CN102397561A

CN102397561A - 米托蒽醌作为淋巴示踪剂的应用

Info

Publication number: CN102397561A
Application number: CN2011102875358A
Authority: CN
Inventors: 王淑君; 王敏; 许文; 程菲
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenzhen Huarun nine Chuang Pharmaceutical Co., Ltd.; Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-09-26
Also published as: CN102397561B

Abstract

本发明提供了米托蒽醌及其盐类（如盐酸米托蒽醌，草酸米托蒽醌，硫酸米托蒽醌，磷酸米托蒽醌，醋酸米托蒽醌，枸橼酸米托蒽醌等）作为淋巴示踪诊断剂方面的应用。米托蒽醌及其盐类可制成注射液，粉针，乳剂，脂质体，纳米粒和微球等制剂。其既可直接发挥杀伤恶性肿瘤细胞的作用，蓝染特性又可作为淋巴示踪剂，应用于癌症手术疗法中术中淋巴清扫术，适用于胃癌，乳腺癌，肠癌，宫颈癌，睾丸癌等。

Description

米托蒽醌作为淋巴示踪剂的应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及米托蒽醌作为淋巴示踪剂方面的应用。

背景技术

癌症是威胁着全人类健康的一大杀手，全世界每年新增癌症病人为800万，世界卫生组织国际癌症研究中心日前公布的一份研究报告说，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。自上世纪70年代以来，癌症死亡在中国一直呈持续增长趋势，目前癌症死亡已位居各类死因的第一位。癌症的早期发现和诊断可以为癌症的治疗赢得时间，对于患者生命有着特殊的意义，而及时彻底的手术清除癌细胞是治疗癌症成功的关键。淋巴结转移是肿瘤常见的转移途径，如乳腺癌、胃癌等。实体癌症手术或者放疗后远期存活率不是令人很满意，失败的主要原因是癌细胞的淋巴转移。因此，手术中需要尽可能的将淋巴结摘除，防止其进一步转移，这就需要寻求一种有效地示踪剂来辨认淋巴结。同时，未能摘除的淋巴结能够富集较高浓度的抗癌药物，以防止癌细胞的进一步转移。

前哨淋巴结是最先接受肿瘤区域淋巴引流并最早发生肿瘤转移的特异淋巴结，它接受原始的淋巴液，引流量最大，最容易含有转移的肿瘤细胞。前哨淋巴结是癌细胞经淋巴转移的第一道屏障。如果前哨淋巴结无转移，该区域其他淋巴结发生转移的可能性很小。自Giuliano 等采用10 g/L的异硫蓝进行乳腺癌前哨淋巴结以来，各国医生尝试不同的活性染料以期达到最佳的前哨淋巴结效果。从理论上讲，前哨淋巴结的性状能准确地反映区域淋巴结状况，故通过一定的技术手段对前哨淋巴结进行定位，再以微侵入的方式取出并进行精确活检，即可推断趋于淋巴结的状。这对于实体癌的临床治疗和判断预后有着重大意义。

目前，前哨淋巴结活检的方法有核素法、染料法和二法联合应用三种。核素法定位准确,术中操作简单,费时少,但需要专用探测仪器,费用较高；染料法是一种重要的方法，常用的染料有异硫蓝、专利蓝和亚甲蓝。资料表明：前二者与蛋白结合力弱，注射后组织弥散少，并能很快进入淋巴管和前哨淋巴结使之有较深染色，故能获得较好的效果，但是不足之处就是维持染色时间较短，常需要反复注射，对结果有一定影响，而且价格昂贵，国内无生产厂家，故国内报道较少；后者能持久维持淋巴结的蓝染状态，但是与蛋白的结合力较强，对周围的组织也有染色。因而，寻求开发安全有效的淋巴示踪剂，有效地对肿瘤区域淋巴结进行清除，是提高癌症患者生存质量、延长病人寿命的重要手段。

目前常用的淋巴示踪剂优缺点如下：

示踪剂	优点	缺点
			专利蓝	组织弥散少，染色迅速，效果好	维持染色时间较短，价格昂贵，国内不常用
异硫蓝	组织弥散少，染色迅速，效果好	维持染色时间较短，价格昂贵，国内不常用
			亚甲蓝	染色持久，褪色缓慢	周围组织蓝染，定位不准
纳米碳	高度的淋巴趋向性，定位准确	在体内不被代谢，生产工艺较复杂，染色速度慢
			中华墨汁	同纳米碳	染色速度较慢，注射部位残留严重

