CN102408476B

CN102408476B - 捕光叶绿素a/b结合蛋白基因及其在提高植物产量和种子含油量中的应用

Info

Publication number: CN102408476B
Application number: CN201010289166.1A
Authority: CN
Inventors: 黄锐之; 吴学龙; 刘智宏; 胡张华; 袁思玮
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: CN102408476A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及到一种植物捕光叶绿素a/b蛋白复合体基因BnCAB及其在提高植物产量和种子含油量中的应用。所述捕光叶绿素a/b结合蛋白基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸。本发明还公开了利用所述的基因提高植物产量和种子含油量的方法，即在种子特异启动子的驱动下，利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的BnCAB基因的正义顺序导入植物中，建立转基因植物株系，本发明建立的转基因植株的单粒种子重量和单株种子量增加，种子含油量提高。

Description

捕光叶绿素a/b结合蛋白基因及其在提高植物产量和种子含油量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及到一种植物捕光叶绿素a/b蛋白复合体(chlorophylla/bbindingprotein，CAB)基因BnCAB及其在提高植物产量和种子含油量中的应用。

背景技术

油料作物是以榨取油脂为主要用途的一类作物，食用植物油是人们的生活必需品，除了对人类具有重要的营养价值外，植物油脂还是重要的化工原料，广泛用于食品、纺织、机械、冶炼、油漆、橡胶、塑料及医药等行业，特别是全球能源日趋紧张，利用植物油生产可再生能源已成为世界各国应对能源危机的重要战略选择，植物油脂在国民经济中占有越来越重要的地位。单位面积油脂产出量是决定油料作物生产效益的重要因素，因而提高单位面积油脂产出量的两个组成要素——含油量与单产，是油料作物育种始终追求的目标，(李云昌等，中国油料作物学报。28：92-96，2006)。

光合作用是指绿色植物通过叶绿体，利用光能，将二氧化碳和水转化为碳水化合物并放出氧气的过程，是作物产量形成的基础。提高作物的光合效率一直以来都是作物研究关注的热点。

种子是多数植物得以繁衍的起始材料，也是作物产量构成的重要器官；种子的发育过程也正是作物产量形成的关键时期。拟南芥、油菜、大豆等是含脂肪和蛋白质较高的作物，其生育期间须获得较多的能量，植物对光的利用效率会对作物产量产生很大影响可被认为是公知知识。然而，光照对作物产量的贡献以前主要着重于叶片等光合器官，近年来有关拟南芥、油菜、大豆等“绿色种子”对光能的吸收利用及其影响油脂等贮藏物质积累的作用机制研究的报道才逐步增加。已有的研究表明，虽然有荚壳包被，到达种子的较低水平的光照仍能实质性地提高光合作用相关酶的活性、增加脂肪酸合成量(WillmsJRetal.，PlantPhysiology，120：1117-1127，1999；Ruuska，SA.etal.PlantPhysiology，136：2700-2709，2004)。Goffmant等(GoffmantFDetal.PlantPhysiology，138：2269-2279，2005)发现，光照不仅可促进油菜种子光合产物转化成贮藏物质的合成代谢效率，同时也提高了胚的生长速度。光合作用对胚胎发育的作用，主要在CO2固定和能量供应水平(Ruuskaetal.，PlantPhysiol.136，2700-2709.2004；Schwenderetal.，Nature.432，779-782.2004).这些研究结果都显示，光能利用对油菜、大豆等油料作物种子油脂等贮藏物质积累、产量形成具有重要作用。

