CN102369436A - 用于检测jc多瘤病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的方面涉及用于确定受试者是否处于发生PML的风险中的方法和组合物，包括用免疫抑制剂治疗受试者。本发明提供了通过确定受试者是否含有具有相对于正常JCV减弱的对唾液酸的结合的JCV变体来确定所述受试者是否对PML易感。本发明的方面还提供了JCV-VP1序列变异的组合，其与PML相关并且可用作用于鉴定响应免疫抑制治疗的对PML易感的受试者、患有PML的受试者(例如，早期PML)或处于发生PML的风险中的受试者的测定法的基础。本发明还提供了用于鉴定候选治疗剂和评估PML的治疗方案的测定法。

Description

用于检测JC多瘤病毒的方法
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2009年2月5日提交的标题为“Methods for the Detection of JC Polyoma Virus”的第61/150,310号美国临时申请的利益，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及检测人JC多瘤病毒、诊断进行性多灶性白质脑病(PML)和开发用于PML的治疗剂的方法。
发明背景
人的JC多瘤病毒(JCV)感染可引发中枢神经系统的脱髓鞘病，进行性多灶性白质脑病(PML)。然而，JCV感染通常在健康受试者中不导致PML。JCV感染在许多人群中流行而不引发广泛的PML。PML通常只在JCV感染的受试者(所述受试者也具有衰弱的免疫系统)中发展。因疾病或免疫抑制疗法而引起免疫受损的受试者可易受与JCV感染相关的PML伤害。
发明概述
本发明的方面涉及用于确定受试者对PML是否易感的方法和组合物。具体地，本发明提供了用于确定当受试者的免疫系统受损或被抑制时，受试者是否处于发展PML的风险中的方法和组合物。例如，本发明的方面涉及通过测定受试者发生由JCV感染引发的发展PML的风险特征来确定受试者是否适合利用免疫抑制试剂的初始或连续治疗。
将人基因组在个体的生命期中与许多病毒接触，所述基因可获得许多病毒。这样的病毒的一个实例是JC多瘤病毒(JCV)。JC病毒感染在人中是十分普遍的。JCV的原发感染在儿童期中无症状地发生(Padgett &Walker，1973)。随后JCV通过身体散播，可能通过病毒血症散播(Ikegaya等人，2004)。JCV据认为主要存留在脑和肾组织中。虽然JCV引发的感染在大多数受试者中是无症状的，但感染在一些受试者中可导致严重的病症(如PML)和甚至死亡。对PML最易感的受试者是免疫受损的受试者(例如，AIDS患者)或正在经历使用免疫抑制剂(例如在器官移植后或为了治疗炎症相关病症例如多发性硬化)的治疗的受试者。本发明提供了JCV变体，鉴定了一实验对象组变体(包括与增加的PML风险相关的新型变体)，以及提供了涉及JCV变体与PML之间的结构和功能联系的发现的方法。
“野生型”JCV序列在本文中用于指在未患有PML和/或未处于发生PML的风险中的健康受试者中发现的任何原始型JCV的序列。在某些实施方案中，共有“野生型”参照序列可以是在一组健康个体中发现的平均序列。高病毒流行与PML的低发病率之间的矛盾暗示除了免疫功能障碍外，还可能存在一些调节从无症状感染至PML的进展的独特病毒特征。在某些实施方案中，本发明的方面涉及发现：负责病毒与细胞受体相互作用和宿主细胞感染的病毒表面蛋白质的部分在患者中在从肾(无症状感染的部位)至CNS(PML的部位)的路径的某个地方获得特定氨基酸突变。此外，在某些实施方案中，PML特异性突变改变了病毒衣壳结合不同唾液酸和多种周围细胞类型的能力但保持结合CNS胶质细胞的能力。
基于公布的来自PML和非PML患者的VP1序列的数学分析，提供了PML过程中的特定氨基酸变体的阳性选择。然而，由于公共可获得的PML序列获自PML患者的CSF或脑组织而非PML序列获自健康受试者的尿，因此仅基于Genebank样本的分析不能明确无误地证明此类氨基酸变体是通过病毒在患者中突变产生的还是代表存在于所有JCV分化枝中并且因更可能引发PML而在PML案例中富集(例如，被阳性选择)的一种或多种罕见病毒变体。根据本发明的方面，VP1置换存在于患者中并且可导致PML。这得到在相同时间点上采集的相同患者的匹配的尿-CSF和尿-血浆样本的分析的支持。来自PML患者的CSF和血浆VP1序列相对于从相同患者的尿分离的VP1序列包含单个氨基酸置换或数个氨基酸的缺失。如本文中所显示的，相同个体的CSF、血浆和尿中发现的JC病毒类型是相同的病毒株系，然而不同的患者具有不同的株系。因此，但不希望受理论束缚，VP1氨基酸置换在CSF中但非尿中的存在是因突变在患者中出现而非因使用两种不同病毒变体的双重感染所致。
先前描述了一些在PML患者的CSF和血浆中检测到的氨基酸置换。然而，未曾使此类置换与增加的PML风险直接关联并且未曾使它们的结构和功能性质与PML发展和进展的方面联系起来。本文中还提供了与PML相关的另外的JCV VP1突变和/或缺失。
根据本发明的方面，VP1蛋白中的置换可能对于测定早期疾病进展(例如，通过使病毒能够从周围迁移至CNS并且感染CNS细胞)而非测定不同临床背景中的不同结果更重要。然而，在某些实施方案中，存在于VP1中的突变的类型与某些临床测量之间可能存在关联。例如，在具有非突变病毒或在位点122-134上携带突变/缺失的病毒的患者中观察到更低的JCV CSF复制水平。还可能由于突变影响病毒与细胞受体的相互作用的强度，从而病毒从死亡细胞的释放也可因紧密结合此类受体的病毒而受到阻碍。因此，可发现具有更弱的细胞结合亲合力的病毒被更大量地释放进入细胞外隙。这与这样的观察相一致，即位点55-61和265-271上的突变体相对于非突变病毒丧失了它们结合唾液酸受体的能力，从而可能具有从细胞碎片分离(在病毒杀死宿主细胞后)并且到达CSF的更好的能力。
因此，即使受试者可被几种不同形式的JCV(例如，在不同的组织或器官中利用不同变体)同时感染，PML相关突变仍然更可能由已被野生型JCV感染的个体中存在的JCV病毒群体产生。
本发明的方面至少部分基于发现：JCV衣壳蛋白中某些类型的突变与JCV感染的无症状形式至JCV的PML相关形式的转化相关。根据本发明的方面，不限定于任何特定的机制，破坏JCV颗粒结合或与唾液酸相互作用的能力的突变可导致病毒不再限制于受试者的周围隔室中并且导致病毒获得至CNS(PML疾病的位置)的自由通道。在某些实施方案中，此类突变允许病毒通过避开在周围器官和细胞(包括但不限于免疫细胞和红细胞)中表达的某些糖蛋白和糖脂假受体上的“捕获”来实现该转变。此外，由于此类位点的一些位点是正常宿主免疫应答(抗体和T细胞)上的靶，因此此类突变可允许病毒避开免疫系统的识别，特别地在具有减弱的免疫系统的受试者中。
本发明的方面提供了用于评估受试者的PML的风险特征的方法和组合物。
在某些实施方案中，本发明的方面涉及确定受试者是否已暴露于JCV变体引发的感染。在某些方面中，野生型JCV变体引发的感染可增强PML的风险特征，因为PML相关突变可由野生型JCV产生，即使这些突变可以是罕见事件。因此，在某些实施方案中，可测试受试者的JCV感染的一个或多个标记的存在(例如，病毒蛋白质或核酸的检测，或间接地通过针对JCV感染的免疫应答(例如以针对JCV病毒蛋白的血清抗体的形式)的检测)。应当理解可评估任何JCV感染(例如，野生型或变体)的标记。如果受试者已暴露于JCV感染，那么可将受试者鉴定为比非感染受试者具有更高的风险特征。因此，可评估JCV感染的受试者的特定JCV突变或可比非感染受试者更频率地监控JCV感染的受试者，所述JCV感染的受试者正在接受免疫抑制剂的治疗。
在某些实施方案中，对正在利用免疫抑制剂治疗(或将要用免疫抑制剂开始治疗)的受试者测试JCV感染的一个或多个标记。如果检测到JCV感染的一个或多个标记，那么可评估受试者的如本文中描述的与PML相关的一个或多个JCV变体的存在。如果未检测到JCV的标记，可随时间的过去例如每4周1次、每月1次、每3个月1次、每6个月1次或每12个月1次监控受试者的JCV感染的任何标记的存在。如果检测到JCV感染，则进一步评估受试者的一个或多个JCV变体的存在。如果检测到与增加的PML风险相关的JCV变体，那么可进一步监控受试者以检测PML的任何早期体征和/或可如本文中更详细描述的改变治疗方案。
在一个方面中，本发明提供了包括检查来自受试者的生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基122的置换)的至少一个标记的方法，并且其中如果样本包含至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在一个方面中，本发明提供了包括检查来自受试者的生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基2的置换)的至少一个标记的方法，并且其中如果样本包含至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在一个方面中，本发明提供了包括检查来自受试者的生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基66的置换)的至少一个标记的方法，并且其中如果样本包含至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在一个方面中，本发明提供了包括检查来自受试者的生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基283的置换)的至少一个标记的方法，并且其中如果样本包含至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基2和66的至少一个的置换)的至少一个标记的方法。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基122和66的至少一个的置换)的至少一个标记。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白包含氨基酸残基2和122的至少一个的置换)的至少一个标记。在某些实施方案中，使用能够检测各个变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白具有氨基酸残基2、66和122的至少一个的置换)的至少一个标记的测定法检查样本，并且其中如果样本包含变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。在某些实施方案中，使用够检测各个变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白具有氨基酸残基2、66、122和283的至少一个的置换)的至少一个标记的测定法检查样本，并且其中如果样本包含变体JCVVP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段50-51的缺失)的至少一个标记。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段54-55的缺失)的至少一个标记。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段123-125的缺失)的至少一个标记。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段125-134的缺失)的至少一个标记。在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段125-136的缺失)的至少一个标记。
在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白包含氨基酸片段50-51、54-55和123-125中的一个或多个的缺失)的至少一个标记。在某些实施方案中，使用能够检测各个变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白具有氨基酸片段50-51、54-55和123-125的至少一个的缺失)的至少一个标记的测定法检查样本，并且其中如果样本包含变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的疑似具有低唾液酸结合的变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记。
在某些实施方案中，所述方法还包括检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白(所述衣壳蛋白具有氨基酸残基55、60、265、267和269的至少一个的置换)的至少一个标记。在某些实施方案中，使用能够检测各个变体JCV VP1衣壳蛋白(所述蛋白具有氨基酸残基55、60、265、267和269的至少一个的置换)的至少一个标记的测定法检查样本，并且其中如果样本包含变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
在某些实施方案中，生物样本是血液样本。在某些实施方案中，生物样本是CSF样本。在某些实施方案中，生物样本是尿样本。
在某些实施方案中，已知受试者先前已被野生型JCV感染。在某些实施方案中，每年检查来自受试者的新生物样本的至少一种变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记至少2次。在某些实施方案中，每天1次、每周1次、每月1次、每2个月1次、每季1次、每年2次、每年1次、每2年1次或每5年1次或以其之间的任意频率检查来自受试者的新生物样本的至少一种变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记。
在某些实施方案中，将变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)标记的检测用于将受试者鉴定为不适合于进行免疫抑制治疗。在某些实施方案中，将变体JCV VP1衣壳蛋白的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个标记的检测用于将受试者鉴定为不适合于进行免疫抑制治疗。
在某些实施方案中，变体JCV VP1衣壳蛋白的至少1个标记的检测用于为受试者推荐免疫抑制疗法的改进。在某些实施方案中，将变体JCVVP1衣壳蛋白的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个标记的检测用于为受试者推荐免疫抑制疗法的改进。
在某些实施方案中，变体JCV VP1衣壳蛋白的标记的不存在用于将受试者鉴定为适合于进行免疫抑制治疗。
在某些实施方案中，变体JCV VP1衣壳蛋白的标记的不存在用于将受试者鉴定为适合于进行连续免疫抑制治疗。
在某些实施方案中，检查生物样本的对变体JCV VP1衣壳蛋白特异的抗体的存在。
在某些实施方案中，检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白的存在。
在某些实施方案中，检查生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白的存在。
在某些实施方案中，检查生物样本的编码变体JCV VP1衣壳蛋白的核酸序列的存在。
在某些实施方案中，使用基于ELISA的分析检查生物样本。
因此，在某些实施方案中，可筛查受试者以确定他们是否处于发展PML的风险中。在某些实施方案中，可筛查受试者以在疾病进展至严重临床病症之前检测早期PML。可通过检查获自受试者的生物样本暴露于JCV的PML相关变体(例如经预测具有减弱的与唾液酸的结合的JCV变体)的标记来测定所述受试者的PML风险或早期PML。本发明提供了与PML风险和/或PML疾病进展相关的主要JC病毒衣壳蛋白(JCV-VP1)中的特定位点。在某些实施方案中，基于受试者所暴露于的JC病毒的VP1蛋白的一个或多个所选择的位点上的突变状态来测定受试者发生PML的风险特征。
本发明的方面用于检测易感受试者(例如免疫受损的和/或正利用免疫抑制试剂治疗的患者)的PML风险或早期疾病进展。
因此，在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者对PML易感的方法。在某些实施方案中，所述方法包括确定：如果受试者含有疑似具有低唾液酸结合特性(例如，亲合力或亲和力)的JCV变体，则所述受试者对PML易感。
在某些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体，并且如果受试者含有所述JCV变体，则将所述受试者鉴定为对PML易感。在某些实施方案中，所述方法包括测试受试者的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的存在，并且如果检测到疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的存在，则将所述受试者鉴定为对PML易感。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者适合于进行免疫抑制治疗的方法。在某些实施方案中，方法包括确定当受试者不含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体时，受试者适合于进行免疫抑制治疗。在某些实施方案中，方法包括确定受试者是否含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体，并且如果受试者不具有JCV变体，则将受试者鉴定为适合于进行免疫抑制治疗，或如果受试者具有JCV变体，则将受试者鉴定为适合于进行免疫抑制治疗。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者不适合于进行免疫抑制治疗的方法。在某些实施方案中，方法包括确定：如果受试者含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体，则受试者不适合于进行免疫抑制治疗。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，确定包括测定来自受试者的生物样本的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的标记。在本文中提供的方法的某些实施方案中，生物样本是尿样本、血液样本、血浆、血清、粘膜拭子(mucosal swab)或CSF样本。本文中提供的方法的某些实施方案中，标记是可特异性结合疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的抗体的存在。本文中提供的方法的某些实施方案中，标记是与疑似具有低唾液酸结合的JCV多肽变体相关的核酸序列的存在，其中所述核酸序列不存在于野生型JCV中。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，测定包括将生物样本与JCV肽接触并且评估样本的JCV变体或JCV肽变体的存在。在本文中提供的方法的某些实施方案中，测定包括将生物样本与JCV肽接触并且评估样本的JCV抗体的存在。在本文中提供的方法的某些实施方案中，测定包括对生物样本进行PCR反应并且评估样本的JCV核酸变体的存在。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，免疫抑制治疗包括施用免疫抑制药物。在本文中提供的方法的某些实施方案中，免疫抑制治疗包括施用抗VLA4抗体。在本文中提供的方法的某些实施方案中，免疫抑制药物是那他珠单抗。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，疑似具有低唾液酸结合的JCV变体是在JCV唾液酸结合位点中包含一个或多个突变型JCV变体。在本文中提供的方法的某些实施方案中，JCV唾液酸结合位点中的突变为L55F、K60M、K60E、K60N、N265D、N265T、S267F、S267L、S269F、S269Y或S269C。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，JCV的低唾液酸结合低于WT JCV的唾液酸结合。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，受试者需要利用免疫抑制药物的治疗或受试者正在利用免疫抑制药物治疗。
在一个方面中，本发明提供了包括从受试者获得生物样本，测定生物样本的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的标记的方法，其中如果生物样本包含JCV变体的标记，那么受试者被鉴定为对PML易感。
在一个方面中，本发明提供了包括从受试者获得生物样本，测定生物样本的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的标记的方法，其中i)如果生物样本不包含JCV变体的标记，那么受试者被鉴定为适合进行免疫抑制治疗，ii)如果生物样本包含JC V变体的标记，那么受试者被鉴定为不适合于进行免疫抑制治疗。
在一个方面中，本发明提供了包括监控接受免疫免疫抑制治疗的受试者含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的方法。
在一个方面中，本发明提供了包括监控接受免疫抑制治疗的受试者暴露于JCV的体征以及如果检测到暴露于JCV的体征，则监控所述受试者的含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的方法。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，监控包括定期获得并分析来自受试者的生物样本的JCV变体的标记。
在一个方面中，本发明提供了包括从受试者获得生物样本，测定生物样本的JCV的标记，其中如果生物样本包含JCV的标记，那么定期监控受试者的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的存在，并且其中如果临床样本不包含JCV，那么定期监控的受试者的JCV暴露。
在一个方面中，本发明提供了确定是否应当改进用于给受试者施用免疫抑制试剂的治疗方案的方法，所述方法包括从受试者获得生物样本，测定生物样本的疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的标记，其中如果生物样本具有JCV变体的标记，那么应当改进针对受试者的治疗方案。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，应当通过施用更低剂量的免疫抑制试剂，用不同的免疫抑制试剂替换免疫抑制试剂或停止施用免疫抑制试剂来改进治疗方案。
在一个方面中，本发明提供了包括给受试者施用第一免疫抑制药物以及监控受试者是否含有疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的方法。在本文中提供的方法的某些实施方案中，如果受试者含有所述JCV变体，那么减少第一免疫抑制药物的施用剂量和/或频率。在本文中提供的方法的某些实施方案中，如果受试者含有所述HCV变体，那么用第二免疫抑制药物替换第一免疫抑制药物。在本文中提供的方法的某些实施方案中，如果受试者含有所述JCV变体，那么筛查受试者的PML的症状。在本文中提供的方法的某些实施方案中，如果受试者含有所述JCV变体，那么治疗受试者的PML。
在一个方面中，本发明提供了检测疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的方法，所述方法包括使用对疑似具有低唾液酸结合的JCV变体的标记特异的高灵敏度测定法检查来自受试者的生物样本。在本文中提供的方法的某些实施方案中，检查包括将生物样本与可特异性结合JCV变体的抗体接触。在本文中提供的方法的某些实施方案中，检查包括将生物样本与JCV变体多肽接触。
在本文中提供的方法的某些实施方案中，检查包括将生物样本与JCV变体核酸接触。
本发明的方面包括JCV-VP1氨基酸位点的实验对象组，所述氨基酸位点上的序列变异与PML风险和/或疾病进展相关。提供了用于筛查受试者以鉴定已暴露于在实验对象组中的一个或多个VP-1氨基酸位点上具有PML相关序列变异的变异JC病毒的个体的方法和组合物。
本发明的方面可用于诊断PML，或用于评估和/或监控受试者的PML疾病进展、消退和/或状态。
本发明的某些方面涉及评估PML的治疗性治疗。
本发明的其它方面涉及针对PML相关JC病毒变体的疫苗。
