CN102401818A - 土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境分析检测方法，具体为土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法，其方法包括以下步骤：（1）样品采集与制备，采集耕层0-20cm的土壤，避开堆肥地点和田地边缘，每个混合土样由多个单点样混合均匀后，按四分法缩减而成，重约1kg，置于清洁密封袋，避光低温保存带回，土样于室内自然风干后，磨细，过60目尼龙筛，称取土壤样品2g备用；（2）制备提取液；（3）萃取、净化、富集；（4）洗脱、定容、检测。本发明中采用的测定方法操作更具规范性，减少了真空干燥的步骤，人为干扰更少，操作时间更短，操作准确度更高。采用强阴离子固相萃取小柱串联C18反相固相萃取小柱，大大提高了净化和富集效果。

Description

土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法

技术领域

    本发明涉及环境分析检测方法，具体为土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法。

背景技术

土壤是自然环境要素的重要组成之一，是生物圈中不可缺少的部分，是人类、动植物赖以生存的物质基础，因此土壤质量的优劣直接影响人类的生产、生活和发展。在土壤农药污染成为人们关注和研究的热点时，土壤抗生素污染问题因抗生素滥用而凸现出来。     四环素类物质属于酸碱两性物质，易溶于酸性或碱性溶液，在弱酸性溶液中相对较稳定，在酸性溶液（pH<2）、中性或碱性溶液（pH>7）中均易发生降解而失效；常用的四环素类抗生素（TCs）有：四环素（Tetracycline, TC）、金霉素（Chlortetracycline, CTC）、土霉素（Oxytetracycline, OTC)、强力霉素（Doxycycline, DC）、去甲基金霉素（Demeclocycline, DMCTC）、甲烯土霉素（Methacycline, MTc）和二甲胺四环素（Minocycline, MINO）等。环境中四环素类抗生素主要来源之一是兽医用抗生素。作为药物，抗生素被机体吸收的部分很少，有相当部分以原形或代谢物的形式随粪便和尿液排出体外，最终进入土壤环境。据统计，畜禽使用的抗生素有25%～75%以母体药物的形式从粪便中排出，最高可达90%。在对四环素类抗生素的研究中发现，绵羊能够以母体的形式排出土霉素添加量的21%，而公牛幼仔能够排出金霉素添加剂量的17～75%。据估计，一个万头猪场每年向环境排泄兽药约300～500kg。以美国为例，目前抗生素类兽药每年用量约11000吨，则可以估算出每年从养殖业流入环境的抗生素就达到6600～9900吨。由此可见，抗生素存在很高的环境污染风险。

目前在畜禽粪便中已经检测到了高含量的抗生素残留。张树清等对我国7省、市、自治区的典型规模化养殖场的四环素类抗生素检测结果表明在猪粪的27个样品中，土霉素平均含量为9.09mg/kg；四环素平均含量为5.22mg/kg；金霉素平均含量为3.57mg/kg；在鸡粪的23个样品中，土霉素平均含量为5.97mg/kg，四环素平均含量为2.63mg/kg，金霉素平均含量为1.39mg/kg。张慧敏等对浙北地区畜禽粪便中四环素类抗生素残留的检测结果是：畜禽粪中四环素、土霉素和金霉素残留量分别在检测限以下至16.75、29.60和11.63 mg/kg之间，总平均值分别为1.57、3.10和1.80 mg/kg；施用畜禽粪肥农田表层土壤中土霉素、四环素和金霉素的平均残留量分别为未施畜禽粪肥农田的38倍、13倍和12倍。