虽然植物光合作用、油脂合成的研究一直备受关注，但通过特异的提高植物种子光能利用效率来提高种子产量和/或含油量仍未见报道。因此，本领域迫切需要寻找到一些可以有效提高植物种子光合作用效率从而提高产量和含油量的技术方法。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种植物捕光叶绿素a/b结合蛋白；本发明的第二个目的是提供编码上述结合蛋白的基因；本发明的第三个目的是提供编码上述结合蛋白的基因的制备方法；本发明的第四个目的是提供上述的基因在提高植物产量和种子含油量中的应用；本发明的第五个目的是提供含有上述基因的表达载体、细胞系、宿主菌以及扩增该基因中任一片段的引物。本发明的第六个目的是提供含有上述基因的表达载体的一种构建方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种植物捕光叶绿素a/b结合蛋白，来源于芸薹属甘蓝型油菜(Brassicanapus)，该结合蛋白是下述多肽之一：

(1)具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的多肽；

(2)将SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)所述多肽的功能的多肽或由其他物种的同源序列生成的氨基酸序列或衍生物。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

编码上述的结合蛋白的基因，该基因的cDNA和基因组基因是下述核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；

(2)编码序列表中SEQIDNO：2的核苷酸序列；

(3)与序列表中SEQIDNO：1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

(4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件为在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

编码上述的结合蛋白的基因的制备方法，该方法包括以下的步骤：

①用Trizol试剂提取甘蓝型油菜未成熟种子的总RNA，以oligo-d(T)18为引物，用M-MLV反转录酶将获得的RNA反转录为cDNA，以所合成的cDNA为模板，用LA-Taq进行PCR扩增，所用引物对为5’-ATGGCCGCCTCAACAATGGC-3’、5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’，获得了约800bp的扩增片段；

②PCR扩增产物连接到载体pMD18-T，得到含有扩增片段的重组质粒，命名为pMD-CAB，经测序，获得的PCR产物序列如SEQIDNO：1所示。

或者，上述的方法包括以下的步骤：

①取甘蓝型油菜(Brassicanapus)叶片，加入700μl的2％CTAB，将叶片磨碎，60-65℃加热1hr，加入等体积24：1氯仿-异戊醇，混合均匀；

②12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加等体积异丙醇或二倍体积乙醇，入加1/10体积3MNaAc；

③12000rpm，4℃离心10分钟，吸去上清，沉淀用70％-75％乙醇洗2次，室温干燥，加入50μl超纯水中；

④以此油菜基因组DNA为模板，用引物对进行PCR扩增，所用引物对为5’-ATGGCCGCCTCAACAATGGC-3’、5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’，经测序证明扩增产物为BnCAB基因组DNA，其序列与SEQIDNO：1所示序列相同。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的基因在提高植物产量和种子含油量中的应用

为了实现上述的第五个目的，本发明采用了以下的技术方案：

含有所述基因的表达载体。

作为优选，该种子特异表达启动子可为napin启动子、大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子、oleosin基因启动子或FAE1基因启动子。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，如加入植物可选择性标记或对抗生素、除草剂的抗性标记。被转化的植物宿主可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。

含有本发明基因的表达载体、细胞系、宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

为了实现上述的第六个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种含有上述基因的表达载体的构建方法，该方法包括以下的步骤：

①首先以油菜基因组DNA为模板，用引物对5’-AAGCTTTCTTCATCGGTGATTGA-3’和5’-TCGTGTATGTTTTTAATCTTGTTTG-3’进行PCR扩增，获得油菜napin启动子，用该启动子片段置换植物表达载体pFGC5941中酶切位点EcoRI-BamHI间的35S启动子片段，获得中间载体pFGC-NAPIN；

②采用引物5’-CACATCTAGACCCATCTCTTGGCTCAT-3’和5’-CACATCTAGATACACTCGCACAAGAAGCAA-3’用PufTaq从pMD18-T/BnCAB扩增后PCR产物用Xba1酶切后与经Xba1酶切的pFGC-NAPIN载体连接；

③连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，阳性克隆用引物对5’-GATCGCCATGCAAATCTC-3’和5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’进行PCR扩增；

④挑取PCR阳性的克隆，用碱裂解法提取质粒DNA进行酶切鉴定，选取酶切正确的克隆进行测序验证，构建成种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB。

