的各种方法，分离或纯化治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段，这取决于样品中存在哪些其它组分。标准纯化方法包括电泳技术、分子技术、免疫技术和层析技术，包括离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法和反相HPLC层析法。例如，可采用标准抗抗体柱(例如A蛋白柱或G蛋白柱)纯化TPO模拟抗体。还可使用与蛋白质浓缩联合的超滤和渗滤技术。参见例如Scopes(1994)“Protein Purification，3^rd edition(蛋白质纯化第三版)，”Springer-Verlag，New York City，New York。所需的纯化程度将随所需要的应用而变化。在某些情况下，可能需要未纯化的表达的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或片段。

测定纯化的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段的产量或纯度的方法是本领域已知的，包括例如Bradford测定法、紫外光谱法、双缩脲蛋白质测定法、Lowry蛋白质测定法、胺黑蛋白质测定法、高压液相层析法(HPLC)、质谱法(MS)和凝胶电泳法(例如采用蛋白质染色，例如考马斯蓝或胶体银染色)。

在一些实施方案中，可从治疗性抗体或片段中除去内毒素。从蛋白质样品中除去内毒素的方法是本领域已知的，并在工作实施例中举例说明。例如，可采用各种市售试剂，包括而不限于ProteoSpin^TM内毒素去除试剂盒(Norgen Biotek Corporation)、Detoxi-Gel内毒素去除凝胶(Thermo Scientific；Pierce Protein Research Products)、MiraCLEAN内毒素去除试剂盒(Mirus)或Acrodisc^TM-Mustang

E膜(PallCorporation)从蛋白质样品中除去内毒素。

用于检测和/或测定样品中存在的内毒素的量的方法(纯化之前和之后)是本领域已知的，并且可获得市售试剂盒。例如，可采用QCL-1000显色试剂盒(BioWhittaker)、基于鲎变形细胞溶解物(LAL)的试剂盒例如可得自Associates of Cape Cod Incorporated的Pyrotell

Pyrotell

-T、Pyrochrome

Chromo-LAL和CSE试剂盒，测定蛋白质样品中内毒素的浓度。

工作实施例中还给出了用于产生和纯化治疗性抗体的合适方法。

治疗性抗体和片段的修饰

可在治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段表达和纯化后对其进行修饰。修饰可以是共价修饰或非共价修饰。可通过例如使多肽的靶定氨基酸残基与能够与所选的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，将这类修饰引入抗体或片段内。可采用多种标准的任一种(包括例如治疗性抗体或片段蛋白质的结构分析或氨基酸序列分析)选择用于修饰的合适部位。

在一些实施方案中，可使治疗性抗体或其治疗活性片段与异源部分缀合。异源部分可为例如异源多肽、治疗剂(例如毒素或药物)或可检测标记，例如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记或发光标记。合适的异源多肽包括例如用于纯化治疗性抗体或片段的抗原标签(例如FLAG、聚组氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源多肽还包括用作诊断标记或检测标记的多肽，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。合适的放射性标记包括例如³²P、³³P、¹⁴C、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和³H。合适的荧光标记包括而不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、GFP、DyLight 488、藻红蛋白(PE)、碘化丙锭(PI)、PerCP、PE-Alexa Fluor

700、Cy5、别藻蓝蛋白和Cy7。发光标记包括例如各种发光镧系元素(例如铕或铽)螯合物的任一种。例如，合适的铕螯合物包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、CAT、萤光素酶和辣根过氧化物酶。

可使用许多已知化学交联剂的任一种使两种蛋白质(例如TPO模拟抗体和异源氨基酸序列)交联。这类交联剂的实例为通过包括“受阻的”二硫键在内的键连接两个氨基酸残基的交联剂。在这些键中，交联单元内的二硫键受保护(通过二硫键任一侧的阻碍基团)不被例如还原型谷胱甘肽或二硫化物还原酶作用的还原。一种合适的试剂，4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基联硫基)甲苯(SMPT)，在两种蛋白质之间利用一种蛋白质的末端赖氨酸和另一种蛋白质的末端半胱氨酸形成这类键。还可使用通过各种蛋白质上的不同偶联部分交联的异双官能试剂。其它有用的交联剂包括而不限于连接以下基团的试剂：两个氨基(例如N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、两个巯基(例如1，4-双-马来酰亚胺丁烷)、氨基与巯基(例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、氨基与羧基(例如4-[对叠氮基水杨基酰氨基]丁胺)和氨基与存在于精氨酸侧链的胍基(例如对叠氮基苯基乙二醛一水合物)。

放射性标记可与蛋白质的氨基酸主链直接缀合。或者，还可包括放射性标记作为较大分子的部分(例如间-[¹²⁵I]碘苯基-N-羟基琥珀酰亚胺([¹²⁵I]mIPNHS)中的¹²⁵I，其与游离氨基结合形成相关蛋白质的间碘苯基(mIP)衍生物(参见例如Rogers等(1997)J.Nucl.Med.38：1221-1229)或螯合物(例如与DOTA或DTPA)，其继而与蛋白质主链结合。使放射性标记或含有放射性标记的较大分子/螯合物与治疗性抗体或其治疗活性片段缀合的方法是本领域已知的。这类方法包括在有利于放射性标记或螯合物与蛋白质结合的条件下(例如pH、盐浓度和/或温度)，将蛋白质与放射性标记一起温育(参见例如美国专利号6,001,329)。

使荧光标记(有时称为“荧光团”)与蛋白质(例如治疗性抗体或其治疗活性片段)缀合的方法是蛋白质化学领域已知的。例如，可使用与荧光团连接的琥珀酰亚胺基(NHS)酯或TFP酯部分，使荧光团与蛋白质的游离氨基(例如赖氨酸的游离氨基)或巯基(例如半胱氨酸的巯基)缀合。在一些实施方案中，可使荧光团与异双官能交联剂部分例如磺基-SMCC缀合。合适的缀合方法包括在有利于荧光团与蛋白质结合的条件下，使治疗性抗体蛋白质或其片段与荧光团一起温育。参见例如Welch和Redvanly(2003)“Handbook of Radiopharmaceuticals：Radiochemistry and Applications(放射性药品手册：放射化学与应用)，”John Wiley and Sons(ISBN 0471495603)。

如上所述，本文描述的治疗性抗体或其治疗活性片段对包含在其中的治疗性肽提供延长的血清半寿期。然而，在一些实施方案中，可用例如促进抗体本身在循环(例如血液、血清或其它组织)中稳定和/或保留的部分，对抗体或片段进行修饰。例如，可如下所述对抗体或片段进行聚乙二醇化：例如Lee等(1999)Bioconjug.Chem10(6)：973-8；Kinstler等(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews 54：477-485；以及Roberts等(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54：459-476。稳定部分可将抗体(或片段)的稳定性或保留提高至至少1.5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40或50倍或更多倍)。稳定部分还可将治疗性肽(与游离形式治疗性肽相比)的稳定性或保留提高至至少1.5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40或50倍或更多倍)。

测定治疗性抗体或片段的生物活性

可应用各种体外和体内生物测定法测定本文描述的治疗性抗体或抗体的治疗活性片段的生物活性。所述方法可随抗体中所包含的特定治疗性肽的活性而改变。例如，可采用例如集落形成测定法、增殖测定法、磷酸化测定法和/或基于转录的测定法，来测定所述TPO模拟抗体、片段或缀合物的血小板生成素样活性。集落形成测定法测定由从受试者中获得的骨髓样品中形成的巨核细胞集落(参见例如MegacultC试剂盒，得自Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver BC，Canada)。可采用增殖测定法测定与缺乏TPO模拟抗体、片段或缀合物时相比，TPO模拟抗体、片段或缀合物存在时表达c-Mpl受体的Ba/F3细胞的增殖。参见例如Cwirla等(1997)Science 276：1696-1699和de Sauvage等(1994)Nature 369：533。与缺乏TPO模拟抗体(或片段)时的细胞增殖量相比，与TPO模拟抗体(或片段)接触的细胞增殖的增加表示TPO模拟抗体(或片段)具有TPO样生物活性。可通过测定JAK2或Stat3或Stat5的磷酸化，来测定c-Mpl受体的活化，作为对TPO模拟抗体活性的衡量，参见例如Drachman等(1999)J.Biol.Chem.274：13480-13484和Miyakawa等(1996)Blood 87(2)：439-46。可采用美国专利申请公布号20030049683中描述的基于转录的测定法，测定TPO模拟抗体或其治疗活性片段的活性。例如，哺乳动物细胞可用编码全长c-Mpl受体和萤光素酶基因的核酸(其表达受c-Fos启动子的控制)转染。使细胞表达c-Mpl受体后，在以下条件下并持续以下时间，使细胞与TPO模拟抗体或其治疗活性片段接触，所述条件和时间允许抗体与受体结合。与未与抗体接触的细胞产生的萤光素酶的量相比，该细胞中产生的萤光素酶量的增加表示TPO模拟抗体具有TPO样活性。