在一个方面中，本发明提供了确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记。在某些实施方案中，测定法检查选自表1A的位点69、74、75、113、117、128、134、158、164、223、271、321、332和345的至少一个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记。在某些实施方案中，测定法检查一个位点的序列变异的存在。在某些实施方案中，所述位点是位点164。在某些实施方案中，如果序列变异存在于位点164上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1A的位点的至少8个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1A的位点的至少8个JCV-VP1位点的序列变异的存在，其中序列变异是如下变异之一：55F、60M、60E、61L、66H、66N、69D、74S、75R、113L、117S、123C、128A、134G、158L、164K、223A、265D、265T、267F、267L、269F、269Y、271H、321V、332E或345K，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在某些实施方案中，可检查表1A的超过8个位点。在某些实施方案中，检查9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1B的位点的至少5个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在某些实施方案中，可检查表1B的超过5个位点。在某些实施方案中，检查6或7个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1C的位点的至少4个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1D的位点的至少2个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在某些实施方案中，可检查表1D的超过2个位点。在某些实施方案中，检查3、4或5个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1F的位点的至少2个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在某些实施方案中，可检查表1F的超过2个位点。在某些实施方案中，检查3或4个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1G的位点的至少8个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在某些实施方案中，可检查表1G的超过8个位点。在某些实施方案中，检查9、10、11、12、13、14或15个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于对变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1H的位点的至少1个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。在某些实施方案中，检查表1H中的两个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1H的位点的至少1个JCV-VP1位点的序列变异的存在，其中序列变异是下列115E或277K之一，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在某些实施方案中，检查表1H中的2个位点。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的所选择的区域中的位点的序列变异的存在，并且其中如果少于所选择的序列变异的数目存在于所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75和265-271的序列变异的存在，并且其中如果少于2个序列变异存在于所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75、113-164、223，265-277和321-345的序列变异的存在，并且其中如果少于3个序列变异存在于所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75、113-164、223、265-277和321-345的序列变异的存在，并且其中如果少于2个序列变异存在于所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查位点164和选自表1A中的位点的至少一个其它JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于一个或多个所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查位点164和选自表1A中的位点的至少一个其它JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果序列变异存在于2个或更多个所检查的位点上，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的所选择的区域中的位点的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上存在的具有特定特征的氨基酸的数目已增加，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。在某些实施方案中，特定特征是非极性的。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75和265-271的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上存在的非极性氨基酸变体(Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Pro)或芳香族变体(Phe、Tyr或Trp)的总数已增加，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JC V-VP1的至少位点55-75、113-164、223、265-277和321-345的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上存在的非极性氨基酸变体或芳香族变体的总数已增加，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75和265-271的序列变异的存在，并且其中如果所检查的位点上的一个或多个序列变异导致每序列变异10平方埃或更大的非极性表面积的增加，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的所选择的区域中的位点的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上存在的具有特定特征的氨基酸的数目已减少，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。在某些实施方案中，特定特征是极性的。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75和265-271的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上存在的极性氨基酸变体(Ser、Thr、Cys、Met、Asn或Gln)或带正电荷的变体(Lys、Arg或His)或带负电荷的变体(Asp或Glu)的总数已减少，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75、113-164、223、265-277和321-345的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的位点上的极性氨基酸变体、带正电荷的变体或带负电荷的变体的总数已减少，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括：测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查JCV-VP1的至少位点55-75和265-271的序列变异的存在，并且其中如果所检查的位点上的一个或多个序列变异导致每序列变异10平方埃或更大的极性表面积的减小，那么所述受试者被鉴定为处于发生PML的风险中或患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于检查所选择的JCV-VP1位点的生物样本的序列变异的方法。
在某些实施方案中，检查所选择的JCV-VP1位点的序列变异包括确定一种或多种特异性结合多肽的抗体存在于生物样本，所述多肽包含选自表1A或1H的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异。在某些实施方案中，通过特异性结合重组产生的多肽来确定一种或多种抗体的存在，所述多肽包含一个或多个氨基酸序列变异。在某些实施方案中，通过与合成产生的多肽的特异性结合来确定一种或多种抗体的存在，所述多肽包含一个或多个氨基酸序列变异。
在某些实施方案中，检查所选择的JCV-VP1位点的序列变异包括确定一种或多种多肽存在于生物样本中，所述多肽包含选自表1A或1H的一个或多个氨基酸序列变异。在某些实施方案中，通过多肽对一种或多种肽结合试剂的特异性结合来检测一种或多种多肽的存在。在某些实施方案中，肽结合试剂是抗体。
在某些实施方案中，检查所选择的JCV-VP1位点的序列变异包括确定编码选自表1A或1H的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的核酸在生物样本中的存在。
在某些实施方案中，在血液、脑脊髓液、血清、尿、痰、骨髓、脑、脾或肾或其它组织的样本中检查所选择的JCV-VP1位点的序列变异。
在某些实施方案中，用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中暴露于变体JCV包括变体JCV引起的当前感染。
在某些实施方案中，用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，暴露于变体JCV包括先前感染，或在受试者的血液或尿中检测不出变体JCV。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1F的位点的至少2个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的序列的位点之一上不存在序列变异，那么受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有所述疾病的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物样本的暴露于变异JC多瘤病毒的标记，其中测定法检查选自表1G的位点的至少2个JCV-VP1位点的序列变异的存在，并且其中如果在所检查的序列的位点之一上不存在序列变异，那么受试者被鉴定为处于发生PML的低风险中或不患有PML。
在一个方面中，本发明提供了用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1A、表17和/或表18的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽和/或本文中描述的一个或多个其它变体，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1B的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1C的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1D的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1F的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1G的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含选自表1H的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在某些实施方案中，用于诊断受试者是否处于发生PML的风险中的试剂盒包括一个或多个容器，各容器装有包含在位点164上的氨基酸序列变异的多肽，并且所述试剂盒还包括使用所述多肽确定特异性结合此类多肽的抗体的存在的说明书。
在一个方面中，本发明提供了用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，方法包括测定获自受试者的第一生物样本中变体JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目，测定在比获得第一样本更晚的时间从受试者获得的第二生物样本中变体JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目，将第一样本中序列变异的数目与第二样本中序列变异的数目相比较，其中第一样本中序列变异的数目比第二样本中序列变异的数目少表示PML在受试者中的发作或进展，并且其中第一样本中序列变异的数目比第二样本中序列变异的数目多表示PML在受试者中的消退。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1A的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1B的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1C的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1D的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1F的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，序列变异选自表1G的位点。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，通过将变体JCV-VP1与野生型JCV-VP1相比较来确定序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，所述方法包括确定序列变异是否存在于获自受试者的第一生物样本中的变体JCV-VP1中的位点164上，确定序列变异是否存在于在比获得第一样本更晚的时间从受试者获得的第二生物样本中的变体JCV-VP1中的位点164上，其中第一样本中序列变异的不存在和第二样本中序列变异的存在表示受试者的PML的发作或进展，并且其中第一样本中序列变异的存在和第二样本中序列变异的不存在表示受试者的PML的消退。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法还包括通过在更晚的时间点上从受试者获得另外的样本、测定此类样本中JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目、以及将此类样本中的序列变异的数目与一个或多个先前样本中的序列变异的数目相比较，来另外监控受试者的PML的发作、进展或消退。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，在受试者进行利用免疫抑制剂的治疗的同时监控受试者。在某些实施方案中，免疫抑制剂为那他珠单抗。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的一个实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的第一生物样本中变体JCV-VP1的病毒载量，测定在比获得第一样本更晚的时间从受试者获得的第二生物样本中变体JCV-VP1的病毒载量，将第一样本中的病毒载量与第二样本中的病毒载量相比较，其中第一样本中的病毒载量比第二样本中的病毒载量低表示受试者的PML的发作或进展，并且其中第一样本中的病毒载量比第二样本中的病毒载量高表示受试者的PML的消退。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1A的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1B的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1C的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1D的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1F的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含选自表1G的位点的一个或多个序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述变体JCV-VP1包含位点164上的序列变异。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，将变异JCV-VP1的病毒载量与野生型JCV-VP1的病毒载量相比较。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，所述方法还包括过通过在更晚的时间点上从受试者获得另外的样本、测定此类样本中变体JCV-VP1的病毒载量、以及将此类样本的病毒载量与一个或多个先前样本中的病毒载量相比较，来另外的监控受试者的PML的发作、进展或消退。
在用于确定受试者的PML的发作、进展或消退的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定变异JCV-VP1的病毒载量，在所述受试者进行利用免疫抑制剂的治疗的同时监控受试者。在某些实施方案中，免疫抑制剂为那他珠单抗。
在一个方面中，本发明提供了监控受试者的对PML的治疗的反应的方法。
在用于监控受试者的对PML的治疗的反应的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的第一生物样本中的JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，给受试者施用PML治疗，测定第二样本中的JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，其中在治疗后和在比第一样本更晚的时间从受试者获得第二样本，并且将第一样本中氨基酸序列变异的数目与第二样本中氨基酸序列变异的数目相比较，其中第二样本中氨基酸序列变异的数目与第一样本中的少表示受试者对PML治疗起反应。
在用于监控受试者的对PML的治疗的反应的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的第一生物样本中的JCV变体的病毒载量，给受试者施用PML治疗，测定第二样本中JCV变体的病毒载量，其中在治疗后和在比第一样本更晚的时间获得第二样本，并且将第一样本中的病毒载量与第二样本中的病毒载量相比较，其中第二样本中的病毒载量与第一样本中的少表示受试者对PML治疗起反应。
在一个方面中，本发明提供了用于选择患有或疑似患有PML的受试者的疗程的方法。
在用于选择患有或疑似患有PML的受试者的疗程的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的生物样本中的JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，将所述序列变异的数目与序列变异的对照数目相比较，至少部分基于样本中序列变异的数目与序列变异的对照数目相比较的差异确定PML的分期，以及选择适合于受试者的PML分期的用于受试者的疗程。
在用于选择患有或疑似患有PML的受试者的疗程的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的生物样本中JCV变体的病毒载量，将所述病毒载量与对照样本中的病毒载量相比较，至少部分基于样本中的病毒载量与对照样本中的病毒载量相比较的差异确定PML的分期，以及选择适合于受试者的PML分期的用于受试者的疗程。
在一个方面中，本发明提供了用于决定或帮助决定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的方法。
在用于决定或帮助决定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自样本的生物样本中的JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，将所述序列变异的数目与序列变异的参照数目相比较，至少部分基于样本中序列变异的数目与序列变异的对照数目相比较的差异确定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的决定。
在用于决定或帮助决定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的生物样本中JCV变体的病毒载量，将所述病毒载量与对照样本中的病毒载量相比较，至少部分基于样本中的病毒载量与对照样本相比较的差异确定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的决定。
在用于决定或帮助决定中断利用一种或多种免疫抑制剂对受试者的治疗的方法的某些实施方案中，免疫抑制剂为那他珠单抗。
在一个方面中，本发明提供了用于鉴定候选治疗化性合物的方法。
在用于鉴定候选治疗化性合物的方法的某些实施方案中，所述方法包括将包含选自表1A、表17和/或表18的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的分离的多肽和/或本文中描述的一个或多个其它变体与化合物接触，以确定所述化合物是否结合所述分离的多肽，其中如果化合物结合分离的多肽，那么所述化合物是修饰治疗性化合物。
在一个方面中，本发明还提供了通过接触包含选自表1A、表17和/或表18的实验对象组的一个或多个氨基酸序列变异的分离的多肽和/或本文中描述的一个或多个其它变体而得以鉴定的候选治疗性化合物。
在用于鉴定候选治疗化性合物的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的第一生物样本中的JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，施用化合物，测定在施用化合物后的时间从受试者获得的第二样本中JCV-VP1的氨基酸序列变异的数目，其中如果第二样本中JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目少于第一样本中的数目，那么所述化合物是候选治疗性化合物。
在一个方面中，本发明还提供了通过测定获自受试者的第一生物样本的JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目，施用化合物，然后测定在施用化合物后的时间从受试者获得的第二样本中JCV-VP1中的氨基酸序列变异的数目而得以鉴定的候选治疗性化合物。
在用于鉴定候选治疗化性合物的方法的某些实施方案中，所述方法包括测定获自受试者的第一生物样本中JCV变体的病毒载量，施用化合物，测定在施用化合物后的时间从受试者获得的第二生物样本中JCV变体的病毒载量，其中如果第二样本中的病毒载量低于第一样本，那么所述化合物是候选治疗性化合物。
在一个方面中，本发明还提供了通过测定获自受试者的第一生物样本中JCV的病毒载量，施用化合物，以及测定在施用化合物后的时间从受试者获得的第二样本中JCV变体的病毒载量而得以鉴定的候选治疗性化合物。
在一个方面中，本发明还提供了疫苗，所述疫苗包含在选自表1A、表17和/或表18的位点的一个或多个JCV-VP1位点上具有序列变异的多肽和/或本文中描述的一个或多个其它变体。在某些实施方案中，疫苗包含两种或更多种多肽，所述多肽在选自表1A中的位点的一个或多个JCV-VP1位点上具有序列变异。在某些实施方案中，疫苗还包含佐剂。
在一个方面中，本发明还提供了免疫受试者以抗PML的方法，所述方法包括施用疫苗，所述疫苗包含在选自表1A、表17和/或表18中的位点的一个或多个JCV-VP1位点上具有序列变异的一种或多种多肽和/或本文中描述的一种或多种其它变体。
在一个方面中，本发明还提供了特异性结合多肽的分离的抗体，所述多肽在选自表1A中的位点的一个或多个JCV-VP1位点上具有序列变异。在某些实施方案中，所述多肽在选自表1A、表17和/或表18的位点的JCV-VP1位点上具有2、3、4、5或更多个序列变异和/或具有本文中描述的一个或多个变体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在某些实施方案中，抗体特异性结合包含至少一种含有本文中描述的序列变异的VP1多肽的VP1颗粒。可使用本领域内已知的方法，通常通过表达包含本文中描述的变体的重组VP1多肽来产生用于本发明的VP1颗粒。VP1颗粒包含至少2、4、10、20、30、40或50个VP1多肽。在某些实施方案中，VP1颗粒只包含含有变体的VP1多肽。在其它实施方案中，VP1颗粒是含有超过1种VP1多肽序列，例如超过1种变异多肽或至少一个变异多肽和至少一种野生型多肽的异源颗粒。
本发明还包括分离的核酸序列，所述核酸序列编码VP1多肽变体(例如，包含表1A-1H、表17和/或表18中描述的一个或多个变体和/或本文中描述的一个或多个其它变体)或这样的多肽的肽，所述多肽或肽包括VP1多肽的唾液酸结合区域。在某些情况下，本发明包括有效地连接至异源表达对照序列的这样的分离的核酸序列。本发明还包括包含此类核酸序列的瞬时或稳定转染的载体和宿主细胞。用于产生此类序列、载体和宿主细胞的方法在本领域内是已知的。
本发明的每一个限制可包括本发明的各种实施方案。因此，预期包括任何一个元素或元素的组合的本发明的每一个限制可包含在本发明的每一个方面中。本发明不限定于其至下列描述中所示的或附图中举例说明的成分的组织和排列的详细内容的应用。本发明能够包括其它实施方案和能够以不同的方式实施或进行。此外，本文中使用的措辞和术语是为了描述目的并且不应当被认为是限定的。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“包涵”和其变化形式意指包括下文中所列的项和其等同物以及另外的项。
附图概述
图1显示参照JCV-VP1序列与SV40COA序列的比较；
图2显示JCV-VP1的模型；
图3显示VP1肽序列；
图4显示PML相关病毒的系统发生分布；
图5显示JCV VP1/NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖复合物的结构模型；
图6显示病毒样颗粒的质量；
图7显示WT JCV结合某些聚糖类；
图8显示所选择的神经节苷脂类的结构和它们结合WT JCV的能力；
图9显示F55和F269突变不能结合Neu5Acα(2-3)和α(2-6)聚糖类；
图10显示所选择的神经节苷脂类的结构和它们结合突变JCV的能力；
图11比较JCV的WT与突变型结合所选择的神经节苷脂类的能力；
图12显示突变型JVC仍然能够结合神经胶质细胞系；
图13显示突变体特异性JCV抗体可与WT JCV抗体区分；
图14显示用于区分突变型抗体与WT的测定法；
图15比较突变型JCV与WT JCV抗体的其结合突变型JCV-VLP的能力；
图16比较突变型JCV与WT JCV抗体的其结合突变型JCV-VLP的能力；
图17显示具有F269突变病毒的患者已产生针对WT病毒但不针对F269突变病毒的抗体反应；
图18显示用非突变型VLP免疫的兔(上图)产生针对可获得突变的位点(在该情况下为S269)的抗体；
图19显示与具有DE环的突变或不具有突变的患者中相比较在具有BC和HI环的突变的患者中发现更高的CSF JCV DNA水平；
图20显示JCV VP1/NeuNAc-(a2，3)-Gal-(b1，3)-[(a2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖复合物的结构模型；和
图21显示VP1的PML特异性突变消除或显著改变病毒衣壳蛋白VP1对于唾液酸化神经节苷脂的特异性。
发明详述
本发明的方面涉及鉴定和管理处于增加的发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中的受试者的医疗保健。PML可由人，特别是具有减弱的免疫系统的受试者中的JC多瘤病毒(JCV)感染引发。然而，PML并非在所有具有减弱的免疫系统的JCV-感染的受试者中发生。根据本发明，只有某些JCV变体引起PML。在某些实施方案中，具有减弱的唾液酸结合的JCV变体特别可能引起PML。因此，本发明的方面涉及用于检测经预测具有减弱的对唾液酸的结合的JCV变体的存在的方法和组合物。
根据本发明的方面，并且不希望受理论束缚，相对于野生型JCV的唾液酸结合，具有低唾液酸结合的JCV变体具有减弱的对周围位点(例如周围细胞、蛋白质、糖类或其它分子)的结合。因此，在某些实施方案中，此类变体更可能扩散至身体的其它部分，例如CNS。此外，根据本发明的方面，具有健康免疫系统的受试者控制具有减弱的唾液酸结合的某些JCV变体的扩散。然而，在具有受损的免疫系统的受试者中，此类变体更可能逃避免疫系统并且发展成PML。
因此，本发明的方面涉及用于检测JCV变体的存在的组合物和方法，所述JCV变体经预测相对于正常或野生型JCV的结合具有低唾液酸结合(例如，低亲和力或亲合力)。在某些实施方案中，在JCV衣壳蛋白的唾液酸结合结构域中具有一个或多个突变的JCV变体经预测具有低唾液酸结合性质。在某些实施方案中，本文中描述的特定变体经预测具有低唾液酸结合性质。