米托蒽醌，是一广谱抗肿瘤药物，外观为蓝黑色结晶，易溶于水,比已知的常用抗肿瘤药物作用要强。大量临床证实，米托蒽醌对白血病、乳腺癌和恶性淋巴瘤疗效显著。米托蒽醌因为在化学结构上与阿霉素有差异，所以毒副作用反应小。文献报道，通过动物实验米托蒽醌只有轻微的心脏毒性。国外6500例临床统计表明单用此剂引起的心衰只有9例，并且心衰也可以用洋地黄得到控制。因此，米托蒽醌作为抗癌药受到医师们的高度重视，给广大癌症患者带来福音。

发明内容

本发明的目的是解决现有示踪剂染色时间慢，维持时间短，周围组织弥散大，注射部位残留严重以及制备工艺复杂的难题，提供了米托蒽醌作为淋巴示踪剂方面的应用。

米托蒽醌作为优良的淋巴示踪剂的优势在于：（1）血浆中消除迅速，不蓝染血管。试验证明，静注米托蒽醌后，血药浓度很快下降，t_1/2=6min左右，所以几乎不蓝染血管，不影响淋巴结的定位；（2）染色迅速，定位准确。小鼠实验证明，米托蒽醌能于10min之内蓝染一，二，三级淋巴结；（3）蓝染维持时间长。实验证明，米托蒽醌蓝染淋巴结后，淋巴结褪色时间>120min；（4）周围组织弥散少，注射部位残留较少；（5）价格相对较低廉。

综上，米托蒽醌是一种适宜临床广泛应用和推广的优良的淋巴示踪剂。

本发明所述的米托蒽醌，不仅包括米托蒽醌原形形式，还包括其盐类，如盐酸米托蒽醌，草酸米托蒽醌，硫酸米托蒽醌，磷酸米托蒽醌，醋酸米托蒽醌和枸橼酸米托蒽醌等，可制成米托蒽醌注射液，粉针，乳剂，脂质体，纳米粒和毫微球等剂型。

本发明所制备的米托蒽醌注射液、粉针、乳剂、脂质体、纳米粒和毫微球对小鼠的淋巴结有较好的蓝染能力，同时又没有将周围组织蓝染。经过反复试验论证，米托蒽醌确实对小鼠的淋巴结有较高的趋向性，并且对淋巴结有较深染色，而周围组织无蓝染。因此，米托蒽醌可以开发成有效地淋巴示踪诊断试剂，加上其本身对癌症的治疗作用，一方面可以直接杀死肿瘤细胞，另一方面，其蓝染特性又可用于癌症手术中的淋巴结清扫术，可谓一举两得，为癌症患者带来福音。

米托蒽醌注射液的处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 0.5～100g

抗氧剂 1-10g

pH调节剂调节pH约3.5～5.5

溶剂加至1000ml

所述抗氧剂为焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或两者组合物；所述pH调节剂为盐酸，磷酸，硫酸，草酸，醋酸或枸橼酸或几者组合物；所述溶剂为注射用水或氯化钠溶液或葡萄糖溶液。

米托蒽醌注射液的制备工艺为：采取溶解法或者稀释法，将处方量主药溶于处方量溶剂中，超声使溶解，用适量pH调节剂调节pH约3.5～5.5，加入抗氧剂使溶解,加入0.1%-0.5%针用活性炭，室温搅拌10-30min。然后用0.8μm微孔滤膜过滤除碳，0.45μm微孔滤膜精滤，加入二氧化碳饱和的注射用水至全量，检查滤液澄明度，合格后灌装，1-10ml每支，熔封。灭菌。测定PH范围在3.5～5.5之间。

米托蒽醌粉针的处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 5-10 mg

甘露醇 10-1000mg

肌酐 1-10mg

注射用水加至500ml

米托蒽醌粉针的制备工艺为：将上述各成分用处方量注射用水溶解后，无菌过滤，分装于安瓿瓶中，每支5ml，冷冻干燥后封口，漏气检查即得。

米托蒽醌乳剂处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 1%-5%

大豆油 30-50%

Span 80 – Tween 80 (HLB=8) 20-50%

Transcutol P 1-10 %

5％葡萄糖溶液 1-5%

共制100.0 g

米托蒽醌乳剂制备工艺为：精密称取处方量的主药充分溶解于处方量Transcutol P、Span80-Tween80（HLB=8）和5%的葡萄糖溶液的混合液中，在45℃下搅拌20 min，加入处方量的大豆油，搅拌20 min，混匀即得米托蒽醌油包水微乳。