另外，可采用本领域已知的各种体内技术，测定TPO模拟抗体或其治疗活性片段的TPO样活性。例如，可在给予TPO模拟抗体或其片段后，测定小鼠中产生的血小板水平。与未接受治疗的小鼠相比，受治疗小鼠产生的血小板的增加表示TPO模拟抗体或片段具有TPO样活性。工作实施例中举例说明了示例性体内测定法(例如测定动物中的血小板产生和/或研究TPO模拟抗体对暴露于辐射中的动物存活的影响)。

对于含有红细胞生成素(EPO)模拟肽的治疗性抗体(或片段)，可采用以下测定法测定抗体或片段的EPO样活性：骨髓类红细胞集落形成测定法(参见例如Wrighton等(1996)Science 273：458-463)；人红白血病细胞增殖测定法(Kitamura等(1989)J.Cell Physiol.140：323-334)和/或磷酸化或转录活化测定法，参见例如Witthuhn等(1993)Cell74：227-236。例如，一种有用的体外测定法利用来源于急性成巨核细胞白血病患者的EPO依赖性UT-7/EPO细胞系(参见例如Komatsu等(1993)Blood 82(2)：456-464)。在撤除补充了rHuEPO的培养基后，UT-7/EPO细胞经历细胞凋亡。然而，如果用rHuEPO或EPO激动剂处理，则细胞得救。因此，可使含有EPO的治疗性抗体或其治疗活性片段与饥饿的UT-7/EPO细胞接触，并测定细胞的存活力。与缺乏治疗性抗体情况下的细胞存活率相比，与治疗性抗体接触的饥饿细胞存活率的提高表示治疗性抗体具有EPO样活性。

药物组合物

可将含有本文描述的治疗性抗体(例如TPO-模拟抗体)或其治疗活性片段的组合物配成药物组合物，用于例如给予受试者以增加血小板产生。药物组合物一般包括药学上可接受的载体。本文使用的“药学上可接受的载体”是指并包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如Berge等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。

可按照标准方法配制组合物。药物配制是充分确立的领域，可进一步参见例如Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Remington：制药科学与实践)，”第20版，Lippincott，Williams&Wilkins(ISBN：0683306472)；Ansel等(1999)“Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(药物剂型与递药系统)，”第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(ISBN：0683305727)；以及Kibbe(2000)“Handbook of Pharmaceutical Excipients AmericanPharmaceutical Association(美国制药协会药用赋形剂手册)，”第3版(ISBN：091733096X)。在一些实施方案中，可将组合物配成例如合适浓度并适于2-8℃(例如4℃)保存的缓冲溶液。在一些实施方案中，可配制用于保存在低于0℃(例如-20℃或-80℃)温度的组合物。在一些实施方案中，可配制在2-8℃(例如4℃)下保存长达2年(例如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、

年或2年)的组合物。因此，在一些实施方案中，本文描述的组合物在2-8℃(例如4℃)保存至少1年是稳定的。

药物组合物可以呈各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液剂(例如注射溶液剂和输注溶液剂(infusiblesolution))、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式部分取决于预定的给药方式和治疗应用。例如，欲全身或局部递送的含有抗体或片段的组合物可呈注射溶液剂或输注溶液剂的形式。因此，可制备通过胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)给药的组合物。本文使用的“胃肠外给药”、“胃肠外给予”和其它语法上的等同表述，是指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括而不限于静脉内、鼻内、眼内、经肺、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、大脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注(见下文)。

可将组合物制成溶液剂、微乳剂、分散剂、脂质体或适于以高浓度稳定保存的其它有序结构。可以所需要的量将本文所述抗体(或抗体的片段)与一种上文列举的成分或所述成分的组合(按需要)一起加入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌注射溶液剂。总的来讲，通过将本文所述抗体或片段加入含有基础分散介质和来自上文列举那里的所需其它成分的无菌溶媒中，来制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液剂的无菌粉末的情况下，制备方法包括将其前述过滤除菌溶液真空干燥和冷冻干燥，得到本文描述的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段加任何其它所需成分(见下文)的粉末。例如，可通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，来维持溶液的适当流动性。可通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如一硬脂酸盐和明胶)，使注射组合物的吸收延迟。

在某些实施方案中，可用保护化合物不快速释放的载体制备治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是本领域已知的。参见例如J.R.Robinson(1978)“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(缓释和控释递药系统)，”Marcel Dekker，Inc.，New York。

可将编码治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的核酸整合到基因构建体中，所述构建体将用作基因疗法方案的部分以递送可用来在细胞内表达和产生作用剂的核酸(见下文)。可在任何治疗有效的载体(例如体内能够将成分基因有效递送到细胞中的任何制剂或组合物)中给予这类组分的表达构建体。方法包括将主题基因插入包括重组反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒-1(HSV-1)在内的病毒载体或者重组细菌质粒或真核质粒。病毒载体可直接转染细胞；可借助例如阳离子脂质体(lipofectin)或衍生化(例如抗体缀合的)、聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其它这类胞内载体以及直接注射基因构建体或体内进行CaPO₄沉淀(参见例如WO04/060407)，来递送质粒DNA。(另参见下文的“离体方法”)。合适反转录病毒的实例包括本领域技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM(参见例如Eglitis等(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury等(1991)Science 254：1802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644；Kay等(1992)Human GeneTherapy 3：641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.150：4104-4115；美国专利号4,868,116和4,980,286；PCT公布号WO89/07136、WO89/02468、WO89/05345和WO92/07573)。另一种病毒基因递送系统利用腺病毒衍生载体(参见例如Berkner等(1988)Biotechniques 6：616；Rosenfeld等(1991)Science 252：431-434；以及Rosenfeld等(1992)Cell68：143-155)。自腺病毒毒株Ad型5dl324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)衍生的合适的腺病毒载体为本领域技术人员所知。可用于递送主题基因的又一种病毒载体系统为腺伴随病毒(AAV)。参见例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356；Samulski等(1989)J.Virol.63：3822-3828；以及McLaughlin等(1989)J.Virol62：1963-1973。

在一些实施方案中，TPO模拟抗体或其治疗活性片段可与可用于增加受试者的血小板产生的一种或多种其它活性剂一起配制。用于增加受试者的血小板产生的其它活性剂包括而不限于Promacta

/Revolade

(艾曲波帕；GlaxoSmithKline)、Nplate^TM(罗米司亭；Amgen，Inc.)和Neumega(奥普瑞白介素；rhIL-11，GeneticsInstitute，Inc.)。在一些实施方案中，TPO模拟抗体或其治疗活性片段可与可用于治疗贫血症或中性粒细胞减少症的一种或多种其它活性剂一起配制，所述活性剂包括例如，红细胞生成刺激剂(erythropoiesisstimulating agent，ESA)或Neulasta^TM(培非司亭；Amgen，Inc.)。ESA包括而不限于Procrit(阿法依泊汀；Ortho Biotech)、Epogen

(阿法依泊汀；Amgen，Inc.)和Aranesp

(达贝泊汀α；Amgen，Inc.)。

在一些实施方案中，TPO模拟抗体或其治疗活性片段可与可用于治疗辐射暴露症状的一种或多种其它作用剂一起配制。例如TPO模拟抗体或片段可与抗生素、麻醉剂、止吐药、类固醇(例如雄烯二醇例如4-雄烯二醇或5-雄烯二醇)、螯合剂和干细胞一起配制。合适的止吐药包括而不限于5-HT₃受体拮抗剂、多巴胺拮抗剂和大麻素。参见例如Donnerer J.(2003)“Antiemetic Therapy(止吐疗法)，”Karger Publishers(ISBN 3805575475)。具有螯合剂的制剂可用于其中待治疗的受试者是暴露于放射性核素例如铯-137或铊-201的受试者的实施方案。合适的螯合剂包括例如Ca-DTPA、Zn-DTPA、Radiogardase^TM(亦称“普鲁士蓝”)、去铁胺(deferoximine)和青霉胺(penicillamine)。在一些实施方案中，TPO模拟抗体或其片段可与放射性核素顶替剂(例如但不限于碘化钾或钙盐)一起配制。在一些实施方案中，TPO模拟抗体或其片段可与刺激放射性同位素从受试者中排泄的作用剂一起配制。例如，抗体或片段可与利尿药一起配制。