 主要来源之二为人医用抗生素。据统计，1999年欧盟和瑞士消耗抗生素13288吨，其中65%是医用。据Roman等报道，人体服用四环素类药物后的排出物中金霉素、四环素、土霉素和多西环素的原形药物的比例分别为：>70%、80%～90%、>80%、>70%。如此高的医用抗生素经过人体排泄进入废弃物，最后归宿到土壤环境。在我国所有药品消费的前十位中，抗生素几乎占一半。在人医用抗生素方面，据了解，目前我国抗生素的门诊使用率为21%左右，卫生部此前公布，68.9%的住院病人使用抗菌药物，37.0%的病人联合使用抗菌药物，平均100个患者1天消耗80.1人份的抗菌药物，是世界卫生组织发布的全球平均值的一倍多，远远高于 30％的国际水平。多方面的资料表明，现有水处理技术对污水中含有的相当一部分抗生素没有明显的去除效果:如抗癫痫药卡马西平的去除率仅为 8％，而降血脂药氯贝酸的去除率几乎为 0，全部随污水处理厂出水进入受纳水体。因此，对于含有抗生素的医院污水或城市生活污水，无论是否经过处理，只要实施排放，均可存在污染地表水、地下水以及农田土壤环境的风险。

环境中抗生素的分析方法主要包括样品的前处理阶段及检测阶段两部分。国内在抗生素药物生产过程中的质控分析、食品中的残留分析方面常有报道。在检测蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量，可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量等皆颁布了相关国家标准。对于抗生素药物在环境中的存在及检测则报导较少，较之于水中抗生素的检测分析研究，土壤抗生素检测方法报道更少。

将残留于环境中的抗生素检测出来是研究抗生素环境行为的前提和基础。近几年来，国内不断建立新的检测土壤中抗生素的高效液相色谱法，但是存在回收率较低、检测时间较长、色谱峰峰形较差、目标分析物质分离不完全等不足，所以期望找到一套更高效的土壤四环素类抗生素的检测方法。

发明内容

本发明针对现有四环素类抗生素检测方法的不足，提出一种更方便快捷并且回收率高，可提高四环素类抗生素检测率的土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法。

本发明的技术方案为： 

土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法，包括以下步骤：

（1）样品采集与制备

采集耕层0-20cm的土壤，避开堆肥地点和田地边缘，每个混合土样由多个单点样混合均匀后，按四分法缩减而成，重约1kg，置于清洁密封袋，避光低温保存带回，土样于室内自然风干后，磨细，过60目尼龙筛，称取土壤样品2 g备用；

（2）制备提取液   

向步骤（1）的土壤样品中加入5ml提取缓冲液，并在25℃下恒温往复式振荡10-15min，再超声提取10-15min，最后在4500r/min、室温下离心10min后得到上清液；将离心后的残留物重复步骤（2）三次，最后一次的残留物舍去，然后混合均匀前三次的上清液，得到土壤提取液； 

（3）萃取、净化、富集 

    将步骤（3）中土壤提取液在35-40℃时避光旋转蒸发约至体积的一半，串联SAX与LC-C18小柱，先用6ml甲醇、后用6ml高纯水活化小柱，提取液过柱，用2ml体积分数为15%的甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；

（4）洗脱、定容

拆下SAX小柱，用3ml甲醇洗脱LC-C18小柱即得洗脱液，设置氮气吹脱仪温度35-40℃，将洗脱液吹至近干，用定溶液分多次在超声波中溶解残留物，并定容至1.0ml，然后再用0.22μm的有机相针式过滤器过滤至进样瓶；

（5）HPLC检测

紫外（UV）检测器；色谱柱Agilent Zorbax SB-C18，色谱柱为4.6mm×250mm，5μm；检测波长270nm；进样体积20μL；流动相流速0.8-1.2ml/min；检测时间15-20min，流动相0.01mol/L草酸:乙腈:甲醇=73-78：12-17：4-9（pH=2-3）。

优选的，本发明土壤四环素类抗生素高效液相色谱测定方法，所述的步骤（2）中的提取缓冲液配制为柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用高纯水溶解并定容到1L，pH为4，此为EDTA-Mellvaine缓冲液，然后再按1:1(v/v)的比例混合甲醇和EDTA-Mellvaine缓冲液，即为提取缓冲液，pH为4.9。