米托蒽醌脂质体处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 1%～4%

大豆卵磷脂 200-400mg

胆固醇 20-100mg

pH7.4磷酸盐缓冲溶液 5-30mL

米托蒽醌脂质体制备工艺为：采用薄膜法制备米托蒽醌脂质体。分别称取处方量大豆卵磷脂、胆固醇, 溶解于5 mL无水乙醚中, 抽真空旋转至无水乙醚完全去尽, 加入处方量磷酸盐缓冲液( pH 7.4) 水合至生成均匀的淡黄色乳液, 转入聚丙烯离心管中, 离心管放置在冰浴探头超声3 min( 超声50 s, 停10 s) 。将此淡黄色半透明液体倒入装有已称重的米托蒽醌的圆底烧瓶中, 37 ℃, 旋转混合至生成均匀的蓝黑色胶体溶液。4 ℃保存备用。

米托蒽醌纳米粒处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 0.2-0.4%

磷脂 1.0-5.0%

山嵛酸甘油酯 0.1-5.0 %

硬脂酸聚烃氧酯(S-40) 0.1-1.5 %

注射用水 5-30ml

米托蒽醌纳米粒制备工艺为：采用薄膜分散超声法制备,将处方量山嵛酸甘油酯和磷脂等置于圆底烧瓶中,加氯仿5 mL 使溶解,减压蒸发除尽有机溶剂,在瓶内壁形成均匀薄膜。加入含处方量S-40的MTO 溶液,溶胀薄膜,探头超声(工作5 s ,停55s) 2 min 即可。

米托蒽醌明胶微球处方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 0.1%-0.4%

明胶 0.5-1.5g

蓖麻油 1-10ml

脂肪酸山梨坦-80 1-2ml

36%甲醛 1-5ml

液体石蜡 10-40ml

0.1mol/l盐酸 3-10ml

米托蒽醌明胶微球制备工艺为：以明胶水溶液为分散相 ,蓖麻油为连续相,加入乳化剂,电动搅拌得稳定乳剂,甲醛交联固化制成明胶微球。洗尽甲醛,抽干后过400目筛备用；将主药溶于0.1mol/L HCL溶液，加入上述GMS静置浸入，抽干后过400目筛，得球径范围5.1-25.0μm米托蒽醌明胶微球。

本发明的积极效果是，提供了新的用于淋巴靶向制剂的原料，它毒性低，无过敏，无栓塞，为癌症患者带来福音。

附图说明

附图1为用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液小鼠脚掌注射后一级淋巴结（腘淋巴结）蓝染效果（左图）与市售对照药品—纳米炭混悬注射液（重庆莱美药业有限公司生产，商品名卡纳琳）的小鼠淋巴结蓝染效果（右图）的对比图。图中可见，盐酸米托蒽醌蓝染效果与纳米炭等同，且蓝染更迅速。

附图2为用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液小鼠脚掌注射后二级淋巴结（髂淋巴结）蓝染效果（左图）与市售对照药品—纳米炭混悬注射液（重庆莱美药业有限公司生产，商品名卡纳琳）的小鼠淋巴结蓝染效果（右图）的对比图。图中可见，盐酸米托蒽醌染色更深，效果更好。

附图3为用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液小鼠脚掌注射后三级淋巴结（腹主动脉旁淋巴结）蓝染效果（左图）与市售对照药品—纳米炭混悬注射液（重庆莱美药业有限公司生产，商品名卡纳琳）的小鼠淋巴结蓝染效果（右图）的对比图。图中可见，盐酸米托蒽醌染色更深，效果更好，且染色更加迅速。

附图4为小鼠左脚注射实施例7制备的1%亚甲蓝水溶液，右脚注射实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液的蓝染效果，图中可见盐酸米托蒽醌染色更深，效果更好。

附图5 用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液新西兰大白兔乳腺周围注射的蓝染图片，图中可见，兔乳腺周围淋巴结蓝染效果清晰可见，且周围组织没有发生弥散。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明。