在一些实施方案中，例如，如果受试者中血小板计数降低由感染引起(例如感染相关性血栓性血小板减少性紫癜或DIC)，则抗体或其片段可与用于治疗感染(例如细菌感染或病毒例如HIV感染)的一种或多种作用剂一起配制。例如，抗体或片段可与抗生素或抗病毒药一起配制。抗生素根据感染类型而变化，但可包括例如青霉素、红霉素、克拉霉素或多西环素。同样，抗病毒药根据感染类型而变化。例如，可用于治疗HIV感染的抗病毒药包括例如HIV蛋白酶抑制剂、HIV整合酶抑制剂、HIV反转录酶抑制剂或抑制HIV结合和/或HIV进入细胞的抑制剂。

当治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段与第二活性剂联用时，作用剂可单独配制或一起配制。例如，可将各种药物组合物例如在临给药前混合、同时给予或者各种组合物可在例如同一时间或不同时间分开给予(见下文)。

如上所述，可以配制组合物使得它包含治疗有效量(例如增加血小板产生的量)的治疗性抗体或其治疗活性片段，或者可将组合物配制成包含亚治疗量的抗体和亚治疗量的一种或多种其它活性剂，使得总组分是治疗有效的(例如对于治疗辐射暴露的受试者或增加受试者的血小板产生是治疗有效的)。例如，组合物可包含亚治疗量的各TPO模拟抗体和艾曲波帕，使得两种药剂的总量对受试者而言是治疗有效的。测定治疗有效剂量的方法是本领域已知的并描述于本文。

治疗方法

根据特定的治疗性肽，上述组合物尤其可用于各种治疗方法。例如，TPO模拟抗体可用于增加有需要的受试者(例如人)的血小板产生的方法。可采用各种方法将组合物给予受试者，例如人受试者，这部分取决于给药途径。给药途径可为例如静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)或肌内注射。

可以通过例如局部输注、注射或通过植入物的方法给药。植入物可为多孔材料、无孔材料或胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜(sialasticmembrane)或纤维。可将植入物配成向受试者持续释放或定期释放组合物。(参见例如美国专利公布号20080241223；美国专利号5,501,856、4,863,457以及3,710,795、EP 488401和EP 430539，所述每份文献的公开内容通过引用以其整体结合到本文中)。可通过基于例如扩散、易蚀或对流系统的可植入装置将组合物递送给受试者，例如渗透泵、生物可降解植入物、电致扩散系统、电渗系统、蒸气压泵、电解泵、泡腾泵(effervescent pump)、压电泵、侵蚀型系统或机电系统。

治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的合适剂量(例如能够增加受试者的血小板产生的剂量)可取决于多种因素，包括例如待治疗的受试者的年龄、性别和体重以及所使用的具体治疗性抗体。例如，与治疗同一受试者所需要的TPO模拟抗体片段的剂量相比，可能需要不同剂量的TPO模拟抗体以增加受试者的血小板产生。影响给予受试者的TPO模拟抗体的剂量的其它因素包括例如受试者中血小板水平下降的原因或血小板计数降低的严重程度。例如，与患有辐射诱发性血小板减少症的受试者相比，患有特发性血小板减少性紫癜(ITP)的受试者可能需要给予不同剂量的TPO模拟抗体(或片段)。影响特定治疗性抗体(或片段)的剂量的其它因素可包括例如同时或之前累及受试者的其它医学病症、受试者的一般健康状况、受试者的遗传素因、饮食、给药时间、排泄率、药物组合和给予受试者的任何其它额外的治疗药。还应当理解的是，任何特定受试者的具体剂量和治疗方案将取决于治疗医学从业人员(例如医生或护士)的判断。

可按固定剂量或者以微克/千克(μg/kg)或毫克/千克(mg/kg)剂量给予治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或片段。在一些实施方案中，还可以选择剂量以进一步降低或避免针对组合物中的一种或多种活性剂产生抗体或其它宿主免疫应答。虽然绝无意限制，但是本文描述的抗体或其片段的示例性剂量包括例如1-100μg/kg、0.5-50μg/kg、0.1-100μg/kg、0.5-25μg/kg、1-20μg/kg和1-10μg/kg、1-100mg/kg、0.5-50mg/kg、0.1-100mg/kg、0.5-25mg/kg、1-20mg/kg和1-10mg/kg。治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)的示例性剂量包括而不限于0.1μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg、4μg/kg和8μg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4mg/kg和8mg/kg。

药物组合物可包含治疗有效量的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段。本领域普通技术人员部分根据所给予的抗体(或片段)的作用或者所述抗体和一种或多种其它活性剂(如果使用不止一种活性剂)的联合作用，可容易地确定这类有效量。治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段的治疗有效量还可随例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体(和一种或多种其它活性剂)在个体中引起所需反应的能力(例如受试者中血小板产生的增加)等因素而变化。例如，治疗有效量的TPO模拟抗体或其片段可增加个体的血小板产生，因此可例如在辐射暴露或化学治疗后抑制(减小血小板消耗的严重程度或消除血小板消耗的发生)和/或防止血小板消耗。治疗性抗体的治疗有效量也是其中组合物的治疗有益作用超过任何毒性作用或有害作用的有效量。

本文所用术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或类似术语意指引起所需要的生物应答或医学应答(例如增加受试者的血小板产生)的作用剂(例如本文描述的治疗性抗体或片段)的量。在一些实施方案中，本文描述的组合物含有治疗有效量的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段。在一些实施方案中，所述组合物含有治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其片段以及一种或多种(例如3、4、5、6、7、8、9、10或11种或更多种)其它治疗剂，使得作为整体的组合物是治疗上有效的。例如，所述组合物可含有TPO模拟抗体和艾曲波帕，其中抗体和小分子各自处于以下浓度，当该浓度组合时是治疗上有效的。

可通过细胞培养物或实验动物中的已知药学方法测定这类组合物的毒性和治疗功效。可采用这些方法例如测定LD₅₀(使50％群体致死的剂量)和ED₅₀(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀比。优选具有高的治疗指数的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的组合物。虽然可以使用具有毒副作用的组合物，但应小心设计将这类化合物靶向受累组织部位的递送系统以使对正常细胞的潜在损害降到最低，从而降低副作用。

适于测定本文描述的治疗性抗体或治疗活性片段的毒性和/或治疗功效的动物模型是本领域已知的。当然，这类模型部分将随包含在抗体或片段中的特定治疗性肽的生物活性而改变。例如，测定TPO模拟抗体或其治疗活性片段的治疗功效的合适动物模型(例如小鼠和非人类灵长类动物模型)是本领域已知的，参见例如，Thomas等(1996)Stem Cells 14：244；Winton等(1995)Experimental Hematology 23：486；Neelis等(1998)Blood 92(5)：1586-1597；以及Mouthon等(1999)Int JRadiat Oncol Biol Phys 43(4)：867-875。另外，工作实施例中举例说明了适于测定TPO模拟抗体的毒性和/或治疗功效的动物模型。

从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可用于配制用于人的各种剂量。用于评价组合物(例如包含在其中的TPO模拟抗体或片段)的合适动物模型是本领域已知的，以工作实施例为例予以说明。这类治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或片段的剂量一般在包括几乎没有毒性或无毒性的ED₅₀的抗体的循环浓度范围内。剂量可在该范围内改变，这取决于所使用的剂型和所采用的给药途径。对于按本文描述使用的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段(例如用于增加受试者的血小板产生)，可从细胞培养测定法开始估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中测定的IC₅₀(即达到症状最大抑制一半的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这类信息可用来更准确地确定人用剂量。可通过例如高效液相层析法测定血浆水平。可在例如I期剂量递增研究中进一步评价治疗性抗体的合适的人用剂量。参见例如van Gurp等(2008)Am J Transplantation8(8)：1711-1718；Hanouska等(2007)Clin cancer Res 13(2，第1 部)：523-531；以及Hetherington等(2006)Antimicrobial Agents andChemotherapy 50(10)：3499-3500。

如上所述，可部分根据受试者血液中的血小板计数，测定所需要的TPO模拟抗体或其治疗活性片段的剂量。例如，与血小板计数较高的受试者相比，血小板计数较低的受试者可能需要较高剂量的TPO模拟抗体。

本文描述的包括TPO模拟抗体或其治疗活性片段的使用的任何方法可包括在给予含有TPO模拟抗体或其片段的组合物后监测血小板计数。如果组合物与化学治疗方案或放射治疗方案联合给予，则可在暴露至化学治疗方案或放射治疗方案之前、期间和/或之后进行监测。

在受试者的血液衍生样品中测定血小板计数的方法是医学领域众所周知的，可参见例如Sallah等(1998)Postgraduate Medicine103：209-210；Kottke-Marchant(1994)Hematol Oncol Clin North Am.8：809-853；Redei等(1995)J Crit Illn 10：133-137；Butkiewicz等(2006)Thrombosis Research 118(2)：199-204；Tomita等(2000)Am J Hematol63(3)：131-135；以及Schrezenmeier等(1998)Br J Haematol100(3)：571-576。