根据本发明的方面，含有具有经预测减弱唾液酸结合的一个或多个突变的JCV变体的受试者被鉴定为具有增加的对PML的易感性(例如，与不含有JCV或这样的JCV变体的受试者相比较)，特别是当它们的免疫系统受损时。因此，如果利用免疫抑制药物(例如，那他珠单抗或其它免疫抑制药物)治疗具有减弱的唾液酸结合JCV变体的受试者，则他们处于发展PML的风险中。
在某些实施方案中，受试者的与PML易感性相关的JCV突变是在JCV的VP1衣壳蛋白中的位点122、2和66上的突变和氨基酸50-51、123-125和126-134的缺失。在某些实施方案中，受试者的与PML易感性相关的JCV突变是H122R、A2V和D66G。在某些实施方案中，受试者的与PML易感性相关的JCV突变为H122R、A2V以及D66G和283I。在某些实施方案中，如果JCV VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基122、2、66、55、60、265、267和269的至少一个的置换或氨基酸50-51、123-125和126-134的一个或多个缺失，那么受试者对PML易感。
本发明的方面用于帮助选择和/或监控对需要免疫抑制治疗的受试者(例如，具有多发性硬化或可利用一种或多种免疫抑制药物治疗的任何其它病症的受试者)的治疗。在某些实施方案中，本发明的方面可用于鉴定在启动免疫抑制治疗之前对PML易感的受试者。在某些实施方案中，可监控正在接受免疫抑制治疗的受试者的与增加的发生PML的风险相关的JCV变体的出现。在某些实施方案中，如果受试者被鉴定为具有具有减弱的对唾液酸结合的JCV变体，那么i)不用免疫抑制试剂治疗受试者，ii)利用低剂量或频率的药物施用治疗受试者，和/或iii)定期监控受试者的PML的早期症状。例如在治疗过程中出现PML的症状，那么可停止治疗或可减少药物施用的量或频率。在某些实施方案中，如果PML的一个或多个症状存在，则可用可选择的免疫抑制药物替代第一药物。
本发明的方面可用于实现患者监控方法。在某些实施方案中，首先测定患者以确定他们是否已暴露于JCV(例如，通过测定患者血清的JCV抗体的存在)。未暴露于JCV的患者被鉴定为具有发生PML的低风险。然而，在某些实施方案中，定期监控此类患者以确定他们是否或何时暴露于JCV。如果在治疗之前或治疗过程中鉴定受试者的JCV暴露的体征，那么可评估受试者的与增加的发生PML的风险相关的一个或多个JCV变体(例如，一个或多个经预测相对于JCV的正常或野生型形式具有减弱的唾液酸结合的变体)的存在。可定期监控患者的PML相关JCV变体的存在。如果发现患者具有一个或多个PML相关JCV变体，那么可仔细地监控患者的PML的体征，可停止或改变患者的治疗，和/或可利用一种或多种预防性或治疗性药物治疗患者以帮助保护患者免受PML伤害。
在某些实施方案中，每天1次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2个月1次、每季1次、每年2次、每年1次或每2年1次监控患者或受试者。在某些实施方案中，当患者或受试者在正经历利用免疫抑制剂的治疗时，监控所述患者或受试者。
根据本发明的方面，如果JCV变体在JVC VP1蛋白的唾液酸结合口袋中具有一个或多个突变，那么可预测JCV变体具有低唾液酸结合(例如，亲和力或亲合力)。在某些实施方案中，可预测在结合于唾液酸结合口袋中的分子的12埃内的氨基酸的任一个或多个的突变影响唾液酸结合。结合于唾液酸结合口袋中的分子的12埃内的VP1氨基酸的列表提供于实施例12的表16中。因此，在此类氨基酸的一个或多个中具有突变的JCV变体可因减弱的对唾液酸的结合和从而增加的引发PML的风险而被鉴定为候选物。
根据本发明的方面，数种不同的天然存在的JCV VP1序列可用作正常或野生型参照序列，如果它们来自与增加的发生本文中所述的PML的风险无关的JCV变体。此类参照序列的实例更详细地描述于本文中和例如Cubitt等人，Predicted amino acid sequences for 100 JCV strains，Journal of Neuro Virology，7：339-344，2001，其序列公开内容通过引入整体并入本文。
根据本发明的方面，可使用适当的测定法测量变体JCV的唾液酸结合性质(例如，亲和力或亲合力)。例如，可使用血凝测定(hemmaglutinationassay)、与固定分子(例如神经节苷脂类、糖类、糖蛋白等)的直接结合、基于细胞的结合测定法(例如，其中使用流式细胞术利用标记的抗体检测结合)等或其任意组合来测量JCV和/或JCV VP1对唾液酸的结合。在某些实施方案中，相对于本文中描述的正常或野生型JCV参照的结合，低结合的结合(例如，亲合力或亲和力)下降至1/5以下。然而，在某些实施方案中，相对于正常或野生型JCV参照，低结合的结合下降至约1/10、1/50、1/100、1/200、1/500、1/1,000、1/5,000、1/10,000以下或更低。
因此，本发明的方面涉及确定受试者是否因PML相关JCV变体的存在而对PML易感。在某些实施方案中，该信息可用于确定受试者是否适合于进行利用免疫抑制试剂的治疗。在某些实施方案中，该信息可用于确定正在利用免疫抑制试剂治疗的受试者是否应当继续治疗或应当转换至不同剂量、方案和/或类型的免疫抑制药物。在某些实施方案中，正用免疫抑制试剂治疗的受试者的PML相关JCV变体的检测为中断治疗(至少进行预定的时间段)提供了基础。
可定期监控正利用免疫抑制试剂治疗的患者的JCV感染的存在。在某些实施方案中，如果已知受试者具有JCV感染或所述受试者经鉴定具有JCV感染，那么可定期监控受试者的经预测具有减弱的对唾液酸的结合的JCV变体的存在。
因此，本发明提供了用于确定受试者是否处于发生进行性多灶性白质脑病(PML)的风险中或患有PML(例如早期PML)的方法和组合物。在一个实施方案中，检查暴露于变体JCV病毒的受试者的生物样本，所述变体JCV病毒具有一个或多个与PML相关的序列变异(例如一个或多个经预测导致减弱的唾液酸结合的序列变异)。在某些实施方案中，检查多个预定的特定VP-1位点的其突变状态。在特定位点上发现的序列变异模式提供了受试者的PML的风险特征。
在某些实施方案中，本发明提供了JCV-VP1氨基酸位点的实验对象组，所述氨基酸位点上的序列变异与PML风险和/或PML疾病进展相关。提供了用于测定生物样本的PML风险的标记的方法和组合物。在某些实施方案中，可分离并且分析JC病毒多肽和/或核酸以确定它们是否在一个或多个预定的VP-1位点上具有序列变异。然而，在某些情况下，JC病毒可难以从某些获自受试者的生物样本分离，所述受试者具有低JC病毒载量，即使他们已暴露于JC病毒并且可具有当前JC病毒感染。然而，受试者暴露于PML相关变体JC病毒可从抗一种或多种PML相关变体JCV-VP1多肽的抗体(例如，血清抗体)在获自受试者的生物样本中的存在推断出来。
PML患者的脑中的JCV序列是如此易变以至从未在不同PML患者中检测到相同的JCV序列(Yogo & Sugimoto，2001)。然而，本发明的方面基于来自健康和PML受试者的JCV序列的分析以及VP1序列中一个亚组位点的鉴定，所述位点上的氨基酸置换与PML强相关。在一个方面中，本发明提供了关于需要检查JCV-VP1中的哪个位点来获得对于PML的风险特征的指导。在一个方面中，本发明提供了新型实验对象组的VP1氨基酸位点，所述氨基酸位点上的序列变异预示着被相应变体JCV感染的受试者的PML的风险。本发明的方面涉及筛查受试者的具有减弱的对唾液酸的结合的JCV变体的体征或标记的存在。在某些实施方案中，与不同PML风险特征相关的JCV序列变异的实验对象组提供于表1A-1H中并且在本文中进行了更详细的描述。
JCV和VP1
在某些实施方案中，在JCV的主要衣壳蛋白(VP1)中所选择的位点上发现与PML相关的JCV序列变异。已对文献中描述的许多VP1蛋白的序列进行分析以鉴定其中序列变异与PML强相关的VP1位点的亚组。根据本发明，氨基酸被鉴定为VP-1上的特定位点上的突变体或变体，如果其与共有序列或其它参照序列(例如，野生型原始型病毒的序列)中该位点上的氨基酸不同的话。在某些实施方案中，来自健康受试者的JCV的VP1蛋白的共有序列由GenBank ID No# 37050849(AAQ88264；在图1中显示为VP1序列)提供。当与图1中显示的SV40相比较时，JCV-VP1是保守的。已鉴定了JCV的许多不同原始型。如本文中所使用的，原始型是在健康个体的尿中发现的JCV。在某些实施方案中，图1的VP1序列是参照序列。在某些实施方案中，参照序列是Zheng等人(2005)的一个或多个原始型。3个主要原始型由地区决定(EU原始型见于欧洲祖先的人中，CY和MY原始型见于亚洲祖先的人中)。当基于与“共有”序列的比较来鉴定PML相关序列变异时，几种原始型在鉴定为PML相关的位点上具有相同的氨基酸，从而可基于与任何原始型序列的序列比较来实施本发明。在其它实施方案中，测定可基于确定JCV是否在某些位点具有一个或多个预定的氨基酸而无需进行与参照序列的比较。应当理解，用于确定某些JCV-VP1变异序列的存在的方法可基于从受试者分离的JCV核酸或多肽的直接表征。可选地，可通过检测对一个或多个变体JCV-VP1序列特异的受试抗体(例如，血清抗体)推断变体JCV在受试者中的存在(或受试者先前暴露于变体JCV)。应当理解，本发明的方面还提供了将JCV-VP1序列与其它参照序列相比较。然而，即使使用其它参照序列，分析仍可包括确定本文中描述的一个或多个PML相关VP1位点上的氨基酸的身份。
根据本发明，VP1变体的序列分析鉴定了与发生PML的风险相关的序列变异的“热点”区域。在某些实施方案中，表示发生PML的风险的序列变异位于VP1蛋白的表面环中。此类位点可见于表1B-1D。在某些实施方案中，VP1蛋白的特定区域中序列变异的总数表示发生PML的风险(参见表2)。在某些实施方案中，变异氨基酸在2个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)本文中描述的位点上的存在可表示发生PML的风险。此类区域的极性可表示发生PML的风险并且如果极性氨基酸被非极性氨基酸取代则发生PML的风险可增加。在某些实施方案中，表1A或表1B-1D中鉴定的任一个或多个位点上极性氨基酸的丢失导致具有增加的与PML的关联性的JCV病毒。在某些实施方案中，图2中显示的结构区域之一(例如，在由JCV-VP1多肽序列的位点55-75或265-271确定的区域中)中的任一个或多个位点上极性氨基酸的丢失导致具有增加的与PML的关联性的JCV病毒。类似地，在某些实施方案中，在表1A或表1B-1D中鉴定的位点的任一个或多个位点上非极性氨基酸的获得导致具有增加的与PML的关联性的JCV病毒。同样地，在某些实施方案中，图2中显示的结构区域之一(例如，在JCV-VP1多肽序列的位点55-75或265-271确定的区域中)中的任一个或多个位点上非极性氨基酸的获得导致JCV-VP1结构突显区域，在所述区域中将鉴定为与PML相关的某些氨基酸位点定位至所述结构。JCV-VP1蛋白的预测的结构基于SV40衣壳蛋白1晶体结构和JCV与SV40蛋白之间的序列相似性。序列变异的分析显示VP1蛋白的表面区域上极性氨基酸的数目的减少和/或非极性氨基酸的数目的增加导致增加的发生PML的风险(参见实施例3)。在一个实施方案中，如果表面环的一个或多个中序列变异导致每序列变异10平方埃或更大的非极性表面积的增加或每序列变异10平方埃或更大的极性表面积的减小，那么受试者处于发生PML的风险中。然而本发明不限定于特定机制，据认为表面环的改变可阻碍抗体结合JCV-VP1和/或促进JCVVP1与其受体例如糖类和/或蛋白质受体例如5HT2A相互作用。VP1的表面环的变化(例如，非极性氨基酸或表面积的增加和/或极性氨基酸或表面积的减小)可增加VP1对细胞受体的亲和力和促进宿主细胞或对于PML进展是重要的某些特定宿主细胞的病毒进入和/或感染。
序列变异的实验对象组
应当理解检查位点可包括确定该位点上的氨基酸和将该氨基酸与参照氨基酸(例如，在野生型/对照变体中，例如在共有序列或原始型序列中发现的氨基酸)相比较。
应当理解，任何单个变体或变体的组合可表示发生PML的风险。应当理解，所检查的变体的某个区域中或所选择的组中存在的变体的总数可表示发生PML的风险。
本发明的方面涉及提供JCV-VP1氨基酸序列上的与与发生PML的风险相关的JCV变体相应的一个或多个位点。例如，表1A中显示的各位点与发生PML的风险相关并且任何适当的测定法可用于检测过去暴露于JCV变体(所述变体在所选择的位点的一个或多个位点上具有氨基酸变体)的存在或标记。在某些实施方案中，测定法可用于检测在选自表1A所列的位点的2个或更多个位点上具有变异氨基酸变体的JCV变体的存在或对其的暴露，其中变体的存在表示着PML。
在某些实施方案中，与受试者的PML易感性相关的JCV突变是JCV的VP1衣壳蛋白中位点122、2和66上的突变和氨基酸50-51、123-125和126-134的氨基酸的缺失。在某些实施方案中，与受试者的PML易感性相关的JCV突变是H122R、A2V和D66G。在某些实施方案中，如果JCV VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基122、2、66、55、60、265、267和269的至少一个的置换或氨基酸50-51、123-125和126-134的一个或多个缺失，那么受试者对PML易感。
在某些实施方案中，通过将存在于该位点上的氨基酸与存在于参照序列中的氨基酸相比较来检查所选择的位点。如果存在于所选择的位点上的氨基酸与参照序列中发现的氨基酸不同，那么该位点被认为是突变的。因此，在某些方面中，本发明提供了包含与发生PML的风险相关的变体的列表的表(例如，数据库)。所述数据库还提供了变体和保护免受PML侵害的变体。在某些实施方案中，在所选择的位点上发现的任何变体表示发生PML的风险。在其它实施方案中，所述表提供了可作为组检查以获得受试者的发生PML的风险特征的与PML相关的变体的组。应当理解，参照数据库中鉴定的许多变体是极不常见的。例如，只可在已知处于发生PML的风险中的人的10％的样本中发现表示发生PML的风险的变体。为了获得受试者的风险特征，可能需要检查超过一个位点。因此，在一个方面中，本发明提供了成组的位点和该组内需要鉴定以获得发生PML的风险特征的位点的数目的表。在某些实施方案中，需要检查表1A中至少8个(例如，8、9、10或更多个，或全部)位点来获得受试者发生PML的风险特征。类似地，可检查任何表中的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个或全部位点。
在表中指定的位点上发现的氨基酸可通过将氨基酸与在参照序列中发现的氨基酸相比较来表示发生PML的风险。例如，在1A中，位点55上的野生型(例如，参照/共有)氨基酸是亮氨酸(L)。在某些实施方案中，位点55上发现的不为亮氨酸的任何氨基酸表示发生PML的风险。在某些实施方案中，特定的变体与发生PML的风险相关。例如，苯丙氨酸(F)在位点55上的存在可表示发生PML的风险。因此，变异氨基酸(例如，Phe)在位点55上的出现可表示PML的发作或进展。类似地，本文中描述的针对PML相关位点的一个或多个其它变异氨基酸在VP1上的出现可表示PML的发作或进展。在某些实施方案中，具有特定特征的氨基酸的存在可表示发生PML的风险。例如，极性不如参照序列中发现的氨基酸高的氨基酸在JCV变体中的存在表示发生PML的风险。除了表示发生PML的风险外，在特定位点上发现的变体还可用于确定受试者中的发作、进展或消退。在某些实施方案中，在特定位点上发现的变体允许监控受试者的PML治疗。在某些实施方案中，在特定位点上发现的变体允许选择患有或疑似患有PML的受试者的治疗。
在某些实施方案中，在特定氨基酸位点上发现的氨基酸可表示为处于得到保护免受PML的伤害中，例如，鉴定人处于发生PML的更低风险中。
应当理解在某些实施方案中，可确定发生PML的风险而无需将特定位点上测定的氨基酸与参照序列相比较。例如，如果在样本中检查位点55并且在该位点上发现的氨基酸为苯丙氨酸，那么受试者被确定为处于发生PML的风险中。可产生该确定而无需将位点55上发现的氨基酸与野生型参照序列相比较。
应当理解本发明提供了确定JCV变体的当前和过去存在的方法。已暴露于JCV变体但目前不能被鉴定为被该JCV变体感染的受试者可通过确定该JCV变体的指标的存在来确定暴露于该JCV变体。受试者可产生抗受试者暴露于其中的任何外来试剂包括病毒和细菌的抗体。病毒、病毒的变体在受试者中的存在从而可通过检测对该病毒或病毒变体特异的抗体的存在来诊断。如果病毒复制和突变(从而产生新型变体)，身体将产生对病毒的突变形式特异的新型抗体。即使特定病毒变体不再存在于身体中，但过去暴露于所述变体仍可通过抗体的存在来确定。因此，在一个实施方案中，JCV变体的突变状态(当前和过去的暴露)可通过检测抗一种或多种特定变体的抗体的存在来确定。在一个实施方案中，VP1-抗体的存在通过抗体与包含一个或多个变体的一种或多种多肽的特异性结合来确定。应当理解可定性和定量测定抗体。因此本发明的抗体检测测定法促进受试者曾经暴露于的全部病毒变体的确定和通过定量特定抗体进行的目前存在于身体中的变体的病毒载量的评估。
在一个实施方案中，可直接检测氨基酸变体，例如，通过确定包含变体的一个或多个变体的多肽的存在确定病毒变体在受试者中的存在。可开发可特异性结合特定多肽的试剂。在某些实施方案中，此类试剂是抗体。在某些实施方案中，可通过测定编码变体的核酸的序列来确定变体。从受试者获得样本并且分析其的特定病毒变体的存在。应当理解，特定JCV变体可以只存在于脑和脊髓液中，而“野生型”变体可存在于相同受试者的其它组织中。多肽的存在可通过对此类多肽特异的抗体来确定。除了可测定变体对野生型的比率外，测定法还将允许确定特定变体的存在和此类变体的定量。
应当理解，免疫抑制试剂可增加受试者对潜伏微生物感染的进展或骤发或对新型微生物感染的传染的易感性。在某些实施方案中，微生物感染是通过产生PML的JCV引发的感染。因此，可在启动利用免疫抑制试剂的治疗之前，在施用免疫抑制试剂的过程中或在已施用免疫抑制试剂之后或已结束利用免疫抑制治疗的疗法后评估发生PML的风险。
在某些实施方案中，通过本发明的方法测定的发生PML的风险将有助于决定利用免疫抑制剂或免疫抑制试剂的治疗。在某些实施方案中，在利用免疫抑制剂的治疗过程中诊断的增加的发生PML的风险可表明利用免疫抑制剂的治疗方案的改进或终止。
表1A：JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100341
表1B.组I JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100342
表1C.组II JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100343
表1D.组III JCV-VP1变体的实验对象组
表1E：组I-III JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100351
表1F.在大多数PML脑样本中发现的JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100352
表1G.在来自健康个体的样本中未发现的JCV-VP1风险变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100353
Figure BPA00001444948100361
表1H.在健康个体中发现的JCV-VP1变体的实验对象组
Figure BPA00001444948100362
表2A：健康受试者
Figure BPA00001444948100363
Figure BPA00001444948100371
表2B：PML样本
Figure BPA00001444948100381
诊断学
因此，本发明的方法在一个方面中用于基于本发明的变体的实验对象组和组确定受试者是否处于发生PML的风险中或患有PML。测定来自受试者的生物样本暴露于变体JCV的标记将允许确定人是否处于发生PML的风险中或患有PML，或被与PML相关的JCV变体感染。受试者是否已暴露于在一个或多个本文中描述的VP1位点上具有序列变异的JCV变体或被其感染的确定允许评估受试者是否处于发生PML的风险中(与PML相关的JCV变体的PV1位点上的变体也称为本发明的变体)。在一个方面中，本发明提供了JCV变体的预定位点上的突变状态与发生PML的风险之间的相关性。在某些实施方案中，变位位于JCV-VP1蛋白上。
如本文中所使用的，“诊断”和“鉴定”PML意指人是否处于发生PML的风险中或患有PML的识别。处于发生PML的风险中的诊断不限于确定表示暴露于JCV变体的变体在位点上的确定并且可与本领域内的常规诊断方法组合。此类诊断测定法包括但不限于组织病理学、免疫组织化学、流式细胞术、细胞学、病理生理学测定法，包括MRI和体层摄影术、神经学测定法、生物化学测定法。CSF中通过PCR对JCV DNA的检测是最广泛接受的PML的诊断测试。其具有99％的特异度和70％的选择性。对于CSF在阳性JCV PCR结果不存在的情况下，可进行脑活组织检查。脑组织中JCV DNA检测可用作PML的阳性诊断。生物化学测定包括但不限于除了在预定位点之外的变体分析、病毒基因分析、特定蛋白质的ELISA分析、血小板计数等。本领域技术人员知道常规用于本领域内的许多诊断方案和参数。
诊断还包括测定样本和/或受试者的JCV变体的量(病毒载量)和JCV变体相对JCV野生型的比率。
本发明的方法和/或试剂盒可用于筛查患有PML和处于发生PML的风险中(如由表示暴露于JCV变体(本发明的变体)的变体在预定位点上的存在所表明的)的受试者，其中本发明的一个或多个变体的存在与处于发生PML的风险中相关。本发明的方法可通过评估来自受试者的样本的本发明的变体来用于诊断发生PML的风险，所述受试者已暴露于或疑似暴露于与PML相关的JCV变体。
本发明在某些方面中包括多种测定法，所述测定法确定受试者是否已暴露于在VP1蛋白的特定位点上具有一个或多个变体的JCV变体。本发明的方法和测定法可用于监控随着时间的过去样本和/或受试者的本发明的变体的状态的变化。此外，本发明的方法可通过在不同的时间点从受试者获得多个样本，用于监控随着时间的过去存在于受试者中的JCV变体的量。因此，本发明的方法可用于检查随着时间的过去受试者或样本的本发明的变体的改变和/或JCV变体的量的改变。这允许监控疑似处于发生PML风险中的受试者的突变状态并且也使得能够在已知已暴露于JCV变体的受试者中进行定量监控。
JCV-VP1变异核酸、多肽和抗体的检测
在一个方面中，本发明提供了用于检测JCV-VP1变异多肽和/或可特异性结合生物样本的JCV变体多肽的抗体(也分别称为本发明的多肽和抗体)。检测多肽和抗体的方法在本领域内是公知的并且本发明不限于任何特定的检测方法。此外，可通过检测编码本发明的多肽或抗体的核酸来间接检测所述多肽和抗体。用于核酸的检测的方法在本领域内是公知的并且非限定性实例是PCR、测序、杂交分析、探针分析和微阵列分析，所述检测方法全都包括在本发明中。用于检测多肽和/或抗体的方法的非限定性实例包括肽测序、质谱法和免疫吸收测定法(例如，多肽与抗体的结合)和蛋白质阵列。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)是用于检测各种抗原(包括多肽)的公知的测定法。本发明包括可检测本发明的多肽在样本中的存在的任何ELISA和可检测本发明的抗体在样本中的存在的任何ELISA。
在一个实施方案中，ELISA的第一步骤包括提供对结合至多孔板的JCV-VP1多肽特异的第一抗体。本发明不限于多孔板并且可将抗体固定在任何表面上，包括珠粒和载玻片。本发明也不限于抗体并且本发明可包括任何肽结合部分，包括适体、抗体片段和小分子。本发明包括本发明的多肽的存在的定性和定量测定。在一个实施方案中，可使用含有高浓度的无关蛋白质例如牛血清白蛋白或酪蛋白的缓冲液封闭孔。所述封闭步骤确保必要时表面的任何未包被的区域将被非反应性蛋白质占据。然后通过一次或多次洗涤除去过量封闭试剂。在某些实施方案中，ELISA是多重测定法并且多孔板的每一个孔包含对一种特定JCV-VP1多肽变体特异的抗体。一旦封闭表面，可将包含JCV-VP1多肽的样本或待测试JCV-VP1多肽的存在的样本与第一抗体接触并且使其在适合于允许JCV-VP1多肽与第一抗体特异性结合的条件下温育适合于允许所述特异性结合的时间量。这样的条件和时间量可以是例如在室温下进行3-4小时，或在4℃下进行10-16小时。可通过一次或多次洗涤除去过量样本。作为下一步骤，将也对JCV-VP1多肽特异的第二抗体与第一抗体-多肽复合物接触，并且使其在适合于允许JCV-VP1多肽被第二抗体特异性结合的条件下温育适合于允许所述特异性结合的时间量。这样的条件和时间量可以是例如1-10微克/ml的抗体、室温下进行1-4小时以及4℃下进行10-16小时。在某些实施方案中，将第二抗体连接至荧光标签或代谢酶，从而允许检测结合的JCV-VP1多肽。可选地，可通过将第二抗体与标记的第三抗体接触来测定结合的JCV-VP1多肽。上述ELISA称为夹心ELISA，因为JCV-VP1多肽被夹在两种抗体(第一抗体和第二抗体)之间。
在某些实施方案中，确定特异于JCV-VP1多肽的抗体的存在。本发明包括定性和定量测定本发明的抗体的存在。抗体的存在的测定可允许确定当前和过去的感染。在大多数情况下，人身体将产生抗外来多肽例如JCV蛋白的抗体。即使病毒(例如，病毒核酸)本身在体内不再被检测到，抗病毒抗体仍然存在，从而为暴露于病毒的标记。在用于检测对变体JCV-VP1多肽特异的抗体的方法的一个实施方案中，提供了一个或多个固体表面(例如，多孔板、珠粒或载玻片)，其中各表面具有固定的独特的JCV-VP1多肽变体。
在某些实施方案中，将JCV-VP1多肽变体固定为JCV颗粒(例如，包含一个或多个变体并且自装配以形成被固定在例如测定表面上的颗粒的重组VP1蛋白)。此类颗粒可包含本文中描述的变体的一种或多种(例如，表1A-1H、表17和/或表18，和/或一种或多种本文中描述的其它变体)。
各多肽变体包括表1A-1H、表17和/或表18的变体的一个或多个和/或本文中描述的一个或多个其它变体。多个多肽可涵盖相同的一个或多个变体。在一个实施方案中，将多肽变体的组合附着至固体表面。在某些实施方案中，提供了固体表面多孔板，其中各孔包含一种或多种变体。在某些实施方案中，多孔板包括具有涵盖本文中描述的全部变体的孔，所述变体表示发生PML的风险。将包含或疑似包含一种或多种可结合本文中描述的JCV-VP1多肽变体的抗体的样本在适合于所述抗体结合固定的JCV-VP1多肽的条件下与固定的肽接触。随后通过第二抗体的结合检测结合的抗体的存在。
本发明的ELISA不限于上述实施方案，而且还包括竞争性ELISA和允许检测本发明的多肽和抗体的ELISA的任何形式。
发作、进展、消退
本发明的方法和/或试剂盒可用于通过提供PML发作、进展和/或消退的早期指标来获得有用的预后信息。本发明包括通过例如在连续的时间从受试者获取样本并且测定此类样本对本发明的JCV变体的暴露来监控受试者的PML和/或JCV变体感染的发作、进展或消退的方法。受试者可被疑似患有PML或可被认为未患PML并且在后一种情况下，样本可用作用于与随后样本比较的标准基线水平。