进一步优选的，本发明土壤四环素类抗生素高效液相色谱测定方法所述的步骤（4）中的定溶液配制为甲醇:高纯水=3:2(v/v)。

本发明另一目的是提供一种检测粪样品和沼液样品中四环素类抗生素高效液相色谱测定方法，粪样品的采集与制备为采集养殖场经无害化处理后的粪样，然后将粪样置于清洁密封袋，避光低温保存带回后，自然风干，磨细，过60目尼龙筛备用；沼液样品的采集与制备为采集养殖场沼液约1L，于清洁塑料瓶避光低温保存带回后，于4℃以下冷藏保存备用，取沼液200.0mL，加入20mL提取缓冲液，混匀，静止5min，用0.45μm滤膜过滤，滤液再通过SAX-LC18串联小柱，其余步骤同土样前处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：操作更具规范性，减少了真空干燥的步骤，每一步都采用标准化的科学仪器进行实验，人为干扰更少，操作时间更短，操作准确度更高。在旋转蒸发过程中采取避光操作，采用强阴离子固相萃取小柱串联C18反相固相萃取小柱，大大提高了净化和富集效果。以0.01mol/L草酸:乙腈:甲醇=76：16：8（pH=2.5）混合液为流动相，其组成和配比更加合理，目标分析物得到更好的分离，色谱峰峰面积更大，峰形更好，回收率更高。

附图说明

图1土霉素、四环素、金霉素色谱分离图（0.01 mol/L草酸溶液:乙腈=3:2）；

图2土霉素、四环素、金霉素色谱分离图（0.01 mol/L磷酸:乙腈=4:1）；

图3  土霉素、四环素、金霉素色谱分离图（流动相0.01 mol/L草酸:乙腈:甲醇=76:16:8）；

图4 不同处理条件下的回收率比较；

图5 土样中土霉素、四环素、金霉素含量；

图6 粪样中土霉素、四环素、金霉素含量；

图7 沼液中土霉素、四环素、金霉素含量。

 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1：

以四川农业大学林场土壤作为供试土壤，采用当前广泛使用的三种高效液相色谱检测方法测定，四环素、土霉素、金霉素含量均在其检测限以下。将供试土样自然风干，过60目尼龙筛备用。  

准确称取0.1000g各抗生素标准品（土霉素、四环素、金霉素）于200mL烧杯中，用甲醇溶解，转移至1000mL棕色容量瓶中，再用甲醇反复洗涤烧杯3-5次，洗液一并转入容量瓶中，然后用甲醇定容，摇匀，即得100μg/mL标准储备液，4℃冰箱内保存。

分别精确移取5.00mL各标准储备液于500mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释，摇匀后定容，即得1μg/mL混合标准溶液，4℃冰箱内保存。

吸取0.70mL浓磷酸，用高纯水稀释至1L制备0.01mol/L 磷酸溶液；称取1.26g C₂H₂O₄·2H₂O 溶于1L高纯水中制备0.01mol/L草酸溶液；量取150mL甲醇用高纯水稀释至1L制备15%甲醇。将1.26g C₂H₂O₄·2H₂O溶解于甲醇中，定容至1L，得到0.01mol/L（草酸-甲醇）混合溶液。

以流动相定容，配制浓度为0.00，0.03，0.06，0.20，0.40，1.00，2.00，4.00，10.00，20.00（μg/mL）的抗生素混合标准曲线。

在实验中，为了尽可能地模拟田间土壤与四环素类抗生素之间的作用，需要对土样进行预处理：称取2.00g供试土壤于塑料离心管中，共36份，其中18份土样加入1mL的混合标准液，余下土样加入2mL的混合标准液，置于暗处过夜。