要了解的是，医学从业人员可根据受试者血小板水平的实时监测，选择改变组合物的剂量、剂量频率或给药途径。

本文使用的“受试者”可以是任何哺乳动物。例如受试者可以是人、非人类灵长类动物(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，受试者是婴幼儿(例如人婴幼儿)。

本文使用的“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指根据合格医学从业人员(例如在人的情况下为医生、护士或执业护士；在非人类哺乳动物的情况下为兽医)的判断，可合理地获益于既定治疗(例如用例如TPO模拟抗体等治疗性抗体的治疗)的受试者。例如，患有血小板水平不足相关病症(血小板减少症相关疾病)的受试者可以是需要用本文描述的TPO模拟抗体或其片段治疗的受试者。

因此，可将TPO模拟抗体或其治疗活性片段给予患有血小板计数不足(血小板减少症)相关病症的受试者。这类病症是医学领域众所周知的，包括而不限于伯-索综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、威-奥综合征、脾功能亢进、血栓性微血管病、弥散性血管内凝血(DIC)、再生障碍性贫血、溶血性尿毒症综合征(HUS；典型或非典型的)、灾难性抗磷脂综合征(CAPS)、新生儿同种免疫性特发性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、阵发性夜间血红蛋白尿、尿毒症、冯维勒布兰德病、变型冯维勒布兰德病、格兰兹曼血小板机能不全、TTP、狼疮和维生素缺乏。所述病症还包括辐射诱发性血小板减少症(见下文)和药物诱发性血小板减少症(DIT；亦称“药物诱导性血小板机能不全”)，例如但不限于由以下药物引起的血小板减少症：肝素、金鸡纳属生物碱衍生物(奎宁和奎尼丁)、青霉素、磺胺类药、非甾体抗炎药(NSAID)、抗惊厥药、抗风湿药和口服抗糖尿病药、金盐、利尿药、利福平、干扰素γ、ribovarin和雷尼替丁。参见例如Chong等(1991)Blood 77：2190-2199；Curtis等(1994)Blood 84：176-183；Gentilini等(1998)Blood92：2359-2365；Burgess等(2000)Blood 95：1988-1992；van de Bemt等(2004)Drug Saf.27：1243-1252；Aster和Bougie(2007)New Eng J Med357(6)：580-587；George等(1998)Ann Intern Med 129(11)：886-890；以及Li等(2007)Drug Saf.30(2)：185-186，所述各文献的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。治疗以下各种病况可能引起DIT：例如但不限于肿瘤、骨髓增生异常综合征和某些病毒感染，例如HIV和肝炎感染。例如，下面还详细说明了与化学治疗方案有关的DIT。

也可将TPO模拟抗体或其片段与化学治疗方案或放射治疗方案联合给予患者。由于化学治疗或放射治疗的骨髓抑制作用所致，进行这些治疗的患者可因出血风险而形成可能危及生命的重度中性粒细胞减少症和血小板减少症。血小板减少症常常可限制医学从业人员(例如肿瘤学家)例如逐步加大化学治疗剂量和/或维持化学治疗方案的能力，这继而阻碍缓解癌症或治愈癌症患者或者降低缓解癌症或治愈癌症患者的可能性。参见例如Neelis等(1997)Blood 90(7)：2565-2573；Allen等(2004)“Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems，”Lippincott Williams&Wilkins(ISBN 0781746124)；Beutler(1993)Blood 81：1411；以及Niremburg(2003)cancerNurs26(6)：32S-37S。因此，医学从业人员可将TPO模拟抗体或其治疗活性片段与放射治疗方案或化学治疗方案结合使用以加快血小板恢复(见下文)。如上所述，并以工作实施例为例说明，本文描述的TPO模拟抗体在提高动物的血小板总水平方面是十分有效的。TPO模拟抗体在快速恢复动物消耗的血小板水平方面也是有效的。因此，本文描述的TPO模拟抗体或片段当给予患有癌症的受试者时，与缺乏TPO模拟抗体(或片段)时可能是安全的相比，可允许医学从业人员给予更有效的剂量的化学治疗或放射治疗或更频繁地将化学治疗或放射治疗给予受试者。上文使用的“安全的”或“安全可行的”是指医学从业人员断定的在受试者中足以开始治疗有效的化学治疗方案或放射治疗方案的受试者的血小板水平。

因此，可在给予化学治疗方案或放射治疗方案之前、期间和/或之后将TPO模拟抗体或片段给予受试者。如上所述，需要化学治疗方案或放射治疗方案的受试者包括患有癌症的受试者。例如，受试者可患有选自以下的癌症：肺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌和膀胱癌。

需要化学治疗方案或放射治疗方案的受试者还包括患有炎性疾病或自身免疫性疾病、某些神经障碍或者某些病毒或真菌感染的受试者。炎性疾病可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、脊椎关节病、POEMS综合征、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎)、多中心性巨大淋巴结增生症(multicentric Castleman’sdisease)、系统性红斑狼疮(SLE)、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’ssyndrome)、多发性硬化(MS)、风湿性多肌痛、肌营养不良(MD)、多肌炎、皮肌炎、炎症性神经病例如格-巴综合征(Guillain Barrésyndrome)、血管炎(例如韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosus))、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、贝切特病(Behcet’s disease)、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)或高安动脉炎。

可包括各种细胞毒性药物作为化学治疗方案的部分。特定细胞毒性剂或药剂的组合可取决于例如癌症的类型和待治疗癌症的严重程度。例如，可给予受试者多种细胞毒性药物的任一种或多种，包括而不限于环磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、顺铂、诺考达唑、羟基脲、长春新碱、长春碱、依托泊苷、多柔比星、博来霉素、卡铂、吉西他滨、紫杉醇、托泊替康、硫鸟嘌呤、任何前述药物的治疗性类似物和已知引起受试者的血小板计数降低(或血小板产生减少)的其它化合物。

放射治疗可包括例如差异在于辐射源的位置的体外射束放射治疗(EBRT或XBRT)、近程治疗(或密封源放射治疗)和非密封源放射治疗。“体外”是指来自体外的治疗性辐射源，而密封和非密封源放射治疗包括内部给予受试者放射性材料。辐射的类型可以是例如X射线或γ辐射。在一些实施方案中，辐射疗法包括质子射束辐射疗法。“体内”放射治疗可通过输注或摄入给予受试者。例如间碘苯甲胍(MIBG)输注可用于治疗成神经细胞瘤。可口服给予碘-131治疗甲状腺癌或甲状腺毒症。与镥-177或-90缀合的激素可用来治疗神经内分泌肿瘤。治疗性抗体也可与放射性核素缀合用于放射治疗。例如，可采用替伊莫单抗(Zevalin)、与钇-90缀合的抗CD20抗体和托西莫单抗碘-131(Bexxar

)、与碘-131缀合的抗CD20抗体治疗非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。

在一些实施方案中，可将TPO模拟抗体或其片段给予已经进行或正要进行骨髓移植、手术和/或自体输血的受试者。

本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段可用来治疗辐射暴露的受试者。在一些实施方案中，可以在辐射暴露后将TPO模拟抗体或其片段给予受试者。在一些实施方案中，可将TPO模拟抗体或其片段给予很可能暴露于辐射的受试者。如上所述，很可能暴露于辐射的受试者可为例如：诊断患有癌症且很可能进行化学治疗或放射治疗的受试者、很可能进行骨髓移植的受试者或很可能进行手术的受试者。很可能暴露于辐射的受试者还可以是在加工或使用放射性材料的设施或设施附近工作的人员。例如，受试者可以为在核电厂或核废料贮存设施或其附近工作的人员。

测定受试者所暴露的辐射量的合适方法也是本领域已知的。如果受试者在暴露时穿戴监测装置和/或如果医学从业人员给予已知的治疗有效剂量的辐射，则暴露量计算大大简化。在缺乏监测装置时，医学从业人员可能需要有关暴露的信息，例如辐射强度和类型、暴露持续时间和与暴露源的距离。临床上，即时全血细胞分类计数可用来建立血液学基线。白细胞和血小板在数天到数周的时间内发生改变。这些改变的严重程度还可用来估计暴露量。例如，全身辐射暴露超过100拉德(1戈瑞)可引起淋巴细胞的循环水平下降。可在暴露之后的头24小时内观察到这种下降。由于下降的量与暴露的严重程度成比例，因此淋巴细胞可以用作生物剂量计。

鉴于本文描述的TPO模拟抗体和治疗活性片段的功效，可将其作为单剂量给予受试者。(参见工作实施例)。在人体中使用TPO模拟肽的单剂量疗法的功效已描述于例如Wang等(2004)Clin Pharm Ther76：628-638和Kuter等(2009)Annu Rev Med 60：33.1I-33.14I(印刷前于2008年10月31日在线发表)。