病症的发作是与受试者的病症相关的改变的启动。此类改变可由生理症状证明。然而，患者可以是临床上无症状的。例如，PML和/或JCV感染发作之后可以是这样的时期，在所述时期中在受试者中可存在PML相关病原性变化，即使临床症状在该时间可能不明显。PML的进展在发作之后并且为病症的病原性(例如，生理学)成分的增加，这可以通过或可以不通过临床症状的增加来表明。相反地，PML和/或JCV感染的消退可包括病症的生理学特征的减退，可能伴随症状的平行减少，并且可因治疗而产生或可以是病症的自然逆转。PML和/或JCV感染的发作可由获自受试者的样本中所检查的位点上的变异的改变指示。例如，如果所检查的位点变体的数目在来自受试者的第一样本中比来自受试者的第二或随后样本中更少，那么其可表示PML和/或JCV感染的发作或进展。在某些实施方案中，仅一种变体的存在可表示PML的发作或进展。在某些实施方案中，变体在位点164上。在具体的实施方案中，位点164上变异氨基酸(例如，Lys)的出现表示PML的发作或进展。在某些实施方案中，PML和/或JCV感染的发作可由JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的变化指示。在某些实施方案中，病毒载量的增加伴随着变体数目的增加。
PML和/或JCV感染的进展和消退可由随着时间的过去受试者的样本中所检查的位点上变体的数目的增加或减少表示。例如，如果变体的数目在来自受试者的第一样本中较少并且增加的变体的水平经确定存在于来自受试者的第二或随后的样本中，那么其可分别表示PML和/或JCV感染的进展。应当理解，变体数目的增加和减少都可分别表示PML和/或JCV感染的进展或消退。例如，在某些位点上变体数目可增加，然而在其它位点上变体数目可减少，两种改变都表示PML和/或JCV感染。
PML和/或JCV感染的进展还可由JCV变体的病毒载量的增加或JCV变体相对JCV野生型的比率的增加表示，而消退可由JCV变体的病毒载量的减少或JCV变体相对JCV野生型的比率的减少表示。
发作、进展和消退可通过测定在不同时间点从受试者获得的多个样本来确定。例如，即使在不同时间点采集的第一组样本不显示PML的发作、进展或消退，但可获得另外的样本并且测定其的本发明的变体，以及将其与更早的样本相比较以确定发作、进展或消退是否发生。在某些实施方案中，当改变一种或多种免疫抑制剂的施用方案时，测定另外的样本。
用于PML治疗的测定法
本发明的方法还可通过在不同时间点检查对JCV病毒的变体的暴露来用于评估PML的治疗性治疗在受试者中的功效。例如，可在治疗方案(预防性的或作为癌症或癌前状态的治疗)开始之前、在治疗方案过程中和/或在治疗方案之后获得表示暴露于变异JC病毒的变体的数目，从而提供关于方案在受试者中的功效的信息。此外，还可随着时间的过去监控表示PML风险的JCV变体的丰度。在某些实施方案中，JCV变体的量(病毒载量)或JCV变体相对野生型JCV的比率可提供关于方案在受试者中的功效的信息。本发明的方法可用于比较在不同的时间从受试者获得的两个或更多个样本中的突变位点。在某些实施方案中，从受试者获得样本，给受试者施用PML的治疗并且从所述受试者获得随后的样本。在于不同的时间和/或不同的天获得的样本中测定本发明的受试者的变体或JCV变体的病毒载量或JC变体相对野生型JCV的比率的比较，从而提供受试者的PML的状态的量度，该量度可用于测定PML和/或JCV感染的任何治疗在受试者中的功效。
如本文中所使用的，PML治疗包括预防性和治疗性治疗，并且其包括PML的预防和治疗。受试者可接受PML治疗，因为所述受试者已被确定为处于发生PML的风险中或可选地，所述受试者可能患有PML。因此，治疗可减轻或完全消除PML和/或JCV感染或防止其进展。如本文中所使用的“治疗的评估”意指在不同取样时间(例如相隔至少1天)从受试者获得的样本的表示暴露于JCV变体的受试者的变体水平或JCV变体的病毒载量的比较。在某些实施方案中，从受试者获得第二样本的时间是在从所述受试者获得第一样本后至少5、10、20、30、40、50分钟。在某些实施方案中，从受试者获得第二样本的时间是在从所述受试者获得第一样本后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或更多个小时。在某些实施方案中，获得第二样本的时间是在从所述受试者获得第一样本后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、60、90、120、150、180、360或更多天。
PML的治疗
在一个实施方案中，用于PML治疗的治疗剂是抗感染剂。治疗剂可以是治疗微生物感染的抗感染剂，例如，对于治疗CNS的感染是有效的治疗剂。在某些实施方案中，抗感染剂可以是siRNA。然而，可使用其它适当的抗感染剂。抗感染剂可以是抗微生物剂例如抗病毒剂。可将抗病毒剂与另外的抗感染剂例如抗真菌剂或抗细菌剂组合。本发明的治疗剂可以是天然存在的或合成的分子或化合物。用于本发明的方法和组合物的治疗剂可以是多肽、化学药品、小分子、脂质、核酸或其它化合物。
可在本发明的方法和组合物中用作治疗剂(例如，抗感染剂)的核酸的实例是小干扰RNA分子(siRNA)、反义DNA、反义RNA或可用于预防和/或治疗CNS疾病或病症(包括PML)的适体。如本文中所使用的“小干扰RNA”或“siRNA”是指可衍生自细胞内双链RNA(dsRNA)的连续切割(以产生RNA分子)的RNA分子。有效的siRNA通常具有15至30个核苷酸，更常见地20至25个核苷酸的长度。siRNA用于在动物的RNA干扰过程指导相应mRNA靶的破坏。本发明的方法部分地包括施用siRNA分子以治疗与变异JC病毒相关的CNS疾病或病症(例如，CNS感染)。在某些方面中，本发明的方法可包括给受试者施用治疗性组合物，其包括作为CNS疾病或病症的治疗的siRNA和/或前体siRNA。前体siRNA分子是这样的双链RNA分子，所述双链RNA分子在施用后可在大小上减小(例如通过切丁酶)以形成预期的siRNA，该siRNA对CNS疾病或病症的RNAi治疗变得具有功能。因此，本发明的方法可包括施用siRNA或前体siRNA分子以治疗CNS疾病或病症。
选择治疗
在某些实施方案中，本发明的方法可用于帮助选择患有PML或处于发生PML的风险中的受试者的治疗。PML的治疗的选择可基于表示对JCV变体的暴露的变体的测定。治疗的选择也可基于样本中JCV变体的量(病毒载量)或变体JCV对野生型JCV的比率。选择治疗的方法可用于评估和/或调整已接受用于PML的药物或疗法的受试者的治疗。基于经发现表示暴露于JCV变体的变体，可适当地改变受试者的治疗方案。例如，表示已接受或正在接受PML或JCV治疗的受试者对JCV变体的暴露的一个或多个位点的改变的检测可表示应当调整治疗方案(例如，增加剂量给药的剂量或频率，起始新型治疗等)。在某些实施方案中，JCV变体的病毒载量或变体JCV对野生型JCV的比率的变化可表示应当调整治疗方案。在某些实施方案中，受试者可以不进行PML和/或JCV感染的任何目前治疗，并且表示对JCV变体的暴露的位点上的变体和/或JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的监控可将受试者鉴定为进行PML和/或JCV感染的治疗的候选者。因此，可选择受试者并且作为对JCV变体的暴露的标记和/或JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的测定的结果，用升高的水平的相同药物或用不同的疗法进行治疗。
根据本发明，某些受试者可以不具有否则需要利用特殊疗法的治疗的症状，并且对JCV变体的暴露的标记和/或JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的检测可将受试者鉴定为需要治疗。这意味着不使用本发明的方法鉴定对JCV变体的暴露的标记和/或JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率，根据本发明，受试者自本申请提交之日起可不具有需要利用特殊PML和/或JCV感染疗法的治疗的症状。
在一个方面中，本发明提供了用于决定PML的治疗方案的方法。临床医生可至少部分地基于本发明的诊断测定法对治疗选择作出决定。
涉及免疫抑制剂的治疗
选择治疗的方法可用于正在经历非针对PML或JCV感染但针对不同病症的治疗的人。在一个实施方案中，所述治疗是包括免疫抑制剂的治疗。在某些实施方案中，疑似处于发生PML的人是正在经历利用免疫抑制剂的治疗的人。
在某些实施方案中，已接受或正在接受非针对PML的治疗的受试者暴露于JCV变体的一个或多个标记的变化的检测，可表示应当调整治疗方案。在某些实施方案中，已接受或正在接受利用免疫抑制剂的治疗的受试者暴露于JCV变体的一个或多个标记的检测可表示应当调整治疗方案。在某些实施方案中，已接受或正在接受利用免疫抑制剂的治疗的受试者中JCV变体的病毒载量或JCV变体对野生型的比率的变化的检测可表示应当调整治疗方案。在某些实施方案中，已接受或正在接受利用免疫抑制剂的治疗的受试者中JCV的一个或多个预定的VP1位点的序列改变的检测可表示应当结束或中断治疗方案。在某些实施方案中，免疫抑制剂是那他珠单抗。在某些实施方案中，已接受或正在接受利用免疫抑制剂的治疗的受试者中JCV变体的病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的增加的检测可表示应当结束或中断治疗方案。
在一个方面中，本发明提供了用于决定治疗方案的方法。临床医生可至少部分地基于本发明的诊断测定法决定治疗选择。在某些实施方案中，本发明的方法提供了决定适当的利用免疫抑制试剂的疗法的诊断测定法。在某些实施方案中，临床医生可基于本发明的一个或多个JCV-VP1诊断测定法的结果决定结束或中断利用免疫抑制试剂的治疗。在某些实施方案中，本发明的方法提供了用于治疗受试者的诊断测定法，其中所述受试者是免疫受损的。在某些实施方案中，临床医生可基于本发明的JCV-VP1诊断测定法的结果结束或中断免疫受损的受试者的治疗。
免疫受损的受试者或正在经历利用免疫抑制剂的治疗的受试者
本发明的测定法对于免疫受损的受试者和/或正在利用一种或多种免疫抑制剂治疗的受试者是特别有用的。
受试者可接受利用一种或多种针对不同疾病或病症的免疫抑制试剂(也称为免疫抑制剂)的治疗，所述疾病或病症包括下列非限定性实例的一种或多种：癌症、器官或组织移植、炎性病症或疾病、多发性硬化(MS)、关节炎等或其任意组合。
受试者也可以是免疫受损的。免疫受损的受试者的非限定性实例是为HIV阳性或具有AIDS或淋巴瘤或导致免疫应答的抑制的任何其它病症的受试者。
如本文中所使用的术语“免疫抑制试剂”是指用于抑制或掩蔽本文中正在治疗的受试者的免疫系统的物质。免疫抑制试剂可以是抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。此类试剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(参见美国专利No.4,665,077)；非类固醇抗炎药物(NSAID)；更昔洛韦，他克莫司，糖皮质激素类例如皮质醇或醛固酮，抗炎剂例如环加氧酶抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂例如硫唑嘌呤或麦考酚酸吗乙酯(MMF)；烷化剂例如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所描述的)；MHC抗原或MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；固醇类例如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物例如泼尼松，甲泼尼龙和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂例如氨甲蝶呤(口服或皮下)；羟基氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)，抗TNF-α免疫粘附素(依那西普)，抗肿瘤坏死因子-β抗体，抗白细胞介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗，例如可在商标RITUXAN下获得的)；抗L3T4抗体；抗VLA-4抗体(例如，那他珠单抗，例如可在商标TYSABRI下获得的)；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，例如，抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(1990年6月26日公布的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等人，美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人，Science，251：430432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature，341：482(1989)；和WO 91/01133)；以及T细胞受体抗体(EP 340,109)例如T10B9。然而，可被选择用于进行诊断测定法和/或按照本发明治疗的接受其它免疫抑制剂的受试者不限定于该方面中。
筛选候选治疗剂
本发明还包括用于筛选预防和/或治疗PML和/或JCV感染的候选治疗剂或策略。可使用本发明的测定法在受试者(例如，非人哺乳动物)和来自培养的细胞中评估候选治疗剂或策略的功效。在某些实施方案中，候选治疗剂可以是可与包含一个或多个与PML相关的JCV-VP1变体的多肽相互作用的化合物或分子。在某些实施方案中，候选治疗剂可以是可改变具有JCV感染的受试者中JCV-VP1变体的模式和数目的化合物或分子。在某些实施方案中，候选治疗剂是可减少样本或受试者中JCV变体的量(病毒载量)的试剂。在某些实施方案中，候选治疗剂是可减少变体JCV对野生型JCV的比率的试剂。在某些实施方案中，候选治疗剂是模拟JCV受体并且可竞争JCV结合的试剂(例如，小分子)。在某些实施方案中，给受试者施用试剂，或将样本暴露于候选试剂或候选治疗，将导致受试者中与JCV感染相关的JCV-VP1变体的模式的改变。在某些实施方案中，给受试者施用试剂或将样本暴露于候选试剂或候选治疗将导致JCV感染中PML相关JCV-VP1变体数目的改变。在某些实施方案中，给受试者施用试剂或将样本暴露于候选试剂或候选治疗将导致JCV变体病毒载量和/或JCV变体对JCV野生型的比率的减少。
在一个实施方案中，将包括表达JCV变体的细胞的样本暴露于候选治疗剂或治疗。包括暴露于候选物的不表达JCV变体的细胞的样本将用作对照。在施用候选治疗剂或治疗后监控JCV变体(病毒载量)的表达水平，并且将JCV变体的表达的变化与未用所述候选治疗剂治疗的样本相比较。如果已暴露于试剂的样本中本发明的JCV变体的病毒载量的水平与对照样本相比较已改变，那么所述试剂是候选治疗剂或候选治疗。在某些实施方案中，从细胞表达和分泌JCV变体并且使其与候选试剂接触。可结合JCV变体的任何候选试剂是候选治疗剂。在某些实施方案中，候选治疗剂结合JCV变体的VP1多肽。
在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定抑制JCV感染中PML相关VP1变体的数目或水平以及抑制发生PML的风险的候选治疗剂的方法。在某些实施方案中，候选治疗剂针对非PML或JCV感染的疾病或病症。在某些实施方案中，候选治疗剂是免疫抑制剂。在某些实施方案中，候选治疗剂是在免疫抑制疗法中作为处方药的试剂。
本发明包括筛选调节JCV变体的表达水平的试剂或治疗的方法。筛选方法可包括将候选试剂与细胞或组织混合或在受试者中施用所述候选试剂或者将细胞或组织或受试者暴露于候选治疗并且使用测定JCV变体的病毒载量的方法来测定与候选试剂或治疗接触之前和之后的表达水平。与对照相比较JCV变体的表达量的减少表示候选试剂或治疗能够治疗细胞、组织和/或受试者的PML和/或JCV感染。
在某些实施方案中，用于测试候选试剂的测定混合物包括候选试剂。候选试剂可以是抗体、小有机化合物或多肽，并且相应地可选自组合抗体文库、组合蛋白文库或小有机分子文库。通常，以不同的试剂浓度平行运行多个反应混合物以获得对不同浓度的不同反应。通常，这些浓度之一用作阴性对照，例如以试剂的0浓度或以低于测试检测限的试剂的浓度。
任何分子或化合物可以是候选治疗剂。候选治疗剂的非限定性实例是小分子、RNA(包括siRNA)、DNA(包括适体)以及蛋白质(包括抗体和抗体片段)。本发明还包括具有不同的作用模式的候选治疗剂。
候选试剂包括许多化学药品种类，虽然通常它们为有机化合物、蛋白质或抗体(以及其结合抗原的片段)。在某些实施方案中，候选试剂是小有机化合物，例如具有大于50但仍小于约2500，例如小于约1000，在某些实施方案中，小于约500的分子量。候选试剂包括与多肽和/或核酸结构相互作用所必需的功能化学基团，并且可包括至少胺、羰基、羟基或羧基，任选至少2个所述功能化学基团或至少3个所述功能化学基团。候选试剂可包括环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构(被一个或多个上述官能团取代的)。候选试剂还可以是生物分子例如核酸、多肽、糖类、脂肪酸、固醇类、类异戊二烯、嘌呤类、嘧啶类、上述分子的衍生物或结构类似物或其组合等。
候选试剂获自多种来源，包括合成或天然化合物的文库。例如，许多方法可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸的表达、合成有机组合文库、随机或非随机多肽的噬菌体展示文库、蛋白质或抗体的组合文库等。可选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易产生的。此外，天然和合成产生的文库和化合物可通过常规化学、物理和生物化学方法容易地修饰。此外，可将已知的试剂经历定向或随机化学修饰例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等以产生所述试剂的结构类似物。
许多种其它试剂也可包含于混合物中。此类试剂包括试剂例如盐、缓冲剂、中性蛋白质(例如，白蛋白)、洗涤剂等，其可用于促进最佳蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-试剂结合。这样的试剂还可以减少反应组分的非特异性或背景相互作用。还可使用提高测定的效率的其它试剂例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物试剂等。
试剂盒
在本发明的某些方面中，提供了试剂盒。本发明的试剂盒可包括用于PML和/或JCV感染、对JCV变体的暴露的体外诊断、预后、监控和/或候选治疗剂的测试的本发明的核酸、多肽、抗体或其它分子。可将试剂盒的组分包装在水性介质或冻干形式中。本发明的试剂盒还可包括用于PCR和ELISA测定的试剂，所述试剂也可以作为以中间体形式存在的可检测的标记试剂或作为以测定发生PML的风险、JCV感染或对JCV变体的暴露的方法的部分待缀合的分离部分。在本发明的试剂盒的某些实施方案中，试剂盒可包括用于确定本发明的变体的存在和/或用于测定JCV变体的病毒载量的说明书。试剂盒还可包括可用于解释本发明所用方法的结果的对照值(例如，参考数)。
本发明的试剂盒可包括可用于鉴定对具有一个或多个PML相关VP1变体的JCV变体的暴露的一个或多个标记的核酸、抗体或多肽。在某些实施方案中，试剂盒可包括用于ELISA的标准技术以鉴定抗体的物质，所述抗体可结合一种或多种包含表示对JCV变体的暴露的一个或多个变体的多肽。在某些实施方案中，本发明的试剂盒可包括核酸组分，其用于结合和检测编码在本文中被描述为与PML相关的一个或多个变体或变体组合的核酸。在某些实施方案中，试剂盒可包括一种或多种不同的抗体，所述抗体特异性结合一种或多种包含本发明的一个或多个变体或变体的组合的多肽。试剂盒还可包括与抗体一起用于测定细胞、组织或受试者中JCV变体的表达或对JCV变体的暴露的组分。
试剂盒可包括经区室化以在其中封闭式装载一个或多个容器装置或一系列容器装置例如试管、小瓶、瓶子、注射器等的载体。试剂盒还可包括对照样本。在某些实施方案中，试剂盒包括用于解释测试结果的说明书例如用于确定测试是否表示测定中被检测的试剂的水平是否与对JCV感染(例如，野生型或变体JCV引起的)的暴露相关的说明书。
生物样本
可对任何适当的生物样本进行用于测定对JCV变体的暴露的方法。在某些实施方案中，可从受试者获得样本并且直接处理和测定如本文中描述的JCV的标记。在某些实施方案中，可从生物样本分离细胞并且在分析之前将其在培养中生长。如本文中所使用的，受试者可以是人或非人动物，包括但不限于非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。本发明的方法可用于测定尚未诊断患有PML的受试者对JCV变体的暴露。本发明的方法可用于测定尚未诊断为被JCV感染的受试者对JCV变体的暴露。此外，本发明的方法可用于已经诊断患有PML和/或JCV变体感染的受试者。样本可包含一个或多个细胞。样本可直接源于受试者或源自细胞培养物。在用于本发明的方法之前可处理(例如，以制备细胞裂解物)或部分处理样本。在某些实施方案中，可处理来自受试者或培养物的样本以获得核酸或多肽用于检测对本文中所述的JCV病毒的变体的暴露的测定。因此，测定中的初始步骤可包括从细胞、组织和/或其它样本分离基因组核酸样本和/或其它核酸和/或多肽。核酸和/或多肽的提取可通过任何适当的方法进行，包括本领域技术人员使用的常规方法，例如包括使用洗涤剂裂解物、声处理和/或与玻璃珠一起涡旋的方法等。
如本文中所使用的，术语“样本”意指包含DNA或RNA或蛋白质的任何动物材料，例如，从个体(包括但不限于血浆、血清、脑脊髓液、尿、淋巴、眼泪、唾液和组织切片)或从体外细胞培养物组分分离的组织或液体。包含核酸的样本可包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸与核糖核酸的共聚物或其组合。包含多肽的样本可包含肽和/或蛋白质。在某些实施方案中，样本包含抗体。可将样本经历纯化(例如，提取)和/或其它处理。术语“样本”也可指“生物样本”。
如本文中所使用的，术语“生物样本”可以指受试者的组织、细胞或组分部分(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血(amniotic cord blood)、尿、粪便、阴道液和精液等)。“生物样本”还可指从组织、细胞或构成部分或其级分或部分(包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、尿、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外表切片、眼泪、唾液、粪便、奶、血细胞、肿瘤或器官、CNS活检组织等)制备的匀浆物、裂解物或提取物。
样本源可包括组织，包括但不限于淋巴组织；体液(例如，血液、淋巴液等)、培养细胞；细胞系；组织学切片；包埋在石蜡中的组织等。如本文中所使用的术语“组织”是指局域化的(localized)和散布的(disseminated)细胞群体，包括但不限于：脑、心脏、血清、乳腺、结肠、膀胱、表皮、皮肤、子宫、前列腺、胃、睾丸、卵巢、胰腺、脑下垂体、肾上腺、甲状腺、唾液腺、乳腺、肾、肝、肠、脾、胸腺、骨髓、气管、和肺。生物液体包括但不限于血液、淋巴液、脑脊髓液、眼泪、唾液、尿和粪便等。侵入性和非创伤性技术可用于获得此类样本并且在本领域内得到详尽记录。对照样本可包括体液、细胞、组织或其裂解物。在某些实施方案中，对照样本可以是来自无PML和/或JCV变体引发的感染或暴露于JCV变体的细胞或受试者的样本。在某些实施方案中，对照样本可以是来自患有PML和/或已暴露于JCV变体的细胞或受试者的样本。在某些实施方案中，对照样本是包含野生型JC病毒的样本。
疫苗
本发明还涉及用于免疫哺乳动物以抗PML或PML相关JCV变体引发的感染的疫苗。疫苗可包含至少一种含有本发明的一个或多个的JCV变体序列的多肽。在某些实施方案中，疫苗可包含一种或多种在本文中被描述为经预测减弱唾液酸结合的变体JCV或JCV多肽。在某些实施方案中，疫苗可包含多种不同的肽(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-15、15-20、20-50种或更多种)以提供范围广泛的不同表位。在某些实施方案中，多肽是全长JCV-VP1变体多肽。在另一个实施方案中，多肽是选自本文中描述的多肽(例如，图3或表1或2B、表17和/或表18中和/或本文中描述的一个或多个其它变体)的全长CV-VP1多肽或在一个或多个本文中描述的预定位点上具有至少一个变异氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个变异氨基酸)的其任何片段(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、100-150、150-200个氨基酸长的多肽或更长、更短或中间长度的多肽)。在某些实施方案中，多肽是包含一个或多个本发明的变异氨基酸的JCV-VP1蛋白质的片段。在另外的方面中，本发明涉及包含至少一种JCV变体多肽和适当的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。在某些实施方案中，疫苗中的多肽在长度上为约5、约10、约20、约30、约40或约50个氨基酸，或包括JCV-VP1蛋白质的全长。此类组合物适合用于预防或治疗PML和/或与PML相关的JCV变体引发的感染。可以以刺激保护性抗体或保护性T细胞应答产生的有效量给受试者施用药物组合物。在某些实施方案中，疫苗是核酸疫苗，其包含编码一种或多种本发明的JCV多肽的核酸。
术语“免疫”是指物质在佐剂存在或不存在的情况下，无论单独地还是当连接至载体时，引起受试者的体液和/或细胞应答的能力，并且还可指部分或完全地阻断传染剂的感染的免疫应答。PML“疫苗”是能够引发抗PML的保护作用(无论是部分的还是完全的)的免疫原性组合物。疫苗还可用于治疗患有PML的受试者。疫苗的施用方案对于本领域技术人员来说是已知的。在某些实施方案中，用于预防PML的多肽疫苗的量的范围为0.01至100微克/剂，例如0.1至50微克/剂。为了获得足够的免疫应答和随后抗PML或由与PML相关的JCV变体引发的感染的保护作用，每个受试者可能需要数剂。
药学上可接受的载体包括其本身不诱发对接受组合物的个体有害虫的抗体产生的任何载体。适当的载体通常是大的缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物；和灭活的病毒颗粒。此类载体对于本领域技术人员来说是公知的。
增强本发明的多肽疫苗的功效的佐剂包括但不限于：氢氧化铝(明矾)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)(如在美国专利No.4,606,918中发现的)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(正-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)和RIBI(其在2％角鲨烯/Tween 80乳液中包含从细菌提取的3种成分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS))。也可单独地或以两种组分的组合使用3种组分MPL、TDM或CWS的任一种。在某些实施方案中，可使用Goldmann等人，1999，Journal of Virology，第73卷，No.5，pp 4465-4469(其公开内容在此通过引用合并入本文)中描述的一种或多种技术将本发明的一种或多种肽可用于免疫。
在某些实施方案中，可将疫苗在免疫抑制疗法或可影响(例如，削弱)免疫系统的任何其它治疗之前或与所述疗法或治疗一起给受试者施用。
抗体