本发明由于采用了上述的技术方案，提供一种提高植物产量和种子含油量的基因工程方法，即在种子特异表达启动子的驱动下，利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将绿色植物光合系统中的重要基因捕光叶绿素a/b结合蛋白基因BnCAB的正义顺序导入植物组织、细胞或器官，再将转化的植物组织、细胞或器官培育成植株，建立转基因植物株系，植物就表现为单粒种子重量和单株种子重量增加，种子含油量提高。

另一方面，通过将转化有本发明编码捕光叶绿素a/b结合蛋白基因BnCAB或与BnCAB具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株与其他品种的植物进行杂交、并对获得的杂交后代植株进行培养和检测，可从中进一步筛选出单粒种子重量和单株种子重量增加，种子含油量提高的植株。

本发明所提供的基因和方法，可广泛应用于植物产量和品质性状的改良。所述的植物选自(但不限于)：十字花科、豆科、禾本科。所述的植物包括(但不限于)：油菜、拟南芥、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、花生、棉花、油桐、蓖麻、烟草、水稻、玉米，小麦、大麦、小油桐、油茶等。

附图说明

图1：BnCAB编码的蛋白质结构域包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域。

图2：BnCAB种子特异超表达载体NAPINPr::BnCAB结构示意。

图3：拟南芥NAPINPr::BnCABT3代转基因株系和Col0野生型未成熟种子BnCAB基因表达水平比较。C-4、C-33、C-80、C-124、C-149为拟南芥独立转化株系.NAPIN Pr::BnCAB拟南芥转化植株和Col 0野生型对照在相同条件下培养。在进行基因表达水平的RT-PCR分析时，以Actin2基因为内参。由于油菜BnCAB基因与拟南芥CAB具有高度同源性，用于扩增油菜BnCAB的引物也能扩增拟南芥CAB基因。

图4：拟南芥NAPINPr::BnCABT3代转基因株系和Col0野生型种子粒重比较。

图5油菜NAPINPr::BnCABT2代转化株系和非转化受体材料平均单株产量比较。图中所示为各株系3个小区单株产量的平均值及标准差，每小区12个单株。BnC-OX1-BnC-OX5为NAPIN Pr::BnCAB油菜转化株系。Control为未转化的受体品种。

图6油菜NAPINPr::BnCABT2代转化株系和非转化受体材料种子含油量比较。图中所示为各株系3个小区成熟种子含油量的平均值及标准差，每小区12个单株。BnC-OX1-BnC-OX5为NAPIN Pr::BnCAB油菜转化株系。Control为未转化的受体品种。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中如无特别说明均按常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.植物捕光叶绿素a/b结合蛋白BnCAB基因的克隆

1.1用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取甘蓝型油菜(Brassicanapus)未成熟种子的总RNA，以oligo-d(T)₁₈为引物，用M-MLV反转录酶(Promega公司)将获得的RNA反转录为cDNA，以所合成的cDNA为模板，用LA-Taq(大连TaKaRa公司)进行PCR扩增，所用引物对为BnCABF(5’-ATGGCCGCCTCAACAATGGC-3’)、BnCABR(5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’)。获得了约800bp的扩增片段。PCR扩增产物连接到载体pMD18-T(大连TaKaRa公司)，得到含有扩增片段的重组质粒，命名为pMD-CAB，经测序，获得的PCR产物序列如SEQIDNO：1所示，由804个碱基组成，利用ORFFINDER对该序列进行分析，该cDNA片段从1bp到804bp含有一个开放阅读框(openreadingframe，ORF)和一个终止密码子，编码267个氨基酸(图4)，我们将其命名为BnCAB。经过SMART和BLAST软件分析，BnCAB编码的氨基酸中第65-234位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophlla/bbindingdomain)(如图1所示)。