在一些实施方案中，可按不止一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或15或更多个)剂量将TPO模拟抗体或片段给予受试者。在多剂量实施方案中，剂量可为例如每日一次、每两天一次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次。例如，可每天一次给予受试者TPO模拟抗体，为期至少5天。在另一个实例中，可每天一次给予受试者TPO模拟抗体，为期3天。如上所述，给药可发生在暴露于减少血小板计数事件(例如辐射暴露或化学治疗)之前、期间和/或之后。在一些实施方案中，例如，可在辐射暴露或进行化学治疗方案之前约一天(例如约20小时、约24小时或约30小时)，给予受试者单剂量的TPO模拟物或其片段。

在一些实施方案中，可在暴露于辐射(例如放射治疗方案)或进行化学治疗方案之前或之后少于一(1)天(例如少于23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时或少于1小时)，给予受试者TPO模拟抗体或其治疗活性片段。例如，可在辐射暴露之前6或12小时给予受试者单剂量的TPO模拟抗体或其治疗活性片段。在另一个实例中，可在辐射暴露后6、12或24小时给予受试者单剂量的TPO模拟抗体或其治疗活性片段。

在一些实施方案中，可按至少3μg/kg受试者(例如至少4、5、6、7、8、9或10μg/kg)的剂量，每周一次连续六(6)周，将本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段皮下给予人受试者。参见例如Bussel等(2006)N Engl J Med 355：1672-1681。在一些实施方案中，可按至少0.2-10μg/kg受试者的剂量，每周一次连续两(2)周，将本文描述的TPO模拟抗体或其治疗活性片段皮下给予人受试者(参见例如Wang等(2004)，同上)。在一些实施方案中，可按约0.3-10μg/kg受试者(例如约0.5-5、1.0-10、2.0-5、6-10、6-8、9-10、1-4、2-4、0.3-1.0、0.3-3、0.5-2或0.7-7μg/kg受试者)的剂量，将本文描述的TPO模拟抗体或治疗活性片段静脉内给予人受试者。参见例如Wang等(2004)，同上。

同样，可按单剂量给予任何治疗性抗体或其治疗活性片段。在一些实施方案中，可按不止一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个或更多个)剂量将治疗性抗体或其片段给予受试者。在多剂量实施方案中，给药可为例如每日一次、每两天一次、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次。

在一些实施方案中，例如，如果发现治疗性抗体在接受治疗的受试者中引起免疫应答，则可改变具体的给药方案。实际上，医生、护士或其它经授权的医学从业人员可监测接受治疗的受试者产生特异性结合治疗性抗体和/或抑制治疗性抗体的治疗活性的抗体。在这种情况下，医学从业人员可选择停止给予受试者治疗性抗体和/或选择给予受试者不同的治疗性抗体。例如，如果发现接受治疗的受试者产生与第一TPO模拟抗体内的特定TPO模拟肽结合的抗体，则医学从业人员可选择(其中试剂是可获得的)给予受试者不同的TPO模拟抗体，所述抗体含有预期不与受试者的抗体结合的不同TPO模拟物。在另一个实例中，如果发现接受治疗的受试者产生与第一TPO模拟抗体的特定支架抗体的表位结合的抗体，则医学从业人员可选择(其中试剂是可获得的)给予受试者不同的TPO模拟抗体，所述抗体在预期不与受试者的抗体结合的不同抗体支架附近构建。检测受试者(例如人受试者)产生结合治疗性抗体和抑制治疗性抗体活性的中和抗体的方法是本领域已知的，可参见例如Welt等(2003)Clin cancerRes 9(4)：1338-46；Szolar等，J Pharm Biomed Anal 41(4)：1347-1353；以及Lofgren等(2007)J Immunol 178(11)：7467-7472。

在一些实施方案中，可将治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段作为单一疗法给予受试者。或者，如上所述，可将抗体或片段作为与另一种治疗的联合疗法给予受试者，所述另一种治疗为例如另一种用于增加受试者的血小板产生的治疗或用于治疗辐射暴露的受试者的治疗。例如，联合疗法可包括给予受试者(例如人患者)一种或多种为有需要的受试者提供治疗益处的其它药剂(例如艾曲波帕、奥普瑞白介素或罗米司亭)。在一些实施方案中，同时给予治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段和一种或多种其它活性剂。在其它实施方案中，首先给予抗体或片段，其次给予一种或多种其它活性剂。在一些实施方案中，首先给予一种或多种其它活性剂，其次给予抗体或片段。

治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段可替换或增强之前给予的疗法或现行给予的疗法。例如，在用TPO模拟抗体或其治疗活性片段治疗时，可停止或减少给予一种或多种其它活性剂(例如艾曲波帕、奥普瑞白介素或罗米司亭)，例如以较低水平给予。在一些实施方案中，可以维持给予之前的疗法。在一些实施方案中，可以维持之前的疗法直到治疗性抗体或其治疗活性片段的水平达到足以提供治疗效果的水平。两种疗法可以联合给予。

如上所述，在一些实施方案中，可在治疗后监测受试者的血小板产生的增加(或血小板水平的提高)。在一些实施方案中，可在用TPO模拟抗体或其片段治疗后，监测受试者的一种或多种辐射暴露症状的改善。这类症状随受试者所暴露的辐射类型、辐射剂量和暴露部位而改变。所述症状是本领域已知的，包括例如不适、疼痛、喉咙痛、胃肠道不适(呕吐和/或腹泻)、脱发、食欲减退、烧伤和出血。监测受试者(例如人患者)的本文定义的血小板计数不足相关病症的改善，意味着评价受试者疾病参数的改变，例如该病症的一种或多种症状的改善。这类症状随具体病症而改变，但是医学领域众所周知的。参见例如Harker和Zimmerman(1983)“Platelet Disorders(血小板病症)，”Saunders，360页；以及Gresele等(2002)“Platelets in Thrombotic andNon-thrombotic Disorders：Pathophysiology，Pharmacology andTherapeutics(血栓性与非血栓性病症中血小板的病理生理学、药理学和治疗学)，”Cambridge University Press(ISBN 052180261X)。

在一些实施方案中，在给药后至少1小时(例如至少2、4、6、8、12、24或48小时，或者至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更久，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更久)进行评价。可在一个或多个以下时期内评价受试者：开始治疗前；治疗期间；或者给予治疗的一个或多个组成部分后。评价可包括评价进一步治疗的需要，例如评价是否应改变剂量、给药频率或治疗持续时间。还可包括评价增加或放弃选定的治疗方式的需要，例如按本文所述增加或放弃对辐射暴露的任何治疗或增加受试者血小板产生的任何治疗。

离体方法。增加受试者的血小板产生的离体策略可包括用编码本文描述的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的多核苷酸转染或转导获自受试者的一种或多种细胞。例如，细胞可用编码TPO模拟抗体的重链和轻链的单一载体转染，或者细胞可用编码抗体重链的第一载体和编码抗体轻链的第二载体转染。在一些实施方案中，载体含有诱导型启动子，其允许医学从业人员开启或关闭受试者的TPO模拟抗体(或片段)的产生。例如，医学从业人员可选择在计划进行第二轮辐射疗法方案的患者中开启本文描述的TPO模拟抗体的表达。在该方案和受试者的血小板水平恢复后，医学从业人员可选择在受试者中关闭抗体的表达。

然后将转染或转导的细胞输回受试者中。细胞可以是大范围类型中的任一种，包括而不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。这类细胞可用作治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的来源(例如持续来源或定期来源)，只要它们在受试者中存活。在一些实施方案中，可将载体和/或细胞经配置用于诱导型或阻抑型表达抗体(参见例如Schockett等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5173-5176和美国专利号7,056,897)。

优选细胞获自受试者(自体)，但可潜在地获自除受试者之外的相同种的受试者(同种异体)。

从受试者中获得细胞和转导或转染细胞的合适方法是分子生物学领域已知的。例如，转导步骤可通过用于离体基因疗法的任何标准方法完成，包括磷酸钙、脂转染、电穿孔、病毒感染(见上文)和生物射弹基因转移。参见例如Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)。或者，可使用脂质体或聚合微粒。可选择已成功转导的细胞例如用于表达编码序列或抗药基因。

在一些实施方案中，含有巨核细胞的生物样品可获自受试者，将其与TPO模拟抗体接触以促进血小板产生。然后，可将经处理的生物样品重新导入受试者中或与所述受试者相同种的另一受试者中。这类离体自体或同种异体移植方法可用于恢复已接受或正在接受放射治疗或化学治疗的受试者的血小板水平。在这类情况下，在放射治疗或化学治疗之前取出生物样品。

药盒

本公开内容的特征还在于制品或药盒，其包括具有标签的容器，以及含有本文描述的治疗性抗体(例如TPO模拟抗体)或其治疗活性片段的组合物。如果组合物含有TPO模拟抗体或其治疗活性片段，标签可表明组合物用于增加有需要的受试者的血小板产生和/或与化学治疗或放射治疗联合给予受试者(例如人)。药盒可任选包括将组合物给予受试者的工具。例如，药盒可包括一个或多个注射器。药盒还可任选包括将组合物给予受试者的说明书。