在某些实施方案中，针对JCV变体的抗体或其抗原结合片段也包括在本发明中。抗体可用于本文中描述的检测测定法(例如，ELISA测定法)。抗体可在疗法中用于治疗患有PML的受试者和/或预防或减轻由JCV变体引发的感染。可选择具有结合本文中描述的一种或多种JCV变体多肽的能力的适当的抗体或其片段。抗体或其抗原结合片段可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE或可具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE的免疫球蛋白恒定和/或可变结构域。在某些实施方案中，抗体是双特异性或多特异性抗体。在其它实施方案中，抗体是重组抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体或此类抗体的混合物。在某些实施方案中，抗体是人抗体，例如人单克隆抗体、多克隆抗体或单克隆及多克隆抗体的混合物。抗原结合片段可包括Fab片段、F(ab′)2片段和/或FV片段CDR3。
可产生针对全长JCV-VP1蛋白变体或针对包含JCV-VP1蛋白变体的部分序列的多肽变体的抗体。可通过用抗原(例如，JCV-VP1变体的多肽)注射动物例如兔或山羊或小鼠来产生抗体。
为了制备多克隆抗体，可通过表达适当的克隆载体中的相应DNA序列来在细菌中合成包含JCV-VP1变体的融合蛋白。随后可纯化蛋白质，将其偶联至载体蛋白质并且与弗氏佐剂混合(以帮助刺激由兔产生的抗原应答)，然后将其注射入兔或其它实验室动物。可选地，可从表达所述蛋白质的培养细胞分离该多肽。在以2周1次的间隔加强注射后，然后从兔或其它实验室动物取血并且分离血清。可直接使用血清或在使用之前例如利用方法(例如亲和层析、蛋白质A-Sepharose、抗原Sepharose、抗-小鼠-Ig-Sepharose)纯化血清。随后可将血清用于探测在聚丙烯酰胺凝胶上运行的蛋白质提取物以鉴定JCV变体多肽。可选地，可制备合成JCV变体多肽并且将其用于接种动物。
为了产生单克隆JCV变体抗体，多次注射小鼠(参见上文)，取出小鼠的脾，将其重悬浮于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。脾细胞用作淋巴细胞的来源，所述淋巴细胞中的一些产生具有适当特异性的抗体。随后将所述脾细胞与永生化骨髓瘤伴侣细胞融合，将融合的产物在选择剂(例如HAT)存在的情况下涂铺在许多组织培养孔内。随后通过ELISA筛选孔以鉴定包含表达有用抗体的细胞的孔。随后将此类细胞重新涂铺。在生长一段时间后，再次筛选这些孔以鉴定抗体产生性细胞。进行数次克隆方法直至超过90％的孔包含对于抗体产生为阳性的单个克隆。通过该方法，建立了产生所述抗体的克隆的稳定品系。随后可通过使用蛋白A Sepharose的亲和层析、离子交换层析以及此类技术的变型和组合(参见，美国专利6,998,467)纯化单克隆抗体。
在某些实施方案中，‘人源化’抗体用于人的疗法中。抗体的人源化包括用人序列替代天然小鼠序列以降低治疗性抗体被引入人后免疫应答的概率。
CNS感染
JC多瘤病毒是感染脑和CNS(中枢神经系统)的病毒。患有CNS的微生物感染的受试者可能对变体JC病毒感染和/或CNS中的增殖易感。CNS的微生物感染可包括但不限于细菌、真菌、原生动物、病毒样和病毒感染。感染包括急性和慢性状况。示例性微生物CNS感染可导致脑脓肿、脑膜炎、脑炎、脉管炎或进行性多灶性白质脑病(PML)。CNS的大多数形成脓肿的感染通过血液传播并且与败血病和心内膜炎相关，尽管可存在由窦或中耳/乳突感染引起的直接感染。CNS的细菌感染可包括但不限于由链球菌性肺炎(Streptococcus pneumonia)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肠杆菌科(Enterobacteriacea)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、绿脓杆菌(Pseudomonoas aeruginosa)、奈瑟球菌属(Neisseria meningitis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)或单核细胞增多性利斯特菌(Listeria moncytogenes)引发的感染。CNS的真菌感染不如细菌感染普遍，但可在患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的个体和其它免疫受损的个体例如正在经历化学疗法或免疫抑制疗法的的个体中产生。CNS的原生动物感染的实例是晚期神经锥虫病或昏睡病，所述疾病由原生动物锥虫(trypanosoma protozoa)产生的CNS的感染引起。
CNS的病毒感染包括但不限于无菌性脑膜炎、脑炎和进行性多灶性白质脑病(PML)。与病毒感染相关的急性神经系统综合征包括例如急性病毒性脑炎、驰缓性麻痹(flaccid paralysis)、无菌性脑膜炎和感染后脑脊髓炎。急性病毒性脑炎可以由例如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘、狂犬病或虫媒病毒引起。无菌性脑膜炎的普通病毒剂包括例如肠道病毒、腮腺炎病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus)。感染后脑脊髓炎(Post infectious encephalomyelitis)是具有例如麻疹、腮腺炎、风疹和原发性水痘带状疱疹病毒感染的感染并发症。格-巴二氏综合征(Guillain-barre syndrome)也是与病毒感染相关的急性神经系统综合征。
可归因于病毒感染的另外的慢性神经系统疾病包括亚急性硬化性全脑炎(由持续麻疹感染引起的)、海绵样脑病(朊病毒病)(例如，克雅氏病(CJD)，格斯特曼-施特劳斯纳综合征)和逆转录病毒病(例如，HIV-1和HIV-2)，其特征在于瘫痪、消瘦和共济失调。
因此，本发明的方面可用于评估具有微生物CNS感染的一个或多个症状的患者的PML的风险。
JCV变体的研究
宿主和病毒遗传学可促成PML。聚焦在病毒遗传因子的早期研究鉴定了病毒基因组的调控区中的重复和重排[Pfister LA，Letvin NL，Koralnik IJ(2001)JC virus regulatory region tandem repeats in plasmaand central nervous system isolates correlate with poor clinical outcome inpatients with progressive multifocal leukoencephalopathy.J Virol 75：5672-5676；Major EO，Amemiya K，Tornatore CS，Houff SA，BergerJR(1992)Pathogenesis and molecular biology of progressive multifocalleukoencephalopathy，the JC virus-induced demyelinating disease of thehuman brain.Clin Microbiol Rev 5：49-73；Loeber G，Dorries K(1988)DNA rearrangements in organ-specific variants of polyomavirus JC strainGS.J Virol 62：1730-1735；Martin JD，King DM，Slauch JM，FrisqueRJ(1985)Differences in regulatory sequences of naturally occurring JCvirus variants.J Virol 53：306-311；和Zheng HY，Takasaka T，Noda K，Kanazawa A，Mori H等人(2005)New sequence polymorphisms in theouter loops of the JC polyomavirus major capsid protein(VP1)possiblyassociated with progressive multifocal leukoencephalopathy.J Gen Virol86：2035-2045]。利用非常有限的来自PML和健康个体的样本数目进行的几个研究也报导了关于VP1蛋白的几个突变与PML的可能关联性的矛盾结果[Zheng HY，Takasaka T，Noda K，Kanazawa A，Mori H等人(2005)New sequence polymorphisms in the outer loops of the JC polyomavirusmajor capsid protein(VP1)possibly associated with progressive multifocalleukoencephalopathy.J Gen Virol 86：2035-2045；Zheng HY，Ikegaya H，Takasaka T，Matsushima-Ohno T，Sakurai M 等人(2005)Characterization of the VP1 loop mutations widespread among JCpolyomavirus isolates associated with progressive multifocalleukoencephalopathy.Biochem Biophys Res Commun 333：996-1002；Kato A，Sugimoto C，Zheng HY，Kitamura T，Yogo Y(2000)Lack ofdisease-specific amino acid changes in the viral proteins of JC virusisolates from the brain with progressive multifocal leukoencephalopathy.Arch Virol 145：2173-2182]。未有JCV的蛋白质编码基因的改变与PML的关联性的综合分析的报导。范围从流感病毒[Srinivasan A，ViswanathanK，Raman R，Chandrasekaran A，Raguram S等人(2008)Quantitativebiochemical rationale for differences in transmissibility of 1918 pandemicinfluenza A viruses.Proc Natl Acad Sci U S A 105：2800-2805；和Chandrasekaran A，Srinivasan A，Raman R，Viswanathan K，RaguramS等人(2008)Glycan topology determines human adaptation of avianH5N1 virus hemagglutinin.Nat Biotechnol 26：107-113]至小鼠多瘤病毒[Bauer PH，Bronson RT，Fung SC，Freund R，Stehle T等人(1995)Geneticand structural analysis of a virulence determinant in polyomavirus VP1.JVirol 69：7925-7931；和Bauer PH，Cui C，Liu WR，Stehle T，HarrisonSC等人(1999)Discrimination between sialic acid-containing receptorsand pseudoreceptors regulates polyomavirus spread in the mouse.J Virol73：5826-5832](人JCV的近亲)的病毒的致病性经显示由参与病毒衣壳蛋白与唾液酸化聚糖受体的结合的氨基酸序列决定。病毒对其细胞受体的亲和力和特异性的改变影响病毒的感染性和传播，从而在毒力中起着至关重要的作用。例如，小鼠多瘤病毒的研究显示VP1氨基酸的改变而非非编码调控区的改变负责增加的病毒的致病性。
本发明的方面通过涉及VP1蛋白和其与PML的关系的实验来举例说明。将分子进化的方法用于确定假定的适应性改变存在于与PML相关的VP1氨基酸序列中。该方法优于简单的序列变体与疾病的统计关联性的有利方面是其考虑了病毒株系的系统发生关系并且还允许通过检查序列进化的速率来鉴定功能上重要的氨基酸位点。
根据本发明的方面，如果含有置换的病毒在待分离的PML患者的CNS中足够丰富，那么其具有足够的感染性。在某些实施方案中，预测聚糖特异性的改变使JCV失去其对在CNS外表达的唾液酸化聚糖(例如，RBC)的特异性。因此，这样的病毒在周围组织中避免被捕获在“假受体”上，从而可无阻碍地从病毒排除的位置移动进入脑。突变的病毒必须仍然保持其对在少突胶质细胞上表达的聚糖的特异性。这与来自小鼠多瘤病毒模型的观察相一致，在所述模型中与JCV的位点269直向同源的位点中的突变影响病毒结合RBC的能力并且也导致病毒在动物全身散布的急剧增加，从而产生致命结果[Dubensky TW，Freund R，Dawe CJ，BenjaminTL(1991)polyomavirus replication in mice：influences of VP1 type androute of inoculation.J Virol 65：342-349；和Freund R，Garcea RL，SahliR，Benjamin TL(1991)A single-amino-acid substitution in polyomavirusVP1 correlates with plaque size and hemagglutination behavior.J Virol65：350-355]。此外，有几篇在许多无症状感染的个体的扁桃体中检测到JCV的报导[Kato A，Kitamura T，Takasaka T，Tominaga T，Ishikawa A等人(2004)Detection of the archetypal regulatory region of JC virus fromthe tonsil tissue of patients with tonsillitis and tonsilar hypertrophy.JNeurovirol 10：244-249；和Monaco MC，Jensen PN，Hou J，Durham LC，Major EO(1998)Detection of JC virus DNA in human tonsil tissue：evidence for site of initial viral infection.J Virol 72：9918-9923]。虽然该观察被用作支持扁桃体细胞的JCV感染，但其也可用淋巴细胞的病毒捕获来解释。这与JCV在扁桃体组织中结合唾液酸相一致[Eash S，TavaresR，Stopa EG，Robbins SH，Brossay L等人(2004)Differential distributionof the JC virus receptor-type sialic acid in normal human tissues.Am JPathol 164：419-428]。
根据本发明，鉴于对PML特异的突变的巨大数量，可能超过一个机制(例如，两个或更多个机制)可在不同的PML案例的PML病因学中起作用。根据本发明的某些方面，PML相关VP1突变可增加JCV对脑白质细胞的向性，从而导致增加的病毒感染性和少突胶质细胞中的重复。根据本发明的其它方面，PML中的突变可允许病毒免疫逃避。在针对VP1分子的多克隆免疫应答中，只有有限数量的针对细胞受体结合位点(唾液酸)的抗体可提供抗病毒感染的传播的保护作用。对于保护性免疫至关重要的表位内的氨基酸的突变可使病毒结合其靶细胞并且无限制地传播。
本文中描述的实验阐述了某些突变如何在PML中发生的以及为什么虽然JCV的流行非常高但只有小部分免疫缺陷患者发生PML的原因。根据本发明的方面，突变在病毒系统发生树上的聚类的不存在表明它们在个体患者中独立地产生而非作为病原性病毒变体持续存在于一般群体中。根据本发明的方面和基于本文中描述的实验，VP1突变在PML发生的机制中起着非常重要的作用。一旦影响唾液酸结合的特定突变发生，其允许病毒传播至脑并且感染少突胶质细胞。在肾中未检测到突变病毒的事实表明聚糖结合的特定改变在肾中不给突变的病毒提供任何选择优势。突变可能已存在，从而允许病毒在PML之前不久或很久以前在免疫抑制的条件下在脑中居住。由于在无症状个体的脑中未检测到病毒复制，因此在PML发展之前的区室化的进化(例如，CNS内)不可能解释突变的VP1在PML患者的CNS中存在。然而，正常脑中JCV潜伏的组织仍有争议，因此非突变病毒在形式上仍然可能进入脑并且突变在脑中而非在周围组织例如肾中产生。
根据本发明的方面，健康免疫系统有效地控制病毒在脑中的活化。然而，一旦免疫系统在某些具有这样的突变病毒的个体中变弱，病毒就开始在少突胶质细胞中活跃地增殖，从而引发PML。健康的免疫系统也可能在它们的周围部位(例如，肾)高效地抑制新产生的突变体并且阻止它们传播和感染新的靶细胞。因此PML发展的时间选择可以是突变限制的并且与环境或宿主遗传因子的相互作用可促成PML的非确定性发展。此外，PML发展可受到VP1突变与病毒的另外的遗传改变(包括病毒调控区的重排)的相互作用控制，因为其可能为病毒提供在少突胶质细胞中增加病毒复制的额外选择有利性。
根据本发明的方面以及如本文中描述的实施例所举例说明的，影响其受体特异性的JCV VP1突变可以导致PML病理学的原因。这些结果提供了发现由此类病毒引发的疾病的新型抗多瘤病毒治疗剂和诊断剂的机会。这些突变在PML的病因学中所起的确切作用以及它们是如何以及在何处产生的需要进一步广泛的研究，所述研究包括来自不同器官(例如，尿、血液、CSF)和来自许多PML患者的纵向和时间匹配的样本的VP1序列分析。
来自连续样本的VP1序列的研究，如本文中所描述的，显示相同的病毒株系始终存在于病程中。由于突变的病毒代表普遍或单独的群体并且其随时间的过去得到保持，因此其似乎对于感染的传播是必要且充分的。值得注意的是，在经历第一次PML发作后存活的患者复发的情况下获得另外的置换。该观察表明，首先，先前的突变病毒在CNS或周围组织中有效地存活和，其次，新的置换的出现可触发新的PML发作。在某些实施方案中，新突变的病毒可在于最适度以下的免疫控制下病毒活化的背景中产生并且一旦其出现，其可以不被免疫系统迅速识别。
在某些实施方案中，本发明的方面涉及PML患者中CSF的身份和血浆VP1的序列。血浆分离的和CSF分离的病毒似乎同样地与尿分离的病毒不同，即使通过分析排除了突变。这表明CSF和血浆群体并非独立地从尿中产生而是这些群体之一与尿群体源自相同的来源并且另一个群体源自所述第一群体。虽然在PML患者的尿中未观察到具有PML生成的突变的VP1序列，但在病毒于肾中复制的过程中最初获得的突变未接受优于定居/固有非突变病毒的任何竞争优势以在肾部位成为占优势或甚至可检测的群体。这与从大多数突变的VP1分子制备的VLP已失去结合肾小管上皮细胞(肾中病毒感染的部位)的能力的观察相一致。
根据本发明的方面，不希望受理论限制，当突变引起病毒失去其对一种或多种广泛存在的含唾液酸的受体的特异性时，突变病毒(在血液循环中)比野生型病毒更可能逃避被在周围中的绝大多数细胞上表达的含唾液酸寡糖假受体捕获。因此，突变病毒更可能到达脑或至少血脑屏障(BBB)。一旦病毒设法绕过周围障碍并且到达BBB，那么其仍然必须要穿过内皮细胞层才能到达CNS。在某些实施方案中，PML的极罕见的发生(甚至在具有显著的免疫抑制的患者中)可归因于所需的暂时的一系列独立罕见事件例如某些突变病毒颗粒的出现和BBB开放的存在。
VP1蛋白的突变通过增加病毒逃避周围循环进入CNS的机会促成PML进展的假说与约10％的全部PML案例含有非突变病毒的观察相一致。因此如果存在可压倒病毒假受体的周围防御的高水平病毒血症并且如果还同时存在BBB的短暂开放，那么即使非突变病毒也可能进入CNS。然而，一旦病毒进入脑中，突变与非突变病毒之间在其感染少突胶质细胞和在CNS中传播的能力上可能没有差异，这与保留的突变型VLP结合CNS来源的星形细胞(JCV在进行脑感染过程中的另一个靶)的能力相一致。可选地，VP1突变可能已在病毒在CNS中复制的过程中产生，这是由于因其为病毒在脑中扩散提供了一定竞争优势而在CSF中变得占优势。由于大多数所分析的样本具有全部或超过95％的全部包含突变的分离的克隆，因此为了使最新的假说为真，突变必须在病毒在脑中复制的过程中极早发生。由于在VP1中不具有突变的病毒可相当成功地感染CNS细胞，因此突变不能通过获得对CNS细胞的病毒嗜性来提供竞争优势，虽然它们可能提高其。仍然不能在正式地排除至少在一些案例中病毒以非突变形式进入脑并且在患者中在免疫抑制的条件下在其在CNS内活化的过程中获得突变的可能性。
无论选择的位点如何，JCV VP1置换似乎是病毒PML-遗传潜能的关键。病毒衣壳和包膜蛋白对于介导病毒至病毒靶细胞的附着和感染性是至关重要的。因此，流感HA蛋白的突变允许病毒改变其对唾液酸结合的精细特异性和病毒从zootropic感染性转换至人感染性的能力。类似地，此类突变中的一些经显示通过将特异性从在肺叶上部的细胞上优先表达的唾液酸改变至在肺的下部表达的唾液酸而与人群体中增加的流感病毒毒力(如例如1918年流感所强调的)相关。病毒籍以获得毒力的增加的另一个机制可能是通过失去其广泛的受体特异性，所述广泛的受体特异性使病毒被捕获在其未有效地感染的细胞上。这样的机制的最佳实例之一来自另一种多瘤病毒鼠多瘤病毒在小鼠中的感染的研究。在该模型中已显示与JCV的至关重要的PML生成的位点269结构上直向同源的位点296上的突变显著改变了病毒对唾液酸的特异性并且影响病毒结合靶细胞和RBC的能力，并且也导致病毒遍布整个动物的显著增加，从而导致致命结果。因此，影响病毒与其受体结合的病毒衣壳蛋白的改变似乎是在改变病毒发病机制和毒力中起着至关重要作用的极常见的机制，人多瘤病毒也不例外。
在一些方面中，在来自受试者的样本中检测到位点55和269上至苯丙氨酸的突变。在其它方面中，至少这些突变被检测到并且表示受试者表现为最常见的，这暗示着这2个位点处于强选择压力下并且为JCV病毒提供引发PML的最有利方面。该观察与这两个位点上的突变消除病毒结合周围细胞和含唾液酸寡糖的能力强相关，从而表明功能的该特别丢失对于病毒得到比其它突变更频繁地阳性选择是最有利的。如在本文中其它地方更详细地描述的，这些位点各自在当前的研究中占有25％的全部突变，位点267、265和60的频率第2高，各自占有7.5％的全部案例。有趣地，来自几个患者的CSF样本包含两个或更多个不同的病毒群体，各群体具有其自己的PML特异性突变，没有病毒同时包含两个此类突变。因此，本发明的某些方面提供了：几个不同的突变可在正常病毒复制中独立地产生并且如果每一个突变为病毒提供优于非突变病毒的竞争优势，那么所述突变全都可能获得选择。在3个案例，或来自该研究的约10％的全部案例中，在CSF和/或血浆中未发现PML相关置换。JCV基因组的其它遗传改变例如包括较小的病毒衣壳蛋白VP2或VP3中的突变，也可能在这些案例中被假设来解释与PML相关的此类病毒的存在。
本发明进一步通过下列实施例来举例说明，所述实施例绝不应当解释为进一步限定。将整个本申请中引用的全部参考资料(包括文献参考、发布的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的完整内容明确地通过引用并入。
实施例
实施例1：通过PCR检测JCV变体
使用已建立的方案(例如，细胞裂解)从生物样本分离核酸。因为病毒DNA可能已整合在基因组DNA中或可仍然以更小的实例存在，因此分离基因组DNA和更短的DNA序列并且将其经历PCR分析。在分离后，将核酸重悬浮于将促进PCR分析的缓冲液中。促进PCR分析的缓冲液对于本领域技术人员(例如，Maniatis)来说是已知的，并且也可从PCR酶的制造商(例如，New England Biolabs，Beverly，MA)商购获得。设计核苷酸引物来扩增JCV-VP1基因。PCR扩增是已建立的实验室技术，并且包括核酸引物、聚合酶和单核苷酸以及聚合酶缓冲液的添加以及使该混合物经历退火、扩增和解离的循环，从而导致所需DNA序列的扩增。在扩增后，将JCV-VP1基因与残留的DNA和过量单核苷酸分离。测定扩增的JCV-VP1DNA并且将所得的核苷酸序列翻译成肽序列。随后将该肽序列与变体实验对象组相比较以确定存在于生物样本中的JCV-VP1多肽变体。
实施例2：使用ELISA检测JCV变体
使用标准实验室技术(例如，Maniatis)来分离蛋白质和肽。将细胞蛋白质和非细胞组分的蛋白质进行分析。在一个测定中，检查包含本发明的一个或多个变体的JCV-VP1多肽是否存在于在样本中。使用包括对本发明的JCV-VP1多肽特异的抗体的夹心ELISA检测多肽。通过用本发明的JCV-VP1多肽接种动物(例如，兔)来产生抗体，产生多克隆抗体。如果需要，可从接种的动物收获细胞以产生单克隆抗体。用于产生多克隆和单克隆抗体的方法在本领域内是常规的。将抗JCV-VP1多肽变体的抗体以每孔或每表面积一种抗体类型固定在固体表达(例如，96孔板)。向孔中加入包含多肽的生物样本并且与固定的抗体一起温育。存在于样本中的任何多肽JCV-VP1变体将结合对所述多肽特异的抗体。在温育后，除去样本，清洗固体表面以除去任何未结合的物质。作为下一步骤，向孔中加入含有对JCV-VP1肽特异的另外的抗体的溶液。该抗体的第二等分试样将产生“夹心”(例如，固定的抗体：JCV-VP1多肽：第二抗体)。可以使用例如标记的第三抗体检测该第二抗体，从而允许检测JCV-VP1变异多肽。可选地，可标记第二抗体本身。
在第二ELISA测定中，测定抗一种或多种JCV-VP1变异多肽的抗体是否存在于生物样本中。该测定可用于确定受试者当前是否感染JCV-VP1变体或之前是否已暴露于所述变体。即使JCV-VP1变体不再存在，但抗所述变体的抗体可仍然存在于生物样本中并且可被检测到。在该ELISA测定法中，将连接至固体表面的JCV-VP1多肽和生物样本与此类多肽一起温育。如果对此类多肽特异的抗体存在于生物样本中，那么它们将结合所述多肽。再次除去任何未结合的物质。使用标记的第二抗体检测结合的抗体的存在。
实施例3：确定VP1蛋白质的溶剂可达表面区域的组成
可达表面区域计算需要生物分子的3D坐标的知识。利用SV40病毒样颗粒的CoA1的结构作为模板(PDB ID：1SVA)构建JCV VP1病毒样颗粒的同源模型。MODELER(A.Sali & T.L.Blundell.Comparative proteinmodelling by satisfaction of spatial restraints.J.Mol.Biol.234，779-815，1993)算法用于模型构建，而SCWRL3(A.A.Canutescu，A.A.Shelenkov，和R.L.Dunbrack，Jr.A graph theory algorithm for protein side-chainprediction.Protein Science 12，2001-2014(2003))方法用于侧链位置完善。使用Lee和Richards′s法(B.Lee B & F.M.Richards.TheInterpretation of Protein Structures：Estimation of Static Accessibility.J.Mol.Biol 55，379-400(1971))计算使用氨基酸侧链的极性和非极性溶剂可达表面区域。随后，构建JCV VP1变体的病毒样颗粒的3D模型，接着计算它们的侧链的极性和非极性溶剂可达表面区域。通过从共有序列的极性溶剂可达表面区域减去基于每氨基酸侧链的变体的极性溶剂可达表面区域来计算变体上极性表面区域的差异。通过将共有序列的非极性溶剂可达表面区域减去基于每氨基酸侧链的变体的非极性溶剂可达表面区域来计算变体上的非极性表面区域的差异。计算结果示于表3中。
表3.