1.2取甘蓝型油菜(Brassicanapus)叶片(指甲大)，加入700μl的2％CTAB，将叶片磨碎，60-65℃加热1hr，加入等体积24∶1氯仿-异戊醇，混合均匀。12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加等体积异丙醇(或二倍体积乙醇)，加入1/10体积3MNaAc。12000rpm，4℃离心10分钟，吸去上清，沉淀用70％-75％乙醇洗2次，室温干燥，加入50μl超纯水中。以此油菜基因组DNA为模板，用引物对BnCABF+BnCABR进行PCR扩增，经测序证明扩增产物为BnCAB基因组DNA，其序列与SEQIDNO：1所示序列相同。

实施例2.BnCAB种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB的构建

2.1首先以油菜基因组DNA为模板，用引物对napin5(5’-AAGCTTTCTTCATCGGTGATTGA-3’)和napin3(5’-TCGTGTATGTTTTTAATCTTGTTTG-3’)进行PCR扩增，获得油菜napin启动子(AF420598)，用该启动子片段置换植物表达载体pFGC5941中酶切位点EcoRI-BamHI间的35S启动子片段，获得中间载体pFGC-NAPIN。

采用引物BnCAB52(5’-CACATCTAGACCCATCTCTTGGCTCAT-3’)+BnCAB32(5’-CACATCTAGATACACTCGCACAAGAAGCAA-3’)用PufTaq从pMD18-T/BnCAB扩增后PCR产物用Xba1酶切后与经Xba1酶切的pFGC-NAPIN载体连接。

2.2连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，阳性克隆用引物对napin52(5’-GATCGCCATGCAAATCTC-3’)和BnCABR(5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’)进行PCR扩增。挑取PCR阳性的克隆，用碱裂解法(参见《分子克隆》)提取质粒DNA进行酶切鉴定，选取酶切正确的克隆进行测序验证，构建成BnCAB种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB，载体结构如图2所示。

实施例3.BnCAB种子特异超表达转基因拟南芥的获得

3.1将实施例2构建的种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB用热激法转化农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，在含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB抗性平板上28℃进行培养。挑取单克隆用引物对napin52和BnCABR进行PCR验证后用于植物转化。

挑取含质粒NAPINPr::BnCAB的农杆菌单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液，28℃150rpm振荡培养2d。按1∶50的比例在新鲜的YEP液体培养基中扩大培养至对数生长期(菌液OD600≈1.5)。3000rmp离心10min，弃上清。将沉淀重新悬浮于渗透培养液，(组成为含5％蔗糖，44mM6-苄氨基嘌呤和0.05％SilwetL-77的1/2MS液体培养基)，调OD₆₀₀＝0.8。用Floraldip法(CloughSJetal，1998.PlantJ16：735-43)进行转化，即将拟南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)的花序全部在转化液中浸泡1-2min，并轻轻摇晃，转化后的拟南芥植株保鲜膜覆盖保湿1～2天。隔4-5天后按上述方法重复转化，共转化3-4次。收获成熟种子(T1代)。

3.2拟南芥抗性植株筛选。将实施例3.1中收获的拟南芥T1代种子播种于盆钵中，播种后7-10天，喷1∶3000体积比稀释的有效浓度18.5％的除草剂Bastar，每周2次，喷3-4次。筛选出的抗性植株用引物对用引物对napin52+BnCABR进行PCR检测，分单株收获成熟种子(T2代)。上述独立转化单株继续按上述方法种植、PCR检测、收获成熟种子，形成NAPINPr::BnCAB转基因株系(T3代)。

实施例4、RT-PCR检测NAPINPr::BnCAB转基因拟南芥种子BnCAB表达水平

4.1将实施例3所获得的拟南芥T3代转化植株和哥伦比亚野生型(Col-0)的种子悬浮于0.1％的琼脂溶液中，4℃春化2天后播种于土壤(蛭石、草炭和珍珠岩按体积比6∶2∶1混合)，在温度22℃、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。播种后7-10天，喷1∶3000体积比稀释的有效浓度18.5％的除草剂Bastar进行抗性筛选。抗性植株用napin52+BnCABR进行PCR检测，PCR阳性植株用于基因表达分析。