在一些实施方案中，药盒还可包括一种或多种用于增加受试者的血小板产生的其它活性剂。例如，药盒可包括Promacta/Revolade

(艾曲波帕；GlaxoSmithKline)、Neumega

(奥普瑞白介素；rhIL-11，Genetics Institute，Inc.)、Nplate^TM(罗米司亭；Amgen，Inc.)和本文描述的任何其它活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，药盒可包括一种或多种用于治疗受试者的辐射暴露的活性剂。例如，药盒可包括抗生素、麻醉剂、止吐药、类固醇(例如雄烯二醇例如4-雄烯二醇或5-雄烯二醇)、螯合剂、利尿药、放射性核素-顶替剂和干细胞中的一种或多种。

药盒可任选包括一种或多种用于测定获自受试者的血样中的血小板水平的试剂。药盒还可包括一种或多种用于从受试者中采集血样的试剂。

下面的实施例旨在说明而非限制本发明。

实施例

实施例1.试剂

下面的试剂用于下述实验：

(1)重组人血小板生成素(以下称为“rhTPO”)；

(2)含有人源化抗补体成分C5抗体(5G1.1)支架的组合物，其中重链的CDR3用TPO模拟肽置换(以下称为“CDR-TPO抗体”)；该抗体不再与C5结合；重链恒定区为上述G2/G4恒定区融合物；

(3)含有不含TPO模拟肽的人源化抗补体成分C5抗体(5G1.1)(以下称为“抗C5对照抗体”)的组合物；重链恒定区为上述G2/G4恒定区融合物；

(4)含有抗破伤风类毒素抗体F(ab’)₂片段的组合物，其中重链CDR3含有TPO模拟肽，轻链CDR2含有TPO模拟肽(以下称为“TPO-Fab”)；

(5)具有人抗炭疽抗体支架的TPO模拟抗体，其中轻链多肽在羧基端含有TPO模拟物(以下称为“LC-TPO抗体”)；重链恒定区为上述G2/G4恒定区融合物；抗体的抗原结合部位与炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的pA83抗原结合；

(6)具有人抗炭疽抗体支架的TPO模拟抗体，其中重链多肽含有在重链铰链区羧基端稍稍以外插入的TPO模拟物(以下称为“HC-TPO抗体”)，TPO模拟物被插入抗炭疽抗体支架CH2部分第5个和第6个残基之间；重链恒定区为上述G2/G4恒定区融合物；抗体的抗原结合部位与炭疽芽孢杆菌的PA83抗原结合；

(7)具有人抗炭疽抗体支架的TPO模拟抗体，其中轻链多肽在羧基端含有TPO模拟物，重链多肽含有在重链铰链区羧基端稍稍以外插入的TPO模拟物(以下称为“HC+LC-TPO抗体”)；重链恒定区为上述G2/G4恒定区融合物；抗体的抗原结合部位与炭疽芽孢杆菌的PA83抗原结合；

(8)不含TPO模拟物的人抗炭疽抗体，重链恒定区含有上述G2/G4恒定区融合物(以下称为“抗炭疽G2/G4对照抗体”)；抗体的抗原结合部位与炭疽芽孢杆菌的PA83抗原结合；和

(9)不含TPO模拟物的人抗炭疽抗体，其中重链恒定区为G1恒定区(以下称为“抗炭疽G1对照抗体”)，且其中抗体的抗原结合部位与炭疽杆菌的PA83抗原结合。

实施例2.HC+LC-TPO抗体的产生和纯化

应用标准分子生物学技术产生质粒表达载体，所述载体含有编码上述HC+LC-TPO抗体的轻链和重链的核酸。通过电穿孔将载体转染到CHOK1SV细胞(中国仓鼠卵巢细胞系)中。筛选转染子稳定表达抗体的克隆。选出克隆并用来产生用于产生和纯化治疗性抗体的大规模培养物。

纯化

使用A蛋白(POROS

)树脂，从细胞培养上清液(900mL)中纯化出HC+LC-TPO抗体。在将上清液过柱前，先将柱用8柱体积的平衡缓冲液(250mM NaCl、50mM甘氨酸，pH 8)平衡。在柱平衡后，将上清液以9mL/分钟的流速加到柱中。一旦将样品加到柱中，便将柱用平衡缓冲液洗涤直到在280nm处的UV吸光度回到零。用150mMNaCl、100mM甘氨酸、pH 3.5将抗体从柱中洗脱出，手工收集峰流分。峰流分用1M Tris(pH 9)中和，并透析到磷酸缓冲盐溶液中。

透析后，使样品经过0.22μm Sterivex过滤器(Millipore)过滤，并通过紫外光谱法在280nm波长处测定浓度。采用QCL-1000显色LAL终点测定试剂盒(Lonza)测定经纯化的抗体的内毒素污染。

实施例3.HC+LC-TPO抗体的体外功能表征

应用No-Weigh^TM Biotin(Thermo Scientific/Pierce)，按1∶1生物素∶蛋白质的比例使重组TPO受体(R&D SYSTEMS

Minneapolis，MN)生物素化。使生物素化TPO受体(5μg/mL)与链霉抗生物素探针偶联15分钟。洗涤探针，随后与25nM HC+LC-TPO抗体接触。在15分钟内，通过Octet QK(Forté-BioMenlo Park，CA)监测抗体与探针的缔合和解离。应用部分拟合结合Forté-Bio

分析软件，测定两种蛋白质间的结合动力学。求出K_D约为2.32nM。

使用上述生物素化TPO受体和链霉抗生物素探针还进行了类似实验，其中使探针与HC+LC-TPO抗体或rhTPO接触。在该项实验中，对于HC+LC-TPO抗体和rhTPO的每一种，求出K_D约为3nM。这些结果表明TPO模拟抗体对TPO受体的亲和力与rhTPO对该受体的亲和力一样。

实施例4.TPO模拟物对小鼠血小板计数的作用

Balb/c小鼠，13周龄，用上文实施例1中所描述的rhTPO、TPO-Fab、CDR-TPO抗体或抗C5对照抗体治疗。每组治疗5只小鼠。一天一次连续5天，以2mg/kg CDR-TPO或对照抗体、13.3mg/kgTPO-Fab或110μg/kg rhTPO的剂量，通过皮下注射给予小鼠组合物。在第3、5、8、10和12天获得各小鼠的血液100μL，第1天为首次治疗。采用Cell-Dyn^TM 3100血液分析仪(Abbott Diagnostics，Illinois)，测定了血液中的外周血血小板。

如图1所示，与对照抗体相比，用rhTPO、CDR-TPO抗体和TPO-Fab治疗的小鼠中，血小板水平大幅提高。

实施例5.TPO模拟抗体对小鼠血小板计数的作用

Balb/c小鼠，13周龄，用CDR-TPO抗体、抗炭疽G1对照抗体、HC-TPO抗体、LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗。抗体如上文实施例1中所述。

各治疗组中有5只小鼠。一天一次连续5天，以2mg/kg的剂量，通过皮下注射给予小鼠抗体。在第0、4、7、9、11、16和18天获得各小鼠的血液100μL，第1天为首次治疗。如上所述测定血液中的外周血血小板。

如图2所示，与抗炭疽G1对照抗体相比，用任何TPO模拟抗体治疗的小鼠的血小板水平提高。此外，用HC-TPO抗体、LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠中获得的血小板水平比用CDR-TPO抗体治疗的小鼠中获得的血小板水平高许多。例如，在第11天，用HC+LC-TPO抗体得到的血小板水平(5,375x10⁶血小板/mL)为用CDR-TPO抗体治疗的小鼠的相应血小板水平(1,802x10⁶血小板/mL)的几乎3倍。这些结果出人意料地表明，在提高动物血小板水平方面，在轻链和/或重链铰链区羧基端具有TPO模拟物的抗体比在CDR区含有TPO模拟肽的抗体更有效。

另外，与CDR-TPO抗体相比，用例如LC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠血小板水平升高得更快(参见第4天的血小板水平；图2)。

采用上述方法，测定了若干其它CDR-TPO模拟物构建体在小鼠中刺激血小板产生的能力。抗体含有两个或四个插入重链和/或轻链可变区的CDR的TPO模拟物。例如，一种抗体含有2条重链多肽和2条轻链多肽，其中重链多肽CDR3被TPO模拟物置换，且其中轻链多肽的CDR2被TPO模拟物置换。另一种抗体含有2条重链多肽和2条轻链多肽，其中重链多肽的CDR3被TPO模拟物置换，且其中轻链多肽的CDR1被TPO模拟物置换。这些抗体在提高小鼠血小板水平方面都不如HC-TPO抗体、LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体有效。