实施例4：JCV序列的序列分析
PML是由JCV病毒感染和易感个体的多个脑病灶中被感染的少突胶质细胞的破坏而引发的进行性和通常致命的脱髓鞘病。虽然JC病毒在人群体中高度流行，但PML是罕见疾病，该疾病专门地只折磨小百分比的免疫受损的个体，包括受HIV或免疫抑制药物影响的那些个体。特定的病毒和/或宿主特异性因子而非仅仅免疫状态一定参与解释病毒流行与低发病率之间的巨大矛盾。根据本发明，JC病毒衣壳蛋白VP1表面上的几个氨基酸在从PML分离的病毒序列中但非在从健康受试者分离的序列中显示加速的进化。本文中描述的实例提供了强有力的证据：这些突变中的至少一些参与对唾液酸(JC病毒的已知受体)的结合。分子进化的统计方法用于进行从55个PML患者分离的JC病毒VP1序列和从健康个体的尿中分离的253个序列的综合分析，并且发现仅在PML VP1序列中发现的氨基酸的亚组通过适应进化获得。JC病毒衣壳的3D结构的建模显示这些残基位于唾液酸结合位点(细胞感染的JC病毒受体)内。通过显示由具有这些突变的VP1蛋白制备的病毒样颗粒的血凝集性质的显著减弱来证明这些位点中的一些参与受体结合。这些结果一起表明可通过改变病毒对其细胞受体的特异性的适应进化获得JC病毒的更具毒力的引发PML的表型。
方法：
从Genbank下载35个从PML患者分离的JC病毒的全长VP1序列和253个从健康受试者分离的JC病毒的全长VP1序列。此外，可从Genbank获得20个部分VP1序列，这使得能够分析总共55个序列的位点43-287。除了这55个从PML患者分离的VP1序列之外，表4还包括来自可从Sala等人[Sala M，Vartanian JP，Kousignian P，Delfraissy JF，Taoufik Y等人(2001)progressive multifocal leukoencephalopathy inhuman immunodeficiency virus type 1-infected patients：absence ofcorrelation between JC virus neurovirulence and polymorphisms in thetranscriptional control region and the major capsid protein loci.J GenVirol 82：899-907]的出版物获得的另外12个部分序列的信息。在这些实例中应当指出：除一个样本分离自肾外，从PML患者分离的全部病毒样本均源自脑或CSF组织(表4)。从健康受试者分离的全部病毒样本源自尿。利用TCoffee[Notredame C，Higgins DG，Heringa J(2000)T-Coffee：Anovel method for fast and accurate multiple sequence alignment.J MolBiol 302：205-217]构建多重序列比对。从相同的个体分离许多PML序列。在研究病毒序列的进化中，接受相同患者分离的序列用于分析，只要它们彼此相差1个以上的核苷酸。然而，从分析中排除了相同的“克隆”序列。这导致从PML患者分离的28个全长VP1序列和42个部分VP1序列的最终组。关于序列的起源和克隆形成能力(clonality)的所有信息包括在表4中。使用PhyML最大似然法[Guindon S，Gascuel O(2003)A simple，fast，and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximumlikelihood.Syst Biol 52：696-704]，利用F84置换模型[Kishino H，Hasegawa M(1989)Evaluation of the maximum likelihood estimate of theevolutionary tree topologies from DNA sequence data，and the branchingorder in hominoidea.J Mol Evol 29：170-179和Felsenstein J，ChurchillGA(1996)A Hidden Markov Model approach to variation among sites inrate of evolution.Mol Biol Evol 13：93-104.]以及使用包括在PHYLIP软件包(Felsenstein，J.2005.PHYLIP版本3.6.Distributed by the author.Department of Genome Sciences，University of Washington，Seattle)中的几个方法建立系统发生树。使用PAML[Yang Z(1997)PAML：a programpackage for phylogenetic analysis by maximum likelihood.Comput ApplBiosci 13：555-556]进一步分析从PML患者分离的VP1序列和从健康受试者分离的序列的随机亚组。研究多个序列进化模型(M0-M8)。使用似然比检验评估模型M1与M2之间的差异以测试阳性选择。在全长组或部分组的分析中具有超过0.5的贝叶斯经验贝叶斯后验概率(Bayes EmpiricalBayes posterior probabilities)的残基报告于表5中。将蛛猴[Poon AF，Lewis FI，Frost SD，Kosakovsky Pond SL(2008)Spidermonkey：rapiddetection of co-evolving sites using Bayesian graphical models.Bioinformatics 24：1949-1950]用于分析上位相互作用。通过Datamonkeyweb服务器[Pond SL，Frost SD(2005)Datamonkey：rapid detection ofselective pressure on individual sites of codon alignments.Bioinformatics21：2531-2533]运行分析蛛猴。
表4.
来自非PML患者的JCV VP1序列：
BAC66394，BAC66418，BAC66382，BAB11716，BAB11722，AAK28466，AAK28460，AAK28478，
BAC66400，BAC66388，BAD06126，BAC66406，AAK97970，AAK97964，BAC81952，BAC81958，
AAM89309，AAM89303，BAC81922，BAC81916，BAC81910，BAC81904，AAM89297，BAD11896，
BAC81946，BAE45426，BAE45360，BAD06120，BAE45432，BAA01962，BAE45420，BAE45414，
BAE45384，BAE45378，BAE45372，AAK98036，BAE45402，BAE45408，BAE45396，BAE45444，
BAD06024，BAE75838，BAE75832，BAE75826，BAE75820，BAE75814，AAK98030，AAK98024，
AAK98018，AAK98010，AAK98006，AAK98000，BAE45438，BAE45390，BAD06108，BAD06102，
BAD06096，BAD06090，BAD06084，BAD06048，BAD06030，BAD06018，BAD06054，BAD06042，
BAD06036，AAG30857，BAE45366，AAN85455，BAD06150，AAN85449，AAK98042，BAD06174，
BAD06156，BAD06072，BAD06060，AAN85473，BAC81840，BAF40841，BAF40835，BAF40829，
BAF40823，BAF40811，BAF40847，BAF40781，BAF40817，BAF40799，BAF40793，BAF40787，BAF40745，
AAN85467，AAN85461，BAC81834，BAF40751，BAF40805，BAA01961，BAD98972，BAD98966，
BAD06227，BAC66430，BAC66412，BAD91887，BAD21235，BAD27118，BAC66424，BAA01958，
BAB11710，BAD21265，BAD21259，BAD21253，BAD21241，BAD21229，BAD21247，BAD21283，
BAD21271，BAD21295，BAD21289，BAA01959，BAA01960，BAD11848，BAD11842，AAM89339，
AAM89327，BAD11836，BAC81852，BAC81858，BAD06144，AAG37198，AAM89315，BAD06138，
BAD11890，BAD11884，BAD11878，BAD11872，BAD11866，AAK97994，BAB11698，BAC81940，
BAC81964，AAK97946，BAD06066，BAF40769，BAC81870，BAC81864，BAC81934，BAC66376，
BAC81874，BAC81846，AAK97940，BAC81898，BAC81892，AAK97922，AAK97916，AAK97910，
AAK97982，BAF40763，BAD06078，AAK97958，BAD11860，BAF40757，BAD06162，AAM89321，
BAD11854，AAK97928，BAD11830，BAF40775，BAB11704，BAC81928，AAK97988，BAD11902，
BAD11824，BAD06233，BAC81886，BAC81880，AAM89345，BAD06168，AAM89333，BAD06132，
BAC82365，AAK97952，BAA01964，BAA01963，AAK97934，BAD06114，AAK97976，BAD21277，
AAR13077，BAE02908，AAR12957，AAR02463，AAR02457，BAE03058，AAR89235，BAE02896，
AAR89241，BAE02890，BAE03064，BAE03070，BAE03082，AAG34673，AAG34667，AAR89205，
AAR89217，AAR13659，BAE03088，BAE03160，AAQ88264，AAR89187，AAR89283，AAK28472，
AAR06661，AAR89253，AAR89247，AAR89199，AAR89193，AAR89229，AAR89223，AAR89265，
AAR32743，AAR89277，BAE03166，BAE02920，BAE02914，BAE03112，BAE03106，BAE03100，
BAE03094，BAE03076，BAE02944，BAE02998，BAE02992，BAE02986，BAE02980，BAE02974，
BAE02968，BAE02962，BAE03016，BAE02902，BAE03040，AAR89211，AAR89271，BAE02956，
BAE02938，BAE02932，BAE03148，BAE02950，BAE03004，BAE03154，BAE03142，BAE03136，
BAE03130，BAE03124，BAE03118，BAE02926。
Figure BPA00001444948100671
Figure BPA00001444948100681
Figure BPA00001444948100691
结果：
从GenBank下载JCV VP1基因序列(表4)并且将其用于构建从健康个体分离的序列和从不同PML患者分离的全长序列的随机亚组的系统发生树(图4a)。图4是PML相关病毒的系统发生分布。(A)引发PML的JCV病毒的宽广的系统发生分布。指示了相应于引发PML的病毒和从健康受试者分离的病毒的树分支(用GI编号标记的)。使用最大似然法基于VP1基因的DNA序列构建树。每个患者只包括一个序列。(B)密码子269的突变的系统发生分布。树表示从PML患者分离的病毒的VP1基因(用GI编号标记的)。利用文本插入指示Ser269密码子的突变。分支上的圆圈反映aLRT支持。在构建树之前遮蔽位点269以避免具有该密码子的突变的分支的吸收。将PhyML最大似然法[Guindon S，Gascuel O(2003)Asimple，fast，and accurate algorithm to estimate large phylogenies bymaximum likelihood.Syst Biol 52：696-704.]与F84置换模型[Kishino H，Hasegawa M(1989)Evaluation of the maximum likelihood estimate of theevolutionary tree topologies from DNA sequence data，and the branchingorder in hominoidea.J Mol Evol 29：170-179和Felsenstein J，ChurchillGA(1996)A Hidden Markov Model approach to variation among sites inrate of evolution.Mol Biol Evol 13：93-104]一起使用。合并在PHYLIP软件包中的几个方法(系统发生重建的最大似然法、距离法和简约法)的应用产生相似的结果。从PML患者分离的病毒序列未聚类在系统发生树上并且广泛地分布在病毒类型和样本的地理起源之间(图4a)。这可得到极低的群体分层量度FST[Slatkin M，Maddison WP(1990)Detecting isolation bydistance using phylogenies of genes.Genetics 126：249-260](1.8％)的进一步支持。与早期研究[Zheng HY，Takasaka T，Noda K，Kanazawa A，Mori H等人(2005)New sequence polymorphisms in the outer loops of theJC polyomavirus major capsid protein(VP1)possibly associated withprogressive multifocal leukoencephalopathy.J Gen Virol 86：2035-2045，Jobes DV，Chima SC，Ryschkewitsch CF，Stoner GL(1998)Phylogeneticanalysis of 22 complete genomes of the human polyomavirus JC virus.JGen Virol 79(Pt 10)：2491-2498，和Agostini HT，Deckhut A，Jobes DV，Girones R，Schlunck G等人(2001)Genotypes of JC virus in East，Centraland Southwest Europe.J Gen Virol 82：1221-1331]相一致，引发PML的病毒不限于指定的病毒系统发生类型。
使用来自从PML患者分离的病毒的序列以及来自健康受试者的所述序列，目的是确定PML相关进化选择压力是否作用于病毒VP1基因。该分析利用经设计用以鉴定在阳性选择下密码子进化的存在的PAML软件包[Yang Z(1997)PAML：a program package for phylogenetic analysis bymaximum likelihood.Comput Appl Biosci 13：555-556]。PAML利用参数似然比检验评估多个进化模型。测试几个模型，包括中性进化的模型、近中性模型(其允许纯化(例如，阴性)选择)和非均相模型(其允许一些密码子位点在阳性选择下进化并且其它密码子位点在阴性选择或在中性下进化)(表5)。也可测试许多更复杂的模型。
在来自从健康受试者分离的JCV的VP1序列的情况下，包括中性进化密码子和在净化选择下的密码子的混合物的近中性进化模型明显优于纯中性模型(p值7.0×10-6)。然而，对于更复杂的模型(包括具有阳性选择的模型)未发现统计支持。相反地，对于从PML患者分离的VP1序列，允许密码子在阳性选择下进化导致模型似然性的高度显著的增加(表5)。具有3类位点(包括在净化选择下进化的位点、中性位点和在阳性选择下的位点)的模型比只限制于中性位点和在净化选择下的位点的近中性模型显著更好地解释了数据(p值2.5×10-7)。更复杂的模型未显示优于具有3类密码子的最简单的模型的显著提高。
在全长序列的PML取样中，4个密码子位点(相应于氨基酸55、60、267和269)被鉴定为在阳性选择下进化(表5)。这些密码子位点的由PAML计算的阳性选择的贝叶斯后验概率高于0.5。密码子269的阳性选择的后验概率接近1。为了增强分析的能力，加入来自从PML患者分离的JC病毒的部分VP1序列。部分序列的加入显示密码子265的阳性选择的信号265(表5)。
表5.PML样本中在阳性选择下的密码子。
Figure BPA00001444948100711
在该实施例中，未在相同的JCV分离株中观察到2个VP1突变。利用蛛猴[Poon AF，Lewis FI，Frost SD，Kosakovsky Pond SL(2008)Spidermonkey：rapid detection of co-evolving sites using Bayesiangraphical models.Bioinformatics 24：1949-1950]法进行的分析显示位点55与269之间和位点60与269(后验概率分别为0.88和0.70)之间的上位相互作用。这可反映“收益递减的”上位相互作用，例如随后的突变不是有益的并且可能对单突变的背景有害。
这5个密码子的全部置换明确地与PML相关。至少52％的从PML患者分离的JC病毒(或69个序列中的36个，包括部分序列)具有此类突变的至少一个，然而未在来自健康受试者的253个全长病毒序列中观察到任何此类置换(表6)。
表6.JCV VP1序列的氨基酸变异性
Figure BPA00001444948100721
用更暗的阴影突显的残基在PML和非PML组之间是不同的并且具有大于0.5的阳性选择的贝叶斯经验贝叶斯后验概率(表5)。用更浅的阴影突显的残基在PML与非PML组之间是不同的。
检测PML样本中编码位点269上的氨基酸的密码子的阳性选择的最强信号。图4b显示在来自PML相关病毒的VP1中观察到Ser269至芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸的多个独立突变。多个独立突变的存在不是系统发生重建的假像，因为具有突变变体的谱系被多个分支分隔，这得到超过90％的靴值分析(bootstrap analysis)的支持和PhyML中执行的似然比检验[Guindon S，Gascuel O(2003)A simple，fast，and accurate algorithm toestimate large phylogenies by maximum likelihood.Syst Biol 52：696-704]的支持。这些谱系相应于之前鉴定的JC病毒的不同系统发生类型并且来自不同地理位置[Jobes DV，Chima SC，Ryschkewitsch CF，StonerGL(1998)Phylogenetic analysis of 22 complete genomes of the humanpolyomavirus JC virus.J Gen Virol 79(Pt 10)：2491-2498和AgostiniHT，Deckhut A，Jobes DV，Girones R，Schlunck G等人(2001)Genotypesof JC virus in East，Central and Southwest Europe.J Gen Virol 82：1221-1331]。
使用PAML[Yang Z(1997)PAML：a program package forphylogenetic analysis by maximum likelihood.Comput Appl Biosci 13：555-556]进一步分析从PML患者分离的VP1序列和从健康受试者分离的序列的随机亚组。
检查并入PAML中的序列进化的PAMultiple模型，包括完全中性模型(M0)、近中性模型(M1)、具有阳性选择的模型(M2)和另外的更复杂的模型(M3-M8)。将似然比检验(LRT)用于比较模型M1与M2之间的差异以测试阳性选择。连同每一个密码子位点的贝叶斯后验概率一起显示了3个数据集组中阳性选择的P值。显示了具有超过0.5的贝叶斯经验贝叶斯后验概率的残基。
实施例5：鉴定落在唾液酸结合位点中的突变
方法：
使用MPyV VP1的结构(蛋白质数据库ID：1VPS[Stehle T，HarrisonSC(1997) High-resolution structure of a polyomavirusVP1-oligosaccharide complex：implications for assembly and receptorbinding.Embo J 16：5139-5148]作为模板，利用MODELER[Sali A，Blundell TL(1993)Comparative protein modelling by satisfaction ofspatial restraints.J Mol Biol 234：779-815]构建JCV VP1蛋白五聚体单位的同源模型。基于结合至MPyV VP1[Stehle T，Harrison SC(1997)High-resolution structure of a polyomavirus VP1-oligosaccharidecomplex：implications for assembly and receptor binding.Embo J 16：5139-5148]的NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc的结构构建NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖的模型。在CHARMM[Brooks BR，Bruccoleri RE，Olafson BD，States DJ，Swaminathan S等人(1983)CHARMM：A program for macromolecularenergy，minimization，and dynamics calculations.Journal ofComputational Chemistry 4：187-217]中精细地完善JCV VP1/NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖的模型并且使用PyMOL可视化软件(The PyMOL Molecular Graphics System(2002)DeLano Scientific，Palo Alto，CA，USA.www.pymol.org)分析该模型。
结果：
根据本发明的方面，可通过基于MPyV VP1/寡糖复合物的晶体结构[Stehle T，Harrison SC(1997)High-resolution structure of a polyomavirusVP1-oligosaccharide complex：implications for assembly and receptorbinding.Embo J 16：5139-5148]构建结合至NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖的JC病毒VP1的三维分子结构来评估5个鉴定的氨基酸位点的功能作用。图5a中显示的结构模型表明全部PMAL鉴定的氨基酸在VP1蛋白的表面上集簇在唾液酸结合位点上并且可能参与唾液酸结合。图5是JCV VP1/NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖复合物的结构模型。(A)与NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖复合的JCV VP1基本五聚体的模型。显示了JCV VP1的5条链的结构。显示了结合核心唾液酸所必需的RG基序。指示了由PAML确认的PML相关突变残基(L55、K60、S265、S267、S269)。还显示了PML相关样本所特有的其它突变(S61、D66、S123、H129、V223和Q271)。(B)NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖/JCV VP1复合物的近视图。经预测与JCV VP1的S269等同的MPyV VP1的V296的位置示于网格中。此外，在某些实施方案中，L55F、K60M、S267F和S269F置换可诱导与建模的糖空间碰撞，从而导致相互作用的亲和力减弱。在多个流感病毒(小鼠多瘤病毒和小鼠细小病毒)的研究中，对唾液酸的亲和力与病毒的致病性相关[Srinivasan A，Viswanathan K，Raman R，Chandrasekaran A，Raguram S等人(2008)Quantitative biochemicalrationale for differences in transmissibility of 1918 pandemic influenza Aviruses.Proc Natl Acad Sci USA 105：2800-2805，Bauer PH，Cui C，LiuWR，Stehle T.，Harrison SC等人(1999)Discrimination between sialicacid-containing receptors and pseudoreceptors regulates polyomavirusspread in the mouse.J Virol 73：5826-5832和Nam HJ，Gurda-WhitakerB，Gan WY，Ilaria S，McKenna R等人(2006)Identification of the sialicacid structures recognized by minute virus of mice and the role of bindingaffinity in virulence adaptation.J Biol Chem 281：25670-25677]。具体地，小鼠多瘤病毒(JC病毒的近亲)的致病性被定位至位点296上的VP1氨基酸置换[Bauer PH，Bronson RT，Fung SC，Freund R，Stehle T等人(1995)Genetic and structural analysis of a virulence determinant inpolyomavirus VP1.J Virol 69：7925-7931]，与人JC病毒的位点269直向同源的位点，该位点在本研究中在引发PML的病毒分离株中显示最强的阳性选择的信号。如图5b中所示，人JC病毒的丝氨酸269和小鼠多瘤病毒的缬氨酸296在唾液酸结合口袋中占据等同的位置。