对主花序开花时期进行标记，取开花后7-12天的拟南芥荚果，按Cernac方法取拟南芥未成熟种子(CernacAandBenningC.WRINKLED1encodesanAP2/EREBdomainproteininvolvedinthecontrolofstoragecompoundbiosynthesisinArabidopsis.ThePlantJournal，2004，40：575-585.)，在液氮中研磨，按说明书所述方法用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以oligo-d(T)₁₈为引物，用M-MLV逆转录酶(Promega公司)合成cDNA第一链。

4.2以实施例4.1中获得的cDNA为模板，用拟南芥Actin2基因为内参进行RT-PCR，调整各cDNA样品浓度，Actin2基因扩增引物对为ACTF(5’-AGAGATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’)+ACTR(5’-AACGATTCCTCCACCTGCCTCATCATACTC-3’)。用RT-PCR方法比较拟南芥NAPINPr::BnCAB转化株系和野生型对照在种子贮藏物质快速积累时期拟南芥BnCAB基因表达水平，所用引物对为BnCABF+BnCABR，结果如图3所示，NAPINPr::BnCAB转化植株未成熟种子的BnCAB基因表达水平较Col0野生型明显增强。

实施例5、BnCAB种子特异超表达拟南芥转基因植株荚果叶绿素含量增加

捕光叶绿素a/b结合蛋白是一类捕获光能，并把能量迅速传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合体。叶绿素含量是光合作用强度的重要生理指标。

分开花后1-6天和7-12天两个时期取拟南芥BnCAB转基因植株及Col-0野生型对照荚果。按每一样品约0.2克取样后准确称重，分别放入研钵，加入少量石英砂及95％乙醇2-3ml，研成匀浆，转移至10ml容量瓶，用少量乙醇冲洗研钵、研棒数次，连同残渣一起倒入容量瓶中，最后用乙醇定容至10ml。样品4℃黑暗放置1小时，期间将容量瓶中倒转混合数次。提取液6000g、4℃离心2分钟，吸取上清即为各样品叶绿素提取液。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定叶绿素提取液吸光度。按下列公式计算叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb：mg/L)，二者之和为总叶绿素的浓度：Ca＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉，Cb＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅。最后根据下式求出各植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量(mg/g)＝[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重。每一处理设3个重复，每一样品重复测定2次。

从表2可以看出，拟南芥NAPINPr::BnCAB转基因植株荚果叶绿素含量增加，显示光能吸收能力增强。

表2拟南芥BnCAB种子特异超表达转基因植株与Col0野生型荚果叶绿素含量比较

C-4、C-124和C-149是三个拟南芥NAPINPr::BnCAB转化株系。用于叶绿素含量测定的是T3代转化株系。表中所示为3组样品重复测定的平均值及标准差

实施例6.BnCAB种子特异超表达转基因拟南芥种子重量提高

BnCAB种子特异超表达转基因拟南芥种子千粒重的测定：BnCAB种子特异超表达转基因拟南芥T3代和野生型对照在相同条件下种植，每盆3株，待种子成熟后按株系分别收获。各株系用分析天平分别精确称量3×200粒成熟种子的重量。10个拟南芥株系的种子粒重测定结果如图4所示，NAPINPr::BnCAB结构转化植株的种子粒重总体较野生型提高。

实施例7.BnCAB种子特异超表达转基因油菜的获得

7.1油菜种子用NaClO∶H₂O＝1∶3(加一滴吐温20)消毒30min，无菌水冲洗5～6次，置于MS固体培养基上，25℃条件下萌发，生成无菌苗。将5～6天苗龄无菌苗下胚轴切成0.5～1.0cm的切段，置于MS+1mg/L6-BA+1mg/L2，4-D预培养基上进行预培养1天后作为转基因受体材料。