总之，这些数据表明，HC-TPO抗体、LC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体在动物中引起更多的总血小板产生以及更快的血小板产生方面，比CDR-TPO对应抗体分子更有效。这些数据还表明，TPO模拟肽在轻链的一个或两个羧基端上(允许模拟物呈现在抗体的中心裂口上)和在重链铰链区处或附近的特别置换为LC-TPO抗体、HC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体提供优良的TPO样生物活性。

实施例6.单剂量TPO模拟抗体治疗对小鼠血小板计数的作用

Balb/c小鼠，14周龄，用抗炭疽G1对照抗体、CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体治疗。每个治疗组中有三只(3)小鼠。按2mg/kg的剂量，通过皮下注射一(1)次将抗体给予小鼠。在相对于治疗的第0、2、4、7、9、11、15、18和21天从各小鼠中收集血液。如上所述分析外周血血小板。如图3所示，与用抗炭疽对照抗体治疗的小鼠中的血小板水平相比，用LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠中的血小板水平升高，此外，这些数据表明，从用LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠中获得血小板水平比从用CDR-TPO抗体治疗的小鼠中获得的血小板水平明显较高。数据还表明，与CDR-TPO抗体相比，LC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体更能够在动物血液中保持高的血小板水平。(参见例如第9-15天，图3)。

此外，这些数据还出人意料地表明，单剂量的LC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体不仅能够明显提高小鼠中的血小板水平，而且单剂量几乎与多次给药方案一样有效(与图2相比较)。

实施例7.TPO模拟抗体对MMC治疗的小鼠中的血小板水平的作用

Balb/c小鼠，14周龄，以3mg/mL的剂量静脉内给予丝裂霉素C(MMC)。在MMC治疗后，以600μg/kg剂量，每天一次连续5天，通过皮下注射给予小鼠上述CDR-TPO抗体或抗C5对照抗体。在MMC治疗(第0天)后第8、11、15、18、21、25和32天，从经治疗的小鼠以及假对照小鼠中采集血液。如上测定血液中的外周血血小板。

如图4所示，与用抗C5对照抗体治疗的小鼠相比，在用CDR-TPO抗体治疗的小鼠中血小板水平升高。这些结果表明，就在骨髓抑制疗法后血小板水平的更快恢复而言，与未用提高血小板产生的作用剂的治疗相比，CDR-TPO抗体在动物中是有效的。

根据使用LC-TPO抗体、HC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体的上述实验的结果，就在骨髓抑制疗法后血小板水平的恢复而言，预期这些抗体在动物中是有效的。另外，之前的结果还表明，在血小板恢复方面，LC-TPO抗体、HC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体的功效等于或大于CDR-TPO抗体的功效。

检验该假设的实验如下。Balb/c小鼠，14周龄，以3mg/mL的剂量静脉内给予丝裂霉素C(MMC)。在MMC治疗后，还通过皮下注射给予小鼠下列抗体之一：CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体、抗C5对照抗体、抗炭疽G1对照抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体。

以2mg/kg的剂量，每天一次连续5天给予抗体。在MMC治疗(第0天)后的第0、2、4、7、9、11、15、18和21天从各小鼠中采集血液。如上所述分析外周血血小板。预期与对照抗体相比，用两种TPO模拟抗体和CDR-TPO抗体之一治疗的小鼠的血小板水平升高。这些数据可表明，对于骨髓抑制疗法后血小板水平的恢复，LC-TPO抗体、HC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体在动物中是有效的。此外，预期该数据表明，与CDR-TPO抗体相比，LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体可更快提高血小板水平，并且可在动物中维持血小板水平更久。

在另一项实验中，Balb/c小鼠，14周龄，通过皮下注射给予下列抗体之一：CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体、抗C5对照抗体、抗炭疽G1对照抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体。根据下列给药方案给予抗体。第一治疗方案包括以600μg/kg的剂量，每天一次连续5天将抗体给予小鼠。在最终剂量后一天，以3mg/mL的剂量静脉内给予小鼠丝裂霉素C(MMC)。第二治疗方案包括在MMC治疗前3天，给予小鼠一剂600μg/kg剂量的抗体。第三治疗方案包括在MMC治疗前一天，给予小鼠一剂600μg/kg剂量的抗体。预期与用抗炭疽或抗C5对照抗体治疗的小鼠的血小板水平相比，用LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠的血小板水平可提高。还预期，在MMC治疗前给予小鼠单剂量的LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体将显著提高随后MMC治疗的小鼠中的血小板水平。

在又一项实验中，Balb/c小鼠，14周龄，通过皮下注射给予下列抗体之一：CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体、抗C5对照抗体、抗炭疽G1对照抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体。根据下列给药方案给予抗体。第一治疗方案包括以600μg/kg的剂量，每天一次连续5天将抗体给予小鼠。第一剂量前一天，以3mg/mL的剂量静脉内给予小鼠丝裂霉素C(MMC)。第二治疗方案包括MMC治疗后一天给予小鼠一剂600μg/kg剂量的抗体。第三治疗方案包括MMC治疗后3天，给予小鼠一剂600μg/kg剂量的抗体。预期与用抗炭疽或抗C5对照抗体治疗的小鼠的血小板水平相比，用LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的小鼠的血小板水平可提高。还预期刚好在MMC治疗后给予小鼠单剂量的LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体可显著提高随后MMC治疗的小鼠的血小板水平。

总之，这些研究结果可进一步支持以下结论：TPO模拟肽在轻链的一个或两个羧基端上(允许TPO模拟物呈现在抗体的中心裂口上)和在重链铰链区处或附近的特定置换为这些TPO模拟抗体分子提供优良的TPO样生物活性。

因此，预期LC-TPO抗体、HC-TPO抗体和HC+LC-TPO抗体可用于治疗经历骨髓抑制疗法的动物。

实施例8.TPO模拟抗体对γ辐射小鼠中的血小板水平的作用(预治疗)

C57BL6/J小鼠，8-10周龄，通过皮下注射给予下列抗体之一：CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体、抗C5对照抗体、抗炭疽G1对照抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体。

根据三个治疗方案给予抗体。第一治疗方案包括以2mg/kg的剂量，每天一次连续5天将抗体给予小鼠。在最终剂量后的一天，以约0.90Gy/分钟对小鼠进行8.0戈瑞(Gy)辐射，参见Mouthon等(1999)Int.J Radiation Oncology Biol Phys 43(4)：867-875。第二治疗方案包括辐射前3天给予小鼠一剂2mg/kg剂量的抗体。第三治疗方案包括辐射前1天给予小鼠一剂2mg/kg剂量的抗体。在辐射后30天内监测受治疗小鼠的存活率。预期与用抗炭疽或抗C5对照抗体治疗的小鼠的存活率相比，用LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的辐射小鼠的存活率增加。还预期辐射前给予小鼠单剂量的LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体可显著增加辐射小鼠的存活率。

此外，预期在增加辐射小鼠存活率方面，LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体比在CDR区含有TPO模拟物的抗体更有效。

实施例9.TPO模拟抗体对γ辐射小鼠中的血小板水平的作用(后治疗)

在另一项实验中，C57BL6/J小鼠，8-10周龄，通过皮下注射给予下列抗体之一：CDR-TPO抗体、LC-TPO抗体、HC-TPO抗体、HC+LC-TPO抗体、抗C5对照抗体、抗炭疽G1对照抗体和抗炭疽G2/G4对照抗体。

根据一种治疗方案，在以约0.90Gy/分钟暴露于8.0戈瑞(Gy)辐射后6小时给予小鼠抗体，参见Mouthon等(1999)，同上。在第二治疗方案中，在辐射小鼠后6小时并且每天一次连续4天给予小鼠抗体。在辐射后30天内监测受治疗小鼠的存活率。预期与用抗炭疽或抗C5对照抗体治疗的小鼠的存活率相比，用LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体治疗的辐射小鼠的存活率增加。还预期与用对照抗体治疗的小鼠的存活率相比，辐射后给予单剂量的LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体可显著增加辐射小鼠的存活率。

此外，预期在增加辐射小鼠的存活率方面，LC-TPO抗体、HC-TPO抗体或HC+LC-TPO抗体比在CDR区含有TPO模拟物的抗体更有效。

虽然本公开内容已参照其具体的实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应当理解的是可以进行各种变动，等同内容可被替换而又不背离本公开内容的真实精神和范围。另外，可进行许多修改以便使具体情况、材料、物质组合物、方法、一个或多个方法步骤适于本公开内容的目的、精神和范围。所有这类修改均意图在本公开内容的范围内。

Claims

1.一种治疗性抗体或所述抗体的治疗活性片段，其中所述抗体或片段包含至少两个治疗性肽，且其中至少一个治疗性肽在结构上允许治疗性肽存在于抗体中心裂口的位置上整合到轻链多肽的恒定区。