位点61、66、123、129、223和271全都限制于PML样本中(表6)并且也与唾液酸结合口袋相一致(图5b)。这些残基因较小的样本大小而可能未被PAML分析检测出并且PML的发展可能在大多数案例中伴随着参与唾液酸结合的氨基酸的阳性选择。分析中系统发生树的长度较短，从而限制检测阳性选择的能力[Anisimova M，Bielawski JP，Yang Z(2001)Accuracy and power of the likelihood ratio test in detecting adaptivemolecular evolution.Mol Biol Evol 18：1585-1592和Anisimova M，Bielawski JP，Yang Z(2002)Accuracy and power of bayes prediction ofamino acid sites under positive selection.Mol Biol Evol 19：950-958]。用于使用短树检测阳性选择的似然比检验是保守的[Anisimova M，Bielawski JP，Yang Z(2001)Accuracy and power of the likelihood ratiotest in detecting adaptive molecular evolution.Mol Biol Evol 18：1585-1592]，贝叶斯经验贝叶斯分析具有有限的能力[Anisimova M，Bielawski JP，Yang Z(2002)Accuracy and power of bayes prediction ofamino acid sites under positive selection.Mol Biol Evol 19：950-958]。因此，还可阳性选择另外的PML特异性VP1突变。残基107上的突变也仅发现于PML样本中。然而，其未显示根据PAML的阳性选择的证据并且不位于唾液酸结合口袋中。
实施例6：JCV突变体和唾液酸结合
方法：血凝集测定法和病毒样颗粒
如之前所描述的[Chapagain ML，Nguyen T，Bui T，Verma S，Nerurkar VR(2006)Comparison of real-time PCR and hemagglutinationassay for quantitation of human polyomavirus JC.Virol J 3：3和PadgettBL，Walker DL(1973)Prevalence of antibodies in human sera against JCvirus，an isolate from a case of progressive multifocalleukoencephalopathy.J Infect Dis 127：467-470]进行血凝集测定法。简而言之，将人O型血洗涤2次，以约0.5％的终浓度悬浮于Alsever缓冲液(20mM柠檬酸钠，72mM NaCl，100mM葡萄糖，用醋酸调整的pH 6.5)中。在Alsever缓冲液中制备VLP的系列2倍稀释物，向96孔“U形”底微量滴定板的每孔中加入等体积的RBC，在4℃下温育3-6小时。最小HA浓度为仍然凝集RBC的VPL蛋白的最低浓度。
合成产生编码来自JC病毒株系BAE00117、AAT09831和AAQ88264的VP1蛋白的基因，将其克隆入Gateway pDEST8(Invitrogen)穿梭载体以转移入pFASTBAC杆状病毒表达系统，以在SF9细胞中进行杆状病毒表达。从大约100克来自5升培养物的冷冻细胞沉淀纯化VLP。将细胞重悬浮于500ml含有0.1mM CaCl2的PBS中。通过将细胞悬浮液通过微流体微射流机(Microfuidics Microfluidizer)2次来进行破坏。通过以8000X G沉淀15分钟来除去细胞碎片。用PBS/CaCl2将上清液体积调整至720ml，将其加载至5ml 40％蔗糖垫上。在SW28转子中以100,000XG进行5小时将病毒样颗粒沉淀穿过蔗糖垫，进行2次。将VLP沉淀重悬浮于PBS/CaCl2中，然后用0.25％脱氧胆酸盐在37℃下处理1小时，接着加入4M NaCl/0.1mM CaCl2在4℃下进行1小时。通过以8000X G离心15分钟除去沉淀的物质。浓缩所获得的上清液，通过将其通过Pelicon-2500,000MWCO膜(Millipore)进行超滤来交换缓冲液。将浓缩的VLP用于Optiprep(Sigma)的25-40％分级梯度的中央，使其在50.2型转子中以190,000g分带，进行17小时。收集VLP条带，随后浓缩，在超滤搅拌室(Amicon stirred cell)中利用300,000MWCO膜交换缓冲液。利用凝胶电泳和电子显微镜术测定VLP的质量(图6)。利用Micro BCA测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。在哈弗医学院的细胞生物学系进行电子显微镜术。将VLP样本置于碳网上，用水短暂洗涤，用醋酸双氧铀负染，使其干燥。将碳网在G2Spirit BioTWIN TEM上进行观察和照相。
结果：
为了在实验上验证这些置换由VP1衣壳在唾液酸结合中产生的作用，从由几种不同的天然存在的病毒编码的VP1蛋白重组产生病毒样颗粒(VLP)。从由几个不同的天然存在的病毒编码的VP1蛋白重组产生PAML。从病毒VP1序列产生VLP，所述病毒VP1序列编码具有由PAML鉴定的两个阳性选择的最强信号之一的置换，一个在位点269上具有苯丙氨酸(F269)并且另一个在位点55上具有苯丙氨酸(F55)。用作对照的2个不同VP1基因不含有任何鉴定的PML相关突变，一个基因来自健康个体(WT)并且另一个基因来自PML患者(Mad-1)(表7)。
表7.VLP之间的JCV VP1序列的氨基酸变异性
Figure BPA00001444948100771
已显示红细胞(RBC)的病毒性血凝集是多瘤病毒对唾液酸结合的可靠量度[Freund R，Garcea RL，Sahli R，Benjamin TL(1991)Asingle-amino-acid substitution in polyomavirus VP1 correlates withplaque size and hemagglutination behavior.J Virol 65：350-355 and LiuCK，Wei G，Atwood WJ(1998)Infection of glial cells by the humanpolyomavirus JC is mediated by an N-linked glycoprotein containingterminal alpha(2-6)-linked sialic acids.J Virol 72：4643-4649]。在血凝集测定法中测试全部4个VLP。令人惊讶地，F55和F269变体都显示为任一对照VLP的1/8000以下的HA活性(表7A)。具体地，F55变体即使以200μg/ml(最高测试浓度)也彻底不能凝集人O型RBC，并且F269变体显示非常低的HA活性，因为其只在高于25μg/ml的浓度上引起血凝集。同时具有L55和S269的变体(WT和Mad-1)在相应地降至0.375ng/ml和6.25ng/ml的浓度上引起RBC的血凝集。在该实例中，F55突变体与其相对应的野生型变体(WT)具有一个氨基酸的差异。因此血凝集的改变可明确地归因于该氨基酸的取代。除了位点269上的改变外，F269突变变体具有与其相对应的对照变体(Mad-1)不同的两个另外的氨基酸位点。这两个氨基酸的改变不是PML特异性的并且不可能解释血凝集的差异。虽然Mad-1分离株源自PML患者[Padgett BL，Walker DL，ZuRhein GM，Eckroade RJ，Dessel BH(1971)Cultivation of papova-like virus fromhuman brain with progressive multifocal leucoencephalopathy.Lancet 1：1257-1260]，但其不包含与其血凝集RBC的能力充分相关的任何PML特异性突变。该PML分离株中PML生成的突变的缺乏表明VP1突变不是导致PML发展的唯一机制。
表7A.VP1蛋白的残基55和269在由病毒样颗粒(VLP)产生的RBC的血凝集中起着非常重要作用。
  病毒变体   最小HA VLP浓度，ng/ml
  WT1   0.08
  55F   ＞200,000
  WT2(Mad-1)   6.25
  269F   50,000
使用始于200μg/ml的VLP的系列稀释物，如材料和方法中所述进行血凝集。向O型RBC中加入VLP并且在4℃下温育3小时。通过使RBC从悬液沉淀出来形成的圆形沉淀物的缺乏来显现凝集反应。E55是在位点55上具有苯丙氨酸的VP1变体(AAT09831)，F269是在位点269上具有苯丙氨酸的VP1变体(BAE0011)。WT(AAQ88264)和Mad-1(P03089)是在位点55和269上分别具有亮氨酸和丝氨酸的VP1变体。
使用ClustalW比对蛋白质序列，利用它们的指示的位点显示至少一个序列中与其余序列相异的氨基酸。
实施例7：突变型JCV具有削弱的与神经节苷脂类的结合神经节苷脂ELISA：
以1mg/ml在甲醇中制备下列神经节苷脂：缺乏唾液酸基的GM1(人)、单唾液酸GM1(人)、GM2(人)、GM3(牛)、GM4(人)、双唾液酸GD1a(牛)、GD1b(人)、GD2(人)、GD3(牛)、三唾液酸GT1b(牛)。除了购自American RadioChemicals的GM2外，全部神经节苷脂购自Calbiochem。
将神经节苷脂类在甲醇中稀释至0.1mg/ml，然后以0.1ml/孔加入ELISA平板(Corning 9018)；使甲醇蒸发过夜。第二天，用0.25ml/孔含有Ca2+和Mg2+、1％BSA(Fraction V)、0.1％Tween-20的1X PBS封闭平板1小时。随后将平板转移至冰上-所有后续温育在+4℃下进行。
在封闭缓冲液中制备0.03mg/ml的VLP；从平板除去缓冲液，以0.1ml/孔加入VLP。将平板在冰上温育60-90分钟。在封闭缓冲液中制备0.002mg/ml的抗JCV VP1(克隆PAB597)。用0.25ml/孔的封闭缓冲液洗涤平板；以0.1ml/孔加入抗-VP1。将平板在冰上温育45-60分钟。以1：5,000在封闭缓冲液中制备HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch)。洗涤平板；加入0.1ml/孔的HRP-抗小鼠。将平板在冰上温育30分钟。洗涤平板，然后用0.1ml 1-Step Turbo TMB(ThermoScientific Pierce)显色。监控显色，通过加入0.1ml 2N H3PO4终止反应。随后在分光光度计(Molecular Devices)上于450nm处读取平板。
各神经节苷脂具有对照孔(只有HRP-抗小鼠IgG，PAB597和HRP-抗小鼠IgG)。本底对照被指定为单独的HRP-抗小鼠IgG。使用公式(实验-本底)/本底计算每一个实验孔。
评估许多种神经节苷脂类对WT JCV的结合。图7显示WT JCV结合某些聚糖但不结合所有聚糖。所选择的神经节苷脂类的结构示于图8中并且显示它们结合WT JCV的能力。
图9显示F55和F269突变不能结合Neu5Acα(2-3)和α(2-6)聚糖。所选择的神经节苷脂类的结构示于图10中并且显示它们结合突变型JCV的能力。
图11比较JCV的WT与突变型结合所选择的神经节苷脂的能力。
实施例8：突变JCV结合神经胶质细胞系但不结合淋巴细胞VLP染色的流式细胞术分析；
使用下列细胞：SVG-A(来自Walter Atwood的礼物)，来自供体的分离的外周单核细胞。使用Accutase解离粘壁细胞，收集细胞和洗涤细胞。从健康供体抽取静脉血；使用标准方案(包括在Ficoll-HypaquePlus(Amersham Biosciences)上离心)分离PMBC。
在冰上于含有钙和镁、1％牛血清白蛋白(级分V)、2mM叠氮化钠的PBS缓冲液中进行所有染色。
在96V形底孔平板中，在冰上，将细胞(1-5×105个细胞/样本)与在FACS缓冲液中稀释的10μg/ml VLP于0.05ml总体积中一起温育。用0.15ml FACS缓冲液洗涤细胞，然后以2000rpm(～800×g)离心5分钟。通过在0.05ml中用0.002mg/ml的抗JCV VP1(克隆PAB597)染色细胞45-60分钟，然后进行洗涤步骤，用1∶100稀释的Alexa Fluor 488抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)于0.05ml/样本中进行检测，进行另外的30-45分钟来检测VLP结合。洗涤细胞，将其在0.05ml Cytofix/Cytoperm(BD)中固定15-25分钟，洗涤细胞，然后重悬浮于0.2ml FACS缓冲液中。在FACSCalibur上分析样本。
突变型JCV(269F)不结合淋巴细胞。然而，突变型JVC仍然能够结合神经胶质细胞系(图12)。也描述了WT JCV和阴性对照。
实施例9：突变体特异性抗JCV抗体的产生
为了免疫兔以产生抗JCV VP1血清，将0.5mg在PBS缓冲液中以病毒样颗粒(VLP)的形式存在的VP1蛋白皮下注射入兔背上的10个点(0.05mg/点)。在初次免疫后，以2周的间隔进行2次加强，此后收集血清并且测定其的抗VP1活性。
利用竞争性ELISA检测抗突变体JCV抗体：
A：将来自269F-VLP免疫的兔的抗血清或抗WT-MAD1免疫的VLP兔血清与或不与100μg/ml WT-MAD1-VLP一起预温育，随后与用269F-VLP包被的平板一起温育。用过氧化物酶缀合的抗-兔显示结合的抗体。
B：将来自55F-VLP免疫的兔的抗血清或抗WT-免疫的VLP兔血清与或不与100μg/ml WT-VLP一起预温育，随后与用55F-VLP包被的平板一起温育。用过氧化物酶缀合的抗-兔显示结合的抗体。
用F269和F55JCV突变型VP1VLP注射兔，从而导致特异于突变型JCV的抗体产生。竞争性ELISA显示突变体特异性JCV抗体可与WTJCV抗体相区别(图13)。测定设置示例于图14中。抗体结合被捕获在平板上的突变型VLP(F55或F269)。利用非突变型VLP进行竞争以吸附紧靠在分子的“骨架”上所有抗体，从而只留下抗突变表位的抗体(如果这样的抗体存在于样本中的话)结合平板并且对其进行检测。
还比较突变型JCV和WT JCV抗体结合突变型JCV-VLP的能力。用F269和F55突变型JCV多肽包被ELISA平板，向平板中加入WT JCV和突变型JCV抗体(图15和16)。突变型和WT JCV抗体都结合包被的ELISA平板。WT JCV(JCV-471和JCV-MAD1)的添加导致WT JCV抗体的结合消失，然而突变型抗体仍然与ELISA平板结合。此外，JCV病毒的添加导致结合的WT抗体消失，然而突变型抗体仍然与夹板结合。
实施例10：JCV-VP1突变在某些患者中作为病毒免疫逃避的机制
将来自在VP1蛋白中具有269F突变的患者的血清和抗-WT-MAD1-免疫的VLP兔血清(作为阳性对照)与或不与100μg/ml WT-MAD1-VLP一起预温育，随后与用269F-VLP包被的平板一起温育。用过氧化物酶结合缀合的抗-人或兔抗体显示结合的抗体以检测与包被的269F突变型VLP结合的抗体。
图17显示具有F269突变病毒的患者已产生针对WT病毒但不针对F269突变病毒的抗体应答。
图18显示用非突变型VLP免疫的兔(顶部)产生针对可获得突变的位点(在该情况下为S269)的抗体。在该情况下与幻灯片16(上述插图)上的方案类似地(具有几处差异)进行实验，将非突变型VLP而非突变型VLP包被在平板上，并且用突变(F55或F269)蛋白竞争血清中的抗体结合，因此只有针对非突变AA表位的抗体被留下与平板结合。(底部)显示利用健康志愿者样本进行的相同实验。表8中的结果基于利用向数个不同志愿者样本进行的类似实验。表8显示未患有PML的人可具有针对PML突变体的抗体。这显示某些人携带对唾液酸结合位点中的几个残基特异的抗体(例如，患者29具有针对L55和S269的抗体)，而其它人具有仅针对一个位点L55或S269的抗体，并且仍然有其它人不具有针对位点的抗体。根据本发明的方面，不具有针对唾液酸结合位点中的残基抗体或仅针对此类残基之一的抗体的个体可能更易受到JCV逃避突变体的伤害，因为他们具有更少的来自中和抗体的保护作用。
表8
Figure BPA00001444948100821
实施例11：来自进行性多灶性白质脑病(PML)患者的脑脊髓液(CSF)和血浆的JC病毒(JCV)VP1具有参与唾液酸结合的氨基酸残基的特异性突变
如本文中所描述的，PML目前是AIDS-相关死亡的第二大原因。与其它机会致病菌感染不同，其还在开始长期的成功治疗后不久或在所述长期过程中在HAART-治疗的患者中发生。在原发感染后，病原体JCV在尿道中建立持久的良性感染并且从30％的健康人的尿中排泄掉。导致JCV重激活和PML的机制不清楚，但已知主要JCV衣壳蛋白VP1通过与细胞唾液酸残基结合参与细胞进入并且最近，已在PML中报导了VP1氨基酸置换。
从26个患者(20个具有HIV感染)的CSF以及11个成对血浆和6个成对尿样本扩增完整JCV-VP1区域，克隆该区域(每样本2至48个克隆，中值23)，然后测序。也分析来自9个患者的连续CSF(n＝7)或血浆(n＝2)样本。通过实时PCR测量JCV DNA。将3D建模用于将突变定位在VP1结构上。
DNA提取和VP1扩增：
使用QIAamp Blood试剂盒(Qiagen)从200μL CSF、血浆和尿提取DNA并且将其稀释在50μL的终体积中。
利用下列引物通过巢式PCR来扩增完整JCV-VP1区：
外部(2027bp)
VP1-LF  GCAGCCAGCTATGGCTTTAC (SEQ ID NO：55)
VP1-LR  GCTGCCATTCATGAGAGGAT (SEQ ID NO：56)
内部(1233bp)
VP1-SF  CCTCAATGGATGTTGCCTTT (SEQ ID NO：57)
VP1-SR  AAAACCAAAGACCCCT     (SEQ ID NO：58)
PCR反应混合物由5μL 10X PCR缓冲液、各自4mM的dNTP、0.7μM引物VP1-LF和VP1-LR(在第一轮中)以及引物VP1-SF和VP1-SR(在第2轮中)、1.25个单位的Platinum Taq HF(Invitrogen)和1μL提取的DNA于50μL的总体积中组成。循环参数为(对于第一和第二轮)30个循环：在自动化热循环仪(Applied Biosystems)中于94℃下进行20秒，58℃下进行30秒和68℃进行90秒。
在利用外引物进行第1轮扩增后，将2.5μL扩增产物从第一反应混合物转移至第二反应混合物。在利用内引物扩增后，将10μL从第二混合物扩增的产物在含有0.5μg/ml溴乙啶的2％琼脂糖凝胶上电泳。在紫外光照明下给结果照相，当相应于预期的bp长的DNA片段的条带存在时，结果被认为是阳性的。
VP1 PCR克隆：
利用Qiagen纯化试剂盒纯化扩增产物。利用Taq聚合酶将A添加至提纯的PCR产物的末端(A-悬突反应)，然后利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。从包含克隆的VP1PCR产物的集落制备(Qiagen)Mini-prep DNA。
VP1测序：
对于每一个样本，测定2至48个克隆(中值23)的序列。在翻译VP1序列后，通过与一大批来自PML和非PML案例的VP1序列相比较来标记氨基酸突变。只考虑存在于超过一个样本的克隆中的突变。
用于定量JCV-DNA的实时PCR：
如之前所描述的(Bossolasco S，Calori G，Moretti F，Boschini A，Bertelli D，Mena M，Gerevini S，Bestetti A，Pedale R，Sala S，Sala S，Lazzarin A，Cinque P.Prognostic significance of JC virus DNA levels incerebrospinal fluid of patients with HIV-associated progressive multifocalleukoencephalopathy.Clin Infect Dis.2005Mar 1；40(5)：738-44.)，利用实时PCR定量CSF、血浆和尿样本中的JCV DNA。
患者：
基于a)成对的CSF和血浆或尿样本或b)连续CSF样本(全都具有可通过实时PCR检测出的JCV DNA)的可用性选择PML患者。已从于1993至2008年在the Clinic of Infectious Dieaeses，San Raffaele Hospital，Milano跟踪的患者抽取样本。将样本等分试样贮藏在-80℃下直至用于本研究的回顾分析。从来自总共30个PML患者的总共26个CSF、11个血浆和6个尿样本成功地扩增了JCV VP1。
临床样本的分析-研究设计：
1.CSF序列的分析：
检查来自26个患者的CSF序列(表9)并且分析突变的类型和频率以及它们与患者的相关性变量。
2.来自相同患者的成对样本的序列的分析：
检测2个患者的成对CSF/血浆/尿样本(“一式三份”)。检查分别来自6、1和3个患者的CSF/血浆、CSF/尿和血浆/尿对。比较获自一式三份和成对的序列。
3.来自连续样本的序列的分析：
可分别从5和2个患者获得连续CSF或血浆样本。已在临近PML的诊断(基线)和之后的不同时间抽取这些样本。分析在17至477天的时帧内从每一个患者抽取的2至3个样本。这些患者中的5个具有PML的渐进过程。一个患者在开始HAART后经历病毒学应答。一个患者在利用阿糖胞苷治疗后经历临床和病毒学缓解，但在6个月后和在撤消阿糖胞苷后PML复发。
表9.利用JCV VP1分析产生的26个PML患者的特征
＊仅指具有HIV相关PML的患者
临床样本的分析-结果：
1.CSF序列的分析：
VP1 PML特异性突变被定义为通常不存在于无PML患者的尿中的突变。此类突变或缺失不包括确定VP1基因型的位点上的突变-其区别于根据它们的地理分布的VP1序列。
在26个患者中的24个(92％)中的CSF中鉴定了8个不同的PML特异性突变或缺失之一。这些突变包括JCV VP1外环之一中的氨基酸置换(表10)。
在所有情况下，几乎全部来自相同样本的克隆都包含突变或缺失。在5个患者中，在相同的克隆(n＝2)或不同的克隆(n＝3)中鉴定了2个不同的突变或缺失。
表10.PML患者的CSF中的JCV VP1突变
Figure BPA00001444948100861
利用它们的氨基酸序列与SV40的VP1环的相似性确定BC、DE和HI JCVVP1环(Chang D，Liou ZM，Ou WC，Wang KZ，Wang M，Fung CY，Tsai RT.Production of the antigen and the antibody of the JC virusmajor capsid protein VP1.J Virol Methods 1996May；59(1-2)：177-87)，所述环先前利用X射线晶体学(Liddington RC，Yan Y，Moulai J，Sahli R，Benjamin TL，Harrison SC.Structure of simian virus 40 at 3.8-Aresolution.Nature 1991 Nov 28；354(6351)：278-84)来确定。
＊突变/缺失存在于不同克隆中(55F+271H存在于第15和第4克隆中；61L+55缺失存在于第18和4克隆中；267F+61L存在于第15和第4克隆中)
＊＊突变/缺失都存在于各克隆中
在具有BC和HI环的突变的患者中发现比具有DE环的突变或无突变的患者中更高的CSF JCVDNA水平(图19)。在具有HIV相关PML的患者中未观察到突变类型与CD4细胞计数、血浆HIV-1RNA水平或存活时间之间的相关性。
2.来自成对样本的序列的分析：
2个CSF/血浆/尿一式三份的分析在CSF和血浆中显示相同的VP1PML特异性突变，然而PML突变不存在于相应的尿序列中(表11)。类似地，在来自6个具有CSF/血浆对的患者的CSF和血浆序列中发现相同的PML特异性突变(表12)，但仅在1个具有CSF/尿对的患者或3个具有血浆/尿对的患者的CSF或血浆序列中而非尿序列中发现相同的PML特异性突变(表13)。
表11.来自PML患者的成对CSF/血浆/尿样本中的JCV VP1突变
Figure BPA00001444948100871
表12.来自PML患者的成对CSF/血浆样本中的JCV VP1突变
Figure BPA00001444948100872
表13.来自PML患者的成对CSF/尿或血浆/尿样本中的JCV VP1突变
Figure BPA00001444948100882
3.来自连续样本的序列的分析：
连续CSF或血浆样本的分析显示PML特异性突变在患有进行性疾病并且在CSF中具有稳定的或不断增加的JCV DNA的7个患者中持久存在(表14和15)。
在经历病毒学应答的患者中，存在于第一CSF样本中的主要PML突变在第二CSF样本中不再被发现，这显示JCV DNA水平的降低；在该后一种样本中，观察到先前少量代表的突变的出现。
在经历PML复发的患者中，在PML的第一发作的临床和病毒学缓解后数月，两个不同的突变存在于在两次发作期间抽取的CSF样本中。
表14.具有连续CSF样本的患者中的PML突变
Figure BPA00001444948100891
表15.具有连续血浆样本的患者中的PML突变PML
Figure BPA00001444948100901
表14和15，注释：
＊突变/缺失存在于不同克隆(55F+271H于第15和4克隆中；61L+55缺失于第18和4克隆中；267F+61L于第15和4克隆中)
＊＊突变/缺失都存在于各克隆中
JCV-VP1的分子建模：
JCV VP1/四糖复合物的分子建模：
使用MPyV VP1(蛋白质数据库ID：1VPS)的结构作为模板，利用MODELER建立JCV VP1蛋白五聚体单位的同源模型。基于结合至MPyV VP1的NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc的结构建立NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖的模型。在CHARMM中精细地完善JCV VP1/NeuNAc-(α2，3)-Gal-(β1，3)-[(α2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖的模型并且利用PyMOL可视化软件(The PyMOL Molecular Graphics System(2002)DeLano Scientific，Palo Alto，CA，USA.http://www.pymol.org)进行分析。
因此，与野生型病毒(存在于健康人的尿中的)相比较，在来自26个患者的24个患者(92％)中的每一个的几乎所有CSF克隆中鉴定了8个特定的单突变或缺失之一。这些突变和缺失在VP1的3个外环之一中提供了置换或缺失，最频繁地包括残基55(55F，7个患者，27％)和269(269F，6个患者，23％)。成对血浆总是显示相同的突变，但在尿中未鉴定突变。突变在来自7个患有进行性疾病并且在CSF中具有稳定的或不断增加的JCV DNA的患者的连续样本中得到维持。它们在2个患者中丢失：经历PML缓解和复发的1个患者，产生新的突变；和具有不断减少的CSF JCVDNA的1个患者，出现先前少量的不同突变变体。通过3D建模，所有突变残基簇集在VP1上的唾液酸细胞受体结合位点内或紧邻所述位点。
因此，基于该数据，在PML患者中，从CSF和血浆但非尿中发现的JCV具有PML特异性VP1置换。此类置换在疾病进展中得到维持。它们在对于与唾液酸细胞受体结合是至关重要的位点上包含VP1的BC、DE或HI外环。因此，在PML中，来自CSF和血浆但非尿的JCV在对于细胞结合是至关重要的位点上具有VP1置换，该置换在疾病期间得到维持。这些发现支持JCV在从持续位点至脑的转变过程获得适应性改变，最终导致PML的模型。
实施例12：VP1的唾液酸结合口袋中的残基
与建模的含糖唾液酸(如本文的实施例中所描述的)相距12埃以内的残基列于表16中。
表16.