实施例1. 盐酸米托蒽醌注射液的制备

1.1处方

盐酸米托蒽醌 100g

焦亚硫酸钠 5 g

0.1mol/L盐酸调pH约3.5

注射用水加至1000ml

制成200支

1.2制备工艺

含有主药100mg/mL，溶剂采用注射剂用水。制备时可采取溶解法或者稀释法，将主药溶于适量注射用水中，超声使溶解，加适量盐酸调pH约3.5，加入焦亚硫酸钠使溶解,加入0.1%针用活性炭，室温搅拌30min。然后用0.8μm微孔滤膜过滤除碳，0.45μm微孔滤膜精滤，加入二氧化碳饱和的注射用水至全量，检查滤液澄明度，合格后灌装， 5ml每支，熔封。灭菌。测定PH值约为3.5。

实施例2 盐酸米托蒽醌粉针

2.1处方

盐酸米托蒽醌 10mg

甘露醇 1000mg

肌酐 10mg

注射用水加至500ml

制成100支

2.2制备工艺

将上述各成分用适量注射用水溶解后，无菌过滤，分装于安瓿瓶中，每支5ml，冷冻干燥后封口，漏气检查即得。

实施例3 盐酸米托蒽醌乳剂

3.1处方

盐酸米托蒽醌 5%

大豆油 50%

Span 80 – Tween 80 (HLB=8) 35%

Transcutol P 5.4 %

5％葡萄糖溶液 3.6 %

共制100.0 g

3.2制备工艺

精密称取处方量的盐酸米托蒽醌充分溶解于Transcutol P、Span80-Tween80（HLB=8）和5%的葡萄糖溶液的混合液中，在45℃下搅拌20 min，加入处方量的大豆油，搅拌20 min，混匀即得盐酸米托蒽醌油包水微乳。

实施例4 盐酸米托蒽醌脂质体

4.1处方

盐酸米托蒽醌 4%

大豆卵磷脂 400mg

胆固醇 100mg

pH7.4磷酸盐缓冲溶液 30mL

4.2制备工艺

采用薄膜法制备盐酸米托蒽醌脂质体: 分别称取大豆卵磷脂、胆固醇, 溶解于5 mL无水乙醚中, 抽真空旋转至无水乙醚完全去尽, 加入适量磷酸盐缓冲液( pH 7.4) 水合至生成均匀的淡黄色乳液, 转入聚丙烯离心管中, 离心管放置在冰浴探头超声3 min( 超声50 s, 停10 s) 。将此淡黄色半透明液体倒入装有已称重的盐酸米托蒽醌的圆底烧瓶中, 37 ℃, 旋转混合至生成均匀的蓝黑色胶体溶液。4 ℃保存备用。

实施例5 盐酸米托蒽醌纳米粒

5.1处方

盐酸米托蒽醌 0.4%

磷脂 3.0%

山嵛酸甘油酯 1.0 %

硬脂酸聚烃氧酯(S-40) 0. 5 %

注射用水 20ml

5.2制备工艺

采用薄膜分散超声法制备,将山嵛酸甘油酯和磷脂等置于圆底烧瓶中,加氯仿5 mL 使溶解,减压蒸发除尽有机溶剂,在瓶内壁形成均匀薄膜。加入10 mL 含S-40的MTO 溶液,溶胀薄膜,探头超声(工作5 s ,停55s) 2 min 即可。

实施例6 盐酸米托蒽醌明胶微球

6.1处方

盐酸米托蒽醌 0.4%

明胶 1.5g

蓖麻油 1ml

脂肪酸山梨坦-80 1ml

36%甲醛 5ml

液体石蜡 40ml

0.1mol/l盐酸 5ml

6.2制备工艺

以明胶水溶液为分散相 ,蓖麻油为连续相,加入乳化剂,电动搅拌得稳定乳剂,甲醛交联固化制成明胶微球。洗尽甲醛,抽干后过400目筛备用；将米托蒽醌或盐酸米托蒽醌溶于0.1mol/L HCL溶液，加入上述GMS静置浸入，抽干后过400目筛，得球径范围25.0μm盐酸米托蒽醌明胶微球。