2.权利要求1的治疗性抗体或其治疗活性片段，其还包含含有至少一个治疗性肽的重链多肽，其中将所述至少一个治疗性肽整合到：

(a)重链多肽的铰链区中；

(b)铰链区的氨基端与铰链区上游的重链多肽区之间的连接处；

(c)铰链区的羧基端与铰链区下游的重链多肽区之间的连接处；或

(d)始于重链多肽铰链区的氨基端上游少于20个氨基酸或重链多肽铰链区的羧基端下游少于20个氨基酸内的位置上。

3.一种治疗性抗体或所述抗体的治疗活性片段，其中所述抗体或片段包含至少两个治疗性肽，其中重链多肽包含至少一个治疗性肽，且其中将所述至少一个治疗性肽整合到：

(a)重链多肽的铰链区中；

4.权利要求3的治疗性抗体或其治疗活性片段，其还包含轻链多肽，其中至少一个治疗性肽在结构上允许治疗性肽存在于抗体中心裂口的位置上整合到轻链多肽的恒定区。

5.权利要求2-4中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽整合到重链多肽的铰链区中。

6.权利要求2-4中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽整合到铰链区的氨基端与铰链区上游的重链多肽区之间的连接处。

7.权利要求2-4中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽整合到铰链区的羧基端与铰链区下游的重链多肽区之间的连接处。

8.权利要求2-4中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽整合到始于铰链区氨基端上游少于20个氨基酸内的位置上。

9.权利要求2-4中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽整合到始于铰链区羧基端下游少于20个氨基酸内的位置上。

10.权利要求1、2或4-9中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述治疗性肽如下整合到轻链多肽的恒定区：(i)插入所述恒定区的β转角区内；或(ii)在所述恒定区的β转角区内置换。

11.权利要求1、2或4-9中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述治疗性肽因添加到恒定区的羧基端而整合到轻链多肽的恒定区。

12.权利要求1、2或4-9中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述治疗性肽如下整合到轻链多肽的恒定区：(iii)插入位于所述恒定区的最终β折叠结构下游的位置上；或(iv)添加到位于所述恒定区的最终β折叠结构下游的位置上。

13.权利要求1-12中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中轻链多肽的羧基端包含至少一个治疗性肽，重链多肽包含至少一个治疗性肽。

14.权利要求1-13中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体或片段包含至少4个治疗性肽。

15.权利要求1-14中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少两个治疗性肽是相同的。

16.权利要求1-15中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所有治疗性肽都是相同的。

17.权利要求1-16中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其还包含位于至少一个治疗性肽的氨基端的间隔基氨基酸序列。

18.权利要求1-17中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其还包含位于至少一个治疗性肽的羧基端的间隔基氨基酸序列。

19.权利要求1-18中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽是激动剂肽。

20.权利要求1-19中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中至少一个治疗性肽是肽模拟物。

21.权利要求20的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述肽模拟物是TPO模拟物。

22.权利要求1-21中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所有治疗性肽都是TPO模拟物。

23.权利要求21或22的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述TPO模拟物包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

24.权利要求21-23中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽。

25.权利要求21-23中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽。

26.权利要求21-25中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽和含有SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽。

27.权利要求21-23中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体由包含SEQ ID NO：10所述氨基酸序列的轻链多肽和包含SEQ ID NO：12所述氨基酸序列的重链多肽组成。

28.权利要求1-27中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

29.权利要求1-23中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体是人源化抗体。

30.权利要求1-28中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体或其治疗活性片段选自嵌合化抗体、嵌合抗体、去免疫化人抗体、完全人抗体和F(ab’)₂片段。

31.权利要求1-28中任一项的治疗活性片段，其中所述治疗活性片段选自Fd片段、Fab片段和Fab’片段，且其中所述治疗活性片段包含：

至少两个治疗性肽；和

至少部分的重链多肽铰链区或至少部分的轻链多肽羧基端。

32.权利要求1-31中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段，其中所述抗体或治疗活性片段还包含异源部分。

33.一种组合物，其包含权利要求1-32中任一项的治疗性抗体或治疗活性片段和药学上可接受的载体。

34.一种组合物，其包含权利要求21-32中任一项的治疗性抗体或治疗活性片段和药学上可接受的载体。

35.权利要求34的组合物，其还包含至少一种用于降低辐射暴露的副作用或用于降低化学治疗的副作用的活性剂。

36.权利要求35的组合物，其中所述至少一种活性剂选自抗生素、麻醉剂、止吐药、类固醇、螯合剂和利尿药。

37.权利要求34-36中任一项的组合物，其还包含至少一种用于增加受试者的血小板产生的其它活性剂。

38.权利要求37的组合物，其中所述至少一种用于增加受试者的血小板产生的其它活性剂选自艾曲波帕、奥普瑞白介素、罗米司亭、培非司亭和红细胞生成素刺激剂。

39.一种用于增加受试者的血小板产生的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含权利要求21-32中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段的组合物给予有需要的受试者。

40.一种用于增加受试者的血小板产生的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的权利要求21-32中任一项的治疗性抗体或其治疗活性片段的组合物给予有需要的受试者。

41.权利要求39或40的方法，其中所述受试者患有血小板计数不足相关病症。

42.权利要求41的方法，其中所述病症选自伯-索综合征、特发性血小板减少性紫癜、威-奥综合征、脾功能亢进、血栓性微血管病、弥散性血管内凝血、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、冯维勒布兰德病、变型冯维勒布兰德病、因HIV感染所致的血小板减少症、因慢性肝病所致的血小板减少症和格兰兹曼血小板机能不全。

43.权利要求41或42的方法，其中所述病症是药物诱导性血小板机能不全。

44.权利要求39-43中任一项的方法，其中所述受试者患有癌症。

45.权利要求44的方法，其中所述受试者患有选自以下的癌症：肺癌、乳癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌和膀胱癌。

46.权利要求43-45中任一项的方法，其中血小板机能不全由化学治疗药引起。

47.权利要求39-46中任一项的方法，其中已经给予或将要给予受试者化学治疗方案或放射治疗方案。

48.权利要求47的方法，其中所述化学治疗方案包括给予受试者一种或多种选自以下的细胞毒性剂：环磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、顺铂、诺考达唑、羟基脲、长春新碱、长春碱、依托泊苷、多柔比星、博来霉素、卡铂、吉西他滨、紫杉醇、托泊替康和硫鸟嘌呤。

49.权利要求47的方法，其中所述放射治疗方案包括X射线或γ辐射。

50.权利要求47或49的方法，其中所述放射治疗方案包括将放射性试剂给予受试者。

51.权利要求47-50中任一项的方法，其中在化学治疗方案或放射治疗方案之前将所述组合物给予受试者。

52.权利要求47-50中任一项的方法，其中在化学治疗方案或放射治疗方案期间或之后将所述组合物给予受试者。

53.权利要求39-52中任一项的方法，其中所述受试者是人。

54.权利要求39-53中任一项的方法，其中将所述组合物静脉内给予受试者。

55.权利要求39-53中任一项的方法，其中将所述组合物皮下、腹膜内或肌内给予受试者。

56.权利要求39-55中任一项的方法，其中将所述组合物作为单剂量给予受试者。

57.权利要求39-55中任一项的方法，其中将不止一个剂量的所述组合物给予受试者。

58.权利要求57的方法，其中在化学治疗方案或放射治疗方案(i)之前和(ii)期间或之后将所述组合物给予受试者。

59.权利要求39-58中任一项的方法，其中与不给予所述组合物的情况下可能是安全可行的相比，所述化学治疗方案或放射治疗方案(i)更有效，或(ii)更频繁地给予受试者。

60.权利要求39-59中任一项的方法，所述方法还包括将至少一种用于降低化学治疗方案或放射治疗方案的副作用的其它物质给予受试者。

61.权利要求60的方法，其中所述至少一种物质选自抗生素、麻醉剂、止吐药和雄烯二醇。

62.权利要求39-61中任一项的方法，所述方法还包括将至少一种增加血小板产生的其它物质给予受试者。

63.权利要求62的方法，其中所述至少一种增加血小板产生的其它物质选自艾曲波帕、奥普瑞白介素、罗米司亭、培非司亭和红细胞生成素刺激剂。

64.权利要求39-63中任一项的方法，所述方法还包括在给予所述组合物后，监测受试者的血小板水平的提高。

65.一种分离多肽，其包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列含有至少一个TPO模拟肽氨基酸序列并且：

(i)与由SEQ ID NO：10所述核酸编码的氨基酸序列有至少80％同一性；或

(ii)与由SEQ ID NO：12所述核酸编码的氨基酸序列有至少80％同一性。

66.一种分离核酸，其编码包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有至少一个TPO模拟肽氨基酸序列并且：