  MET   48
  GLY   49
  ASP   50
  PRO   51
  ASP   52
  GLU   53
  HIS   54
  LEU   55
  ARG   56
  GLY   57
  MET   57
  GLY   58
  PHE   58
  GLN   59
  SER   59
  LYS   60
  PRO   60
  SER   61
  ILE   62
  PRO   63
  SER   63
  ILE   64
  SER   65
  SER   65
  ASP   66
  LEU   66
  THR   67
  THR   67
  GLU   68
  PHE   68
  GLU   69
  GLY   69
  GLY   70
  SER   70
  ASP   71
  GLN   71
  SER   72
  TYR   72
  PRO   73
  TYR   73
  ASN   74
  GLY   74
  LYS   75
  TRP   75
  ASP   76
  SER   76
  ARG   77
  MET   77
  GLY   78
  LEU   78
  ILE   79
  PRO   79
  ASN   80
  LEU   81
  ALA   82
  THR   83
  SER   84
  ASP   85
  THR   86
  GLU   87
  ASP   88
  SER   89
  PRO   90
  GLY   91
  ASN   92
  ASN   93
  THR   94
  LEU   95
  PRO   96
  ASN   120
  VAL   121
  HIS   122
  SER   123
  ASN   124
  GLY   125
  ASP   130
  ASN   131
  GLY   132
  ALA   133
  ALA   134
  ASP   137
  VAL   138
  HIS   139
  GLY   140
  PHE   141
  ASN   142
  LYS   143
  THR   150
  LYS   151
  GLY   152
  ILE   153
  SER   154
  PHE   159
  ASN   160
  TYR   161
  ARG   162
  THR   163
  THR   164
  TYR   165
  PRO   166
  ASP   167
  ASP   180
  GLN   180
  ARG   182
  THR   183
  LYS   184
  TYR   185
  LYS   186
  GLU   187
  GLU   188
  VAL   190
  GLN   206
  MET   262
  PHE   263
  THR   264
  ASN   265
  ARG   266
  SER   267
  GLY   268
  SER   269
  GLN   270
  GLN   271
  TRP   272
  ARG   273
  TRP   288
  ARG   289
  VAL   290
  THR   291
  ARG   292
  ASN   293
  TYR   294
  ASP   295
  VAL   296
  VAL   296
  HIS   297
  HIS   298
  TRP   299
  ARG   300
实施例13：PML患者的CSF和血浆但非尿JCV具有PML相关VP-1突变。
为了研究PML相关突变在PML患者的CSF中是否是特异性选择的，最初分析来自7个患者的成对CSF和尿序列(表17)。在每一个患者中，CSF JCV-VP1具有不存在于尿源性序列中的一个氨基酸置换。CSF和尿序列在其它方面在个体患者中是相同的并且与参照株系(相同病毒亚型)相比较特征在于相同的多态性。PML相关CSF突变涉及密码子55、60、267、269并且也涉及密码子122。可从13个患者获得的血浆VP1序列(表17)在所有案例中与对应的CSF源性序列相同，具有相同的PML相关置换。
表17.源自PML患者的成对尿、CSF和血浆样本的序列中的JCV VP1氨基酸置换
表17.
Figure BPA00001444948100961
Figure BPA00001444948100971
Figure BPA00001444948100981
U，尿；CSF，脑脊液；P，血浆.＊当未鉴定置换时，则列值是指不具有置换的克隆的数目/检查的克隆的数目。
实施例14：PML患者的CSF JCV始终具有位于对于细胞结合是至关重要的位点中的数个突变或缺失之一
为了确定体内VP1 PML相关置换的类型和频率，分析更大组的患者中的CSF源性VP1序列。在40个患者中的37个(90％)中鉴定了一个主要PML相关突变或缺失(表18)。如材料和方法中所述，克隆VP1基因并且测定许多克隆的序列。通过将所述序列与来自匹配的尿样本(当可获得时)的VP1序列和与从非PML个体(n＝460)的尿分离的460个序列(如Genebank中报导的)相比较来鉴定突变。在某些患者中，鉴定了突变H122R。在某些患者中，鉴定了突变283I。在某些患者中，鉴定了突变A2V。在某些患者中，鉴定了缺失50-51。在某些患者中，鉴定了缺失50-51。在某些患者中，鉴定了缺失54-55。在某些患者中，鉴定了缺失123-125。在某些患者中，鉴定了缺失125-134。在某些患者中，鉴定了缺失126-134。
频率最高的改变涉及密码子55和269，各自在25％的患者中被鉴定。除了已报导的置换外，在密码子55、60、61和265、267、269上，新近鉴定了几个其它PML相关置换或缺失，包括非多态性VP1密码子，如通过与来自Genebank的尿源性序列相比较证明的。所有这些新近鉴定的突变也位于至关重要的VP1结合位点(表18)。图20是JCV VP1/NeuNAc-(a2，3)-Gal-(b1，3)-[(a2，6)-NeuNAc]-Glc-NAc四糖复合物的结构模型。(A).显示JCV VP1的5条链的表面。显示了结合核心唾液酸所必需的RG基序。也显示了PML相关突变残基(L55、K60、S265、S269)。还指示了PML相关样本所特有的另外的突变(S61、D66、Q271)和(P51、D52、H122、S123、N124、G125、Q126、A127)。(B).图20A的近视图。经预测等同于JCV VP1的S269的MPyV的V296的位置示于网格中。
表18.PML患者的CSF中JCV VP1PML相关的氨基酸置换和缺失
Figure BPA00001444948100991
Figure BPA00001444948101001
Undet.，未测定；Cons.，共有序列；v，变体
a.可获得的至位点295的序列
实施例15：从不同区室分离的JC病毒之间的关系
为了探究3个(肾、血浆和CSF)中的病毒群体之间的关系，分析由来自3个患者的所有3个区室的单个地测序的克隆代表的VP1序列的群体变异。除假定与PML发展相关的氨基酸改变之外，所有3个区室中的显性VP1基因型总是相同的。所有观察到的序列变异都归因于低频率单核苷酸变体。这表明引发PML的病毒源自肾中预先存在的固有群体。
3个区室中病毒群体之间的关系可通过共有的低频率多态性的程度来表征。分析在两个或更多个克隆中观察到的单核苷酸变体。在所有3个患者中，大部分遗传变异局限于个别区室，因为在单个区室中观察到存在于超过一个序列中的等位基因变体。因此，病毒群体是高度结构化。
在3个患者的2个中，CSF和血浆群体之间共有几个等位基因变体并且在CSF与肾群体或血浆与肾群体之间不共有变体。在这两个患者的每一个中，在来自CSF和血浆的克隆中观察到相同的PML相关突变。这些数据与CSF和血浆群体的单一来源相一致，假定因以前从肾逃逸的事件而产生。在该情景中，在肾外PML相关突变固定后产生的CSF和血浆群体之间共有序列变异(假定相同位点中独立的多个突变是不可能的)。CSF与血浆群体之间共有的VP1序列变异可表示区室之间病毒迁移的存在。其也与逐步感染的情景相一致，其中肾外固有病毒群体首先在一个区室(CSF或血浆)中建立，积累遗传变异，然后感染第二区室。
第三患者提供了不同的区室之间共有的多态性的图。CSF与肾之间共有2个变体，血浆与肾之间共有3个变体并且所有3个区室之间共有1个共体。从CSF分离的所有克隆和从血浆分离的大多数克隆具有相同的PML相关突变(S269F)。然而，从血浆分离的3个克隆具有不同的PML相关突变(S267F)。这些克隆缺乏显性PML相关突变。
虽然不能排除患者3的CSF和血浆的多个连续感染的可能性，但这些观察不一定与在以前从肾逃逸后CSF和肾群体的单一来源的情景矛盾。患者3的数据可能是软选择性清除的实例。与硬选择性清除不同，软选择性清除不彻底消除预先存在的遗传变异。如果有效群体大小与突变率的积(Ne×mu)超过1，那么极可能发生软清除情景。在该情况下，有益突变的多个实例(或几个具有等同或相当的选择优势的有益突变)可能存在于不同的单倍型背景上的原始群体中。在软清除后，所有序列可具有有益突变但群体仍然保持多态性。S269F突变和S267F突变的多个实例可能在逃逸之前存在于肾群体中并且在软清除情景后发生固定，从而导致血浆群体中的S269F和S267F VP1变体与所有3个区室之间共有的变异共存。
实施例16：各种突变与临床结果的相关性
为了评估个别PML相关VP1置换是否可以是临床上显著的，例如根据患者和临床背景被差异选择或与不同疾病结果相关，使它们的存在与许多变量相关。
观察到与具有涉及其它位点的置换(p＝0.013，Mann-Whitney检验)，例如具有位点50-61(p＝0.02)或265-269(p＝0.036)上的置换的病毒(具有不同VP1置换)相比较，不具有VP1置换或具有涉及位点122-134的置换的JC病毒以显著更低的DNA水平存在于在CSF中。
实施例17：PML相关突变减弱VP1使RBC血凝集的能力
为了理解PML相关突变在疾病发病机制中所起的作用，研究此类突变中的一些对病毒受体结合的作用。由于已知JCV结合唾液酸结构(Liu)，所以已将病毒引起表达此类结构的RBC的血凝集的能力广泛用作病毒与其受体相互作用的模型。
从主要JCV衣壳蛋白VP1制备的病毒样颗粒(VLP)已被广泛用作研究多瘤病毒与其细胞受体的相互作用的良好模型。与病毒衣壳类似，来自病毒衣壳结构的VLP如从电子显微术所显示的(数据未显示)。然后，研究从“野生型”或各种“突变型”VP1分子制备的VLP的结合。将经显示在PML过程中被阳性选择的许多PML相关突变作为点突变引入来自单一病毒背景(JCV3型)的VP1分子的骨架上并且比较它们血凝集(例如，结合)红细胞(RBC)的能力。从3型病毒的VP1分子制备的VLP正如对于从1A型(例如，Mad-1)病毒制备的VLP那样可引起RBC血凝集，并且它们以低至760pg/ml的浓度凝集RBC。然而，具有最频繁发生的突变55F、267F和位点269上的突变(F或Y)之一的VLP即使在最高测试浓度100μg/ml上也不引起血凝集，这相应于活性降低至1/100,000以下。对于60E、265D和271H突变型VLP血凝集仍然出现，但仅在相应于活性降低至1/200至1/25,000的非常高的浓度下才发生。只有66H突变型VLP的结合未受到强烈影响并且显示血凝集降低2/3(3000pg/ml作为发生血凝集的最低浓度)。在本实施例中所分析的序列中未观察到66H和271H突变，但基于来自Genebank的序列的分析，这些突变被鉴定为PML相关的。突变对VPL引起血凝集的能力的该作用表明所述突变可通过消除病毒结合细胞受体的能力改变病毒的受体特异性。
实施例18：PML相关突变丧失使自不同血型的RBC血凝集的能力
具有PML相关突变的VLP丧失使来自不同血型的RBC血凝集的能力。为了进行血凝集测定法，将红细胞(RBC)与始于100μg/ml的各种VLP的系列2倍稀释物一起温育。最小HA浓度为仍然凝集RBC的VLP蛋白的最低浓度。通过如先前描述的目测观察检查血凝集。以一式二份进行所有血凝集反应。基于4个不同血型供体A、B、O和AB的血凝集结果计算最小HA浓度的平均值+/-SD。显示100μg/ml的最低血凝集浓度的VLP在测试的最高VLP浓度(例如，100μg/ml)上不引起任何血凝集。
实施例19：PML相关突变改变VP1的神经节苷脂特异性
为了进一步剖析JCV VP1受体特异性，研究不同突变型VLP对不同神经节苷脂类的结合。神经节苷脂类是一组其中将包含一个或多个唾液酸(N-乙酰神经氨酸，NeuNAc)的寡糖链连接至神经酰胺的复合糖鞘脂类，其将结构锚定至细胞膜。在ELISA样形式中测量VLP对此类神经节苷脂的结合，其中神经节苷脂类类似于抗原包被在ELISA平板中，然后加入VLP，利用VP1特异性单克隆抗体检测该结合。通过使用3型“野生型”JCV VLP，观察到对GD1b、GD2和GT1a的最强结合，与通过VLP与不具有任何神经节苷脂的孔的结合产生的本底相比较信号增加超过7-11倍(图21)。VP1的PML特异性突变消除或显著改变病毒衣壳蛋白VP1对唾液酸化神经节脂类的特异性。利用两步法检测VLP与包被在96孔平板上的神经节苷脂类的阵列的结合，所述两步法包括利用VP1特异性鼠抗体和抗鼠IgG HRP标记的抗体检测结合至神经节苷脂的VLP，然后用TMB溶液显色。将VLP与特定神经节苷脂的结合计算为在相同神经节苷脂存在的情况下，利用存在的特定VLP获得的光密度相对于不用VLP仅用抗体获得的光密度的百分比增加，100＊(OD450(+VLP)-OD450(-VLP))/OD450(-VLP)。神经节苷脂的示意性结构经显示揭示了被不同VLP结合的核心结合结构。显示了进行的4个实验的1个代表性实验。该神经节苷脂特异性与先前对于1A型“野生型”病毒Mad-1所描述的相一致。VLP对缺乏唾液酸基的GM1和GD1a的结合要弱得多，但仍然显著高于本底，然而与其它神经节苷脂类的结合相对于无神经糖苷脂本底可忽略不计。基于结合模式，被野生型病毒结合的主要“核”结构似乎由四糖GalNAc(β1-4)[Neu5Ac(α2-8)-Neu5Ac(α2-3)]Gal(β1-4)Glc结构(Neu5Ac(β2-8)-Neu5Ac(α2-3)的二唾液酸基序对于结合是至关重要的)组成。
然而，所有突变型VLP的结合与“野生型”分子显著不同。具体地，如在图21中看到的，VLP突变体55F、60E、267F、269F和269Y完全丧失与所有唾液酸化神经节苷脂类的结合，然而仍然显示未改变的与缺乏唾液酸基的GM1结构(例如，无唾液酸基-GM1)的结合。其它突变例如66H、265H和271H仍然显示比原始非突变型VLP分子范围宽广得多的神经节苷脂结合。
实施例20：VLP与不同细胞靶的结合
来自血凝集和直接神经糖苷脂结合测定法的结果共同表明PML相关突变改变受体特异性，特别是病毒结合唾液酸化寡糖结构的能力。因此，接下来研究特定受体结合的这些突变赋予的改变如何影响JCV结合其假设的靶细胞的能力。测量上述野生型和突变型VLP与据报导对于病毒细胞周期非常重要的3个主要细胞类型：肾上皮细胞、淋巴细胞和CNS细胞的结合。选择原代人肾近端小管上皮细胞(HRPTEC)作为来自非突变病毒的病毒无症状维持的位点的细胞。也选择原代人B淋巴细胞(因为有人提出该细胞类型对于病毒从周围扩散至CNS是至关重要的)以及其它淋巴样细胞例如原代T淋巴细胞和淋巴细胞系Jurkat。虽然还未明确地证明淋巴样细胞的生产性感染，但已显示淋巴细胞通过它们的唾液酸结构结合JCV(Atwood等人)，从而可潜在体内携带该病毒。原代人胎儿星形细胞和人神经胶质细胞系SVG-A也被用作在PML期间用于CNS感染的模型细胞类型。星形细胞的感染已在PML患者中得以充分确定并且这两种神经胶质细胞类型可被JCV体外感染。
VP1的PML生成的突变体丧失对肾和血细胞的结合能力但结合神经胶质细胞。首先将神经胶质细胞系SVG-A(A)、原代人星形细胞(B)、人脑微血管内皮细胞(C)、肾小管上皮细胞(D)或外周血单核细胞(E和F)细胞与不同VLP(如在x轴上指示的)一起温育，并且再与抗VP1抗体一起温育，然后用荧光标记的抗体染色。在用对人CD3和CD20标记特异的抗体共染色PBMC并且对相应群体进行门控后评估VLP与T-(E)和B-淋巴细胞(E)的结合。将在VLP存在的情况下用抗VP1抗体染色的细胞的平均荧光强度(MFI)相对于在VLP不存在的情况下只用检测抗体染色的细胞的本底MFI的比率对每一种VLP作图。基于几个独立实验(N示于图中)的结果计算平均MFI比率+/SD。从“野生型”VP1制备的VLP以超过本底染色1倍的MFI强烈地结合所有上述细胞类型。然而，突变型VLP的结合依赖于细胞类型和突变氨基酸的位点。具体地，频率最高的PML相关突变55F、267F、269F和269Y消除VLP与肾小管上皮细胞和所有淋巴细胞的结合，但不消除与原代星形细胞或神经胶质细胞系SVG-A的结合。两个CNS细胞类型仍然强烈地结合具有此类突变(除了结合SVG-A细胞但不结合原代星形细胞的55F外)的VLP。具有60E、66H和271H的VLP仍然结合所有细胞类型(包括肾上皮细胞和淋巴细胞)，虽然271H的结合被强烈减弱。
实施例21：具有PML相关突变的VLP以不依赖于唾液酸的方式结合神经胶质细胞
由于先前已显示病毒与细胞的结合是唾液酸依赖性的(例如，Atwood等人)，但所述数据显示大多数PML相关突变消除VLP与含神经节苷脂的唾液酸的结合，接下来测试突变型VLP与细胞的结合是否仍然是唾液依赖性的。为了进行该测试，利用神经氨酸酶处理SVG-A或Jurkat细胞以从细胞表面除去唾液酸。用对神经氨酸类的各种构象特异的外源凝集素类(例如，西泽接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin)(SNA)和怀槐凝集素(Maackia amurensis lectin)(MAA))染色细胞显示神经氨酸酶在唾液酸去除中的处理功效。VP1的PML生成的突变体与神经胶质细胞的结合是不依赖于唾液酸的。首先用α2-3，6神经氨酸酶在37℃下预处理神经胶质细胞系SVG-A细胞或淋巴样细胞系Jurkat进行60分钟或模拟处理所述细胞，然后在4℃与指定的VLP一起温育，用本文中所述的检测抗体进行染色。
3型野生型VLP与SVG-A和Jurkat细胞的结合是唾液酸依赖性的，从而确认先前对于Mad-1病毒(例如，1A型野生型)所显示的内容。然而，所有测试的突变型VLP(除K60E突变型VLP外)与SVG-A细胞的结合不受神经氨酸酶处理影响，这表明此类突变体与细胞的结合是不依赖于唾液酸的。有趣地，仍然能够结合Jurkat细胞的那些突变体(例如，K60E、D66H、N265D和Q271H)以唾液酸依赖性的方式结合，如通过减弱的与用神经氨酸酶处理的Jurkat细胞的结合所证明的。
如可从概括表19中看到的，VLP与Jurkat细胞的结合似乎在很大程度上是唾液酸介导的，这样未显示与唾液酸化神经节苷脂类的任何结合的突变型VLP不结合Jurkat细胞并且显示与唾液酸化神经节苷脂类结合的突变型VLP也以唾液酸依赖性的方式结合Jurkat细胞。对于该观察的一个值得注意的例外是N265D突变体，其基于与神经节苷脂的直接结合似乎已获得非常广的唾液结合，但仍然失去其与Jurkat细胞的结合。基于上述结果，VLP结合结果似乎和VLP与RBC的结合一致，如从血凝集结果判断的。
概述地说，PML相关突变似乎极大地消除了病毒与许多不同周围细胞类型(包括RBC、肾小管上皮细胞和淋巴样细胞)的唾液酸依赖性结合。突变病毒与CNS特异性神经胶质细胞的结合似乎未受到大影响并且是不依赖于唾液的。
表19.各种测定之间的VLP结合的相关性
Figure BPA00001444948101061
将下列方法和材料与实施例13-21结合使用：
患者和样本
本研究由机构伦理委员会批准。为了体内研究PML相关突变的存在和进展，最初从于1992年至2009年之间在the Department of InfectiousDiseases of San Raffaele Hospital跟踪的一大组群PML患者中选择40个患者，成对CSF、血浆或尿样本可从所述患者获得并且包含JCV DNA，如通过实时PCR(Bossolasco)确定的。最终从这些患者中的14个患者的至少两种不同类型的样本扩增VP1。
随后选择43个另外的PML患者(只有CDF是可获得的)并且通过实时PCR在CSF中检