经预处理后的土样，紧接土样前处理步骤进行，即加入5mL提取缓冲液，25℃恒温往复式振荡10min，超声波提取10min，4500r/min离心10min，对残留物重复以上步骤3次，合并提取液，40℃避光旋转蒸发提取液约至一半。按照SAX上，LC-C18下的方式串联固相萃取小柱，依表1进行后续实验步骤即：活化，上样，清洗，洗脱，氮吹，定容，过滤至进样瓶。检测条件：Shimadzu LC-20AB 高效液相色谱仪（UV检测器）；LC Solution 工作站；Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；检测波长270nm；进样体积20μL；检测时间15min，流动相按照0.01mol/L草酸溶液：乙腈=60:40；乙腈：0.01mol/L磷酸=20:80；0.01mol/L草酸：乙腈：甲醇=76:16:8分别进行检测。

 

表1 实验安排表

分别以0.01mol/L草酸溶液：乙腈=60:40和以乙腈：0.01mol/L磷酸=20：80为流动相，其余条件保持相同，其土霉素、四环素、金霉素分离结果如图1、图2所示。 

 

由图1、图2可知，以0.01 mol/L草酸溶液：乙腈=3:2为流动相的处理出现倒峰，标准物质没有得到有效分离。以草酸：乙腈：甲醇=76:16:8为流动相，目标分析物的色谱分离状况如图3所示。由图2、图3可知，流动相为0.01 mol/L磷酸：乙腈=4:1和流动相为0.01 mol/L草酸：乙腈：甲醇=76:16:8的处理，其目标物质都得到有效分离，但以0.01 mol/L草酸：乙腈：甲醇=76:16:8为流动相的色谱峰峰面积更高，峰形更好，检测限更低。

 

各处理回收率比较如图4所示。

 

由图1-图4可知，从目标物质的回收率、色谱峰峰形、分离度和检测限综合考虑，处理4都优于其他处理。本检测方法三种物质的检测限分别为：5.85μg/mL，0.99μg/mL，18.66μg/mL。因此，改进后的土壤四环素类抗生素HPLC检测步骤为：2g土样中加入5mL甲醇-含EDTA的Mellvaine提取液，25℃恒温往复式振荡10min，超声波提取10min，4500r/min离心10min，残留物重复上述步骤3次，合并提取液，避光旋蒸提取液约至一半，依次采用6mL甲醇和6mL水活化SAX-C18固相串联小柱，上样，用2mL15% 甲醇清洗固相萃取小柱，用3mL甲醇洗脱，40℃氮气吹脱至近干。用甲醇：水=3:2的混合液分多次在超声波中溶解定容，定溶液经0.2μm有机相针式过滤器过滤至进样瓶。色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6*250mm，5μm），流动相采用0.01mol/L草酸：乙腈：甲醇=76:16:8，流速1mL/min，进样量20μL，温度25℃，检测波长270nm，检测时间15min。

实例2 ：实地采集彭州市致和镇、九尺镇、濛阳镇、升平镇、丽春镇和三界镇6个乡镇的2-3家大型养殖场经无害化处理后的粪样、沼液，施用养殖场粪肥的蔬菜种植地土样。

土样采集与制备：采集耕层（0-20cm）土壤，避开堆肥地点和田地边缘。每个混合土样由多个单点样混合均匀后，按四分法缩减而成，重约1kg，置于清洁密封袋，避光低温保存带回。土样于室内自然风干后，磨细，过60目尼龙筛备用。

粪样采集与制备：采集代表性大型养殖场经无害化处理后粪样。粪样置于清洁密封袋，避光低温保存带回后，自然风干，磨细，过60目尼龙筛备用，用以检测粪样抗生素含量。

沼液样采集与制备：采集代表性养殖场上层沼液1000mL，于清洁塑料瓶避光低温保存带回后，于4℃以下冷藏保存。

一共采集土样25个，粪样14个，沼液样9个。本次实验中，实验用水均为高纯水。

准确称取2g土样、2g粪样，分别加入5mL甲醇-含EDTA的Mellvaine提取液，25℃恒温往复式振荡10min，超声波提取10min，4500r/min离心10min，残留物重复上述步骤3次，合并提取液，避光旋蒸提取液约至一半，依次采用6mL甲醇和6mL水活化SAX-C18固相串联小柱，上样，用2mL15% 甲醇清洗固相萃取小柱，用3mL甲醇洗脱，40℃氮气吹脱至近干。用甲醇：水=3:2的混合液分多次在超声波中溶解定容，定溶液经0.2μm有机相针式过滤器过滤至进样瓶，上机待测。取沼液200.0mL，加入20mL提取缓冲液，混匀，静止5min，用0.45μm滤膜过滤，串联SAX-LC18小柱，其余步骤同土样前处理。