实施例7 对照药品1%亚甲蓝水溶液的制备

7.1 处方

亚甲蓝 1%

注射用水加至100ml

7.2制备工艺

称取处方量亚甲蓝，溶于适量注射用水中，超声使溶解，继续加注射用水至全量，混匀即得。

实施例8 盐酸米托蒽醌注射液，粉针，乳剂，脂质体，纳米粒和明胶微球脚掌注射淋巴示踪检查

0-10分代表淋巴结染色情况，根据标准进行打分：

0代表颜色无改变，

5代表淋巴结窦部蓝染，

10代表整个淋巴结或边缘窦蓝染。

根据药效学实验，染色只要达到4分以上，可以起到淋巴示踪的作用。因此确定3级淋巴结染色分数在4分以上（含4分，即15分钟内80%的小鼠达到3级淋巴结），即可判定受试品合格。

取昆明种小白鼠70只，随机分为7组，每组10只。从小鼠的右后脚皮下分别注射用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液，实施例2制备的冻干粉针，实施例3制备的乳剂，实施例4制备的脂质体，实施例5制备的纳米粒，实施例6制备的明胶微球，注射量为10mg/kg。以1%亚甲蓝水溶液（自制）和纳米炭混悬注射液（重庆莱美药业有限公司生产，商品名：卡纳琳）为对照。于给药后15min将小鼠断颈处死，立即解剖出第一级、第二级和第三级淋巴结，即腘淋巴结、髂淋巴结和腹主动脉淋巴结。观察其染色情况，对小鼠的淋巴结染色程度计分。试验结果表明，盐酸米托蒽醌组小鼠的1，2，3级淋巴结染色分数均达到4分以上，即盐酸米托蒽醌组均合格。

实施例9 盐酸米托蒽醌注射液，粉针，乳剂，脂质体，纳米粒和明胶微球乳腺注射淋巴结示踪检查。

取新西兰大白兔70只，随机分为7组，每组10只。取各组白兔第二对乳头基底部为注射部位，在5s内匀速注入染料（分别用用实施例1制备的盐酸米托蒽醌注射液，用实施例2制备的冻干粉针，用实施例3制备的乳剂，用实施例4制备的脂质体，用实施例5制备的纳米粒，用实施例6制备的明胶微球）注射量为10mg/kg。以实施例7制备的1%亚甲蓝水溶液和纳米炭混悬注射液（市售品，商品名卡纳琳，重庆莱美药业有限公司）为对照。观察注射不同染料后第一站淋巴结和第二站淋巴结的染色时间，染色枚数，淋巴结褪色时间等。试验结果如下。

由试验结果可知，同亚甲蓝和纳米炭相比，盐酸米托蒽醌各种制剂具有染色迅速，定位准确的优点，且褪色较慢，适于临床手术的需要，是一种特性优良的淋巴示踪剂，适于推广应用。

Claims

1.米托蒽醌作为淋巴示踪诊断剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述米托蒽醌包括原形形式及其形成的盐类。

3.根据权利要求2所述的米托蒽醌盐类，包括盐酸米托蒽醌，草酸米托蒽醌，硫酸米托蒽醌，磷酸米托蒽醌，醋酸米托蒽醌，枸橼酸米托蒽醌等。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的米托蒽醌及其盐类可制成注射液，粉针，乳剂，脂质体，微球，纳米粒等制剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于用于癌症中的淋巴示踪方面的应用。

6.根据权利要求1或5所述的应用，其特征在于所述癌症包括胃癌，乳腺癌，肠癌，宫颈癌，睾丸癌等。

7.根据权利要求4所述的注射液，其特征在于组方为：

米托蒽醌或其盐类取其一 0.5～100g

抗氧剂 1-10g

pH调节剂调节pH约3.5～5.5

溶剂加至1000ml。

8.根据权利要求7所述的组方，其特征在于所述抗氧剂为焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠，所述溶剂为注射用水或氯化钠溶液或葡萄糖溶液。

9.根据权利要求7所述的组方，其特征在于所述PH调节剂为盐酸，磷酸，硫酸，草酸，醋酸或枸橼酸。

10.根据权利要求7所述的米托蒽醌注射液的制备工艺为：采取溶解法或者稀释法，将处方量主药溶于适量溶剂中，超声使溶解，用适量pH调节剂调节pH约3.5～5.5，加入抗氧剂使溶解,加入0.1%-0.5%针用活性炭，室温搅拌10-30min；然后用0.8um微孔滤膜过滤除碳，0.45um微孔滤膜精滤，加入二氧化碳饱和的注射用水至全量，检查滤液澄明度，合格后灌装，1-10ml每支，熔封，灭菌，测定PH范围在3.5～5.5之间。