7.2将实施例3.1中获得的含种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB的农杆菌EHA105菌株接种到50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液，28℃150rpm振荡培养至对数期，将预培养过的下胚轴切段浸于制备好的菌液中5min。取出外植体并吸干多余的菌液，置于MS+2mg/L6-BA培养基上共培养。

7.3共培养2天后，将外植体在含有300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗2次，转入分化培养基1：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20μmol/LAgNO₃+500mg/L羧苄青霉素上培养。4天后转入分化培养基2：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20μmol/LAgNO₃+20mg/LPPT+500mg/L羧苄青霉素上培养。外植体在上述分化培养基上每隔21天用原培养基继代培养1次。待分化出绿色小芽后转入新鲜分化培养基继续培养14～21d。

7.4待分化出的绿芽长到3cm左右时，移入生根培养基MS+0.2mg/LNAA+20mg/LPPT+500mg/L羧苄青霉素中生根，2周后出根长成完整小植株，经过逐步炼苗后，移栽入土中，植株可进一步生长发育并产生种子。所有的油菜转化过程均在25℃，光照强度3000lx，光照时间16小时光照/8小时黑暗的条件下进行。

7.5油菜抗性植株的PCR检测：用CTAB法提取油菜叶片DNA，用引物对napin52+BnCABR进行PCR检测，PCR阳性的转化植株分单株收获种子。

实施例8.BnCAB种子特异超表达转基因油菜单株产量提高

NAPINPr::BnCAB油菜T2代转化株系和受体品种分小区直播种植，每小区种植12株，每一株系设3个重复。转化株系和受体品种田间管理水平相同。成熟后分小区收获种子，测量各小区产量，计算出每一株系的平均单株重。其结果如图5所示，各NAPINPr::BnCAB转化株系平均单株产量提高7％～26.1％。

实施例9.BnCAB种子特异超表达转基因油菜种子含油量提高

BnCAB转基因油菜和未转化受体对照种子含油量测定采用索氏提取法(魏红等。中国油脂，2004，29(6)：52-54.)，每一株系各取10个单株的种子分别测定含油量。其基本步骤如下：把滤纸包放入(105±2)℃烘箱中干燥2小时，取出放入干燥器中冷却至室温称重(A)；将1g油菜种子粉碎，过40目筛后装入上述称重过的纸包，封好包口放入(105±2)℃烘箱中干燥3小时，移至干燥器中冷却至室温称重(B)；包有样品的纸包在乙醚中浸泡过夜后抽提8小时。抽提完毕，移去上部冷凝管，取出滤纸包，在通风橱内晾干。抽提后的滤纸包置于烘箱105℃干燥3小时，移至干燥器中冷却至室温称重(C)。含油量(％)＝(B-C)/(B-A)×100％。

未转化受体对照和5个NAPINPr::BnCAB油菜转化株系种子含油量测定结果如图6所示，各转化株系的种子含油量均有不同程度提高，其中一个株系的最高含油量较受体品种提高18.16。

Claims

1.SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在提高植物产量和种子含油量中的应用，所述的植物为拟南芥，其特征在于该应用的方法包括以下的步骤：

一、植物捕光叶绿素a/b结合蛋白BnCAB基因的克隆

1.1用Trizol试剂提取甘蓝型油菜(Brassicanapus)未成熟种子的总RNA，以oligo-d(T)₁₈为引物，用M-MLV反转录酶将获得的RNA反转录为cDNA，以所合成的cDNA为模板，用LA-Taq进行PCR扩增，所用引物对为BnCABF：5’-ATGGCCGCCTCAACAATGGC-3’，BnCABR：5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’；获得了800bp的扩增片段；PCR扩增产物连接到载体pMD18-T，得到含有扩增片段的重组质粒，命名为pMD-CAB，经测序，获得的PCR产物序列如SEQIDNO：1所示，由804个碱基组成，利用ORFFINDER对该序列进行分析，该cDNA片段从1bp到804bp含有一个开放阅读框和一个终止密码子，编码267个氨基酸，其命名为BnCAB；经过SMART和BLAST软件分析，BnCAB编码的氨基酸中第65－234位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域；