土霉素、四环素、金霉素的线性回归方程如表2 所示：

  表2   土霉素、四环素和金霉素的回归方程

土壤、粪样、沼液中四环素类抗生素检测结果如图5-图7 所示：

从图5-图7中可知，采集的土样、粪样和沼液样中至少检测出一种四环素类抗生素物质。土样中以土霉素和四环素检出率最高，全部检出；粪样中四环素检出率最高，为92.9%；沼液中以四环素检出率最高，全部检出。 

Claims (4)

1.土壤中四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品采集与制备

采集耕层0-20cm的土壤，避开堆肥地点和田地边缘，每个混合土样由多个单点样混合均匀后，按四分法缩减而成，重约1kg，置于清洁密封袋，避光低温保存带回，土样于室内自然风干后，磨细，过60目尼龙筛，称取土壤样品2 g备用；

（2）制备提取液   

向步骤（1）的土壤样品中加入5ml提取缓冲液，并在25℃下恒温往复式振荡10-15min，再超声提取10-15min，最后在4500r/min、室温下离心10min后得到上清液；将离心后的残留物重复步骤（2）三次，最后一次的残留物舍去，然后混合均匀前三次的上清液，得到土壤提取液； 

（3）萃取、净化、富集 

    将步骤（3）中土壤提取液在35-40℃时避光旋转蒸发约至体积的一半，串联SAX与LC-C18小柱，先用6ml甲醇、后用6ml高纯水活化小柱，提取液过柱，用2ml体积分数为15%的甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；

（4）洗脱、定容

拆下SAX小柱，用3ml甲醇洗脱LC-C18小柱即得洗脱液，设置氮气吹脱仪温度35-40℃，将洗脱液吹至近干，用定溶液分多次在超声波中溶解残留物，并定容至1.0ml，然后再用0.22μm的有机相针式过滤器过滤至进样瓶；

（5）HPLC检测

紫外（UV）检测器；色谱柱Agilent Zorbax SB-C18，色谱柱为4.6mm×250mm，5μm；检测波长270nm；进样体积20μL；流动相流速0.8-1.2ml/min；检测时间15-20min，流动相0.01mol/L草酸:乙腈:甲醇=73-78：12-17：4-9（pH=2-3）。

2.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素高效液相色谱测定方法，其特征在于：所述的测定方法还可用于检测粪样品和沼液样品，粪样品的采集与制备为采集养殖场经无害化处理后的粪样，然后将粪样置于清洁密封袋，避光低温保存带回后，自然风干，磨细，过60目尼龙筛备用；沼液样品的采集与制备为采集养殖场沼液约1L，于清洁塑料瓶避光低温保存带回后，于4℃以下冷藏保存备用，取沼液200.0mL，加入20mL提取缓冲液，混匀，静止5min，用0.45μm滤膜过滤，滤液再通过SAX-LC18串联小柱，其余步骤同土样前处理。

3.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素高效液相色谱测定方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的提取缓冲液配制为柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用高纯水溶解并定容到1L，pH为4，此为EDTA-Mellvaine缓冲液，然后再按1:1(v/v)的比例混合甲醇和EDTA-Mellvaine缓冲液，即为提取缓冲液，pH为4.9。

4.根据权利要求1所述的土壤四环素类抗生素高效液相色谱测定方法，其特征在于：所述的步骤（4）中的定溶液配制为甲醇:高纯水=3:2(v/v)。

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