1.2取甘蓝型油菜叶片，指甲大，加入700μl的2%CTAB,将叶片磨碎，60-65℃加热1hr，加入等体积24：1氯仿-异戊醇，混合均匀；12000rpm，4℃离心10分钟；取上清，加等体积异丙醇或二倍体积乙醇，加入1/10体积3MNaAc；12000rpm，4℃离心10分钟，吸去上清，沉淀用70%-75%乙醇洗2次，室温干燥，加入50μl超纯水中；以BnCAB基因的DNA为模板，用引物对BnCABF+BnCABR进行PCR扩增，经测序证明扩增产物为BnCAB基因的DNA，其序列与SEQIDNO：1所示序列相同；

二BnCAB种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB的构建

2.1首先以BnCAB基因的DNA为模板，用引物对napin5，5’–AAGCTTTCTTCATCGGTGATTGA-3’和napin3，5’–TCGTGTATGTTTTTAATCTTGTTTG-3’进行PCR扩增，获得油菜napin启动子AF420598，用该启动子片段置换植物表达载体pFGC5941中酶切位点EcoRI-BamHI间的35S启动子片段，获得中间载体pFGC-NAPIN；

采用引物BnCAB52+BnCAB32，BnCAB52序列为5’–CACATCTAGACCCATCTCTTGGCTCAT-3’， BnCAB32序列为5’–CACATCTAGATACACTCGCACAAGAAGCAA-3’，用PufTaq从pMD18-T/BnCAB扩增后PCR产物用Xba 酶切后与经Xba酶切的pFGC-NAPIN载体连接；

2.2连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞，用含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，阳性克隆用引物对napin52：5’-GATCGCCATGCAAATCTC-3’和BnCABR：5’-TCACTTTCCGGGAACGAAGT-3’进行PCR扩增；挑取PCR阳性的克隆，用碱裂解法提取质粒DNA进行酶切鉴定，选取酶切正确的克隆进行测序验证，构建成BnCAB种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB；

三、BnCAB种子特异超表达转基因拟南芥的获得

3.1将构建的种子特异表达载体NAPINPr::BnCAB用热激法转化农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105，在含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB抗性平板上28℃进行培养；挑取单克隆用引物对napin52和BnCABR进行PCR验证后用于植物转化；

挑取含质粒NAPINPr::BnCAB的农杆菌单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液，28℃150rpm振荡培养2d；按1:50的比例在新鲜的YEP液体培养基中扩大培养至对数生长期，菌液OD600≈1.5；3000rmp离心10min，弃上清；将沉淀重新悬浮于渗透培养液，组成为含5%蔗糖，44mM6-苄氨基嘌呤和0.05%SilwetL-77的1/2MS液体培养基，调OD₆₀₀=0.8；用Floraldip法进行转化，即将拟南芥（ArabidopsisthalianaCol-0）的花序全部在转化液中浸泡1-2min,并轻轻摇晃，转化后的拟南芥植株保鲜膜覆盖保湿1~2天；隔4-5天后按上述方法重复转化，共转化3-4次；收获成熟种子T1代；

3.2拟南芥抗性植株筛选；将收获的拟南芥T1代种子播种于盆钵中，播种后7-10天，喷1：3000体积比稀释的有效浓度18.5％的除草剂Bastar，每周2次，喷3-4次；筛选出的抗性植株用引物对用引物对napin52+BnCABR进行PCR检测，分单株收获成熟种子T2代；上述独立转化单株继续按上述方法种植、PCR检测、收获成熟种子，形成NAPINPr::BnCAB转基因株系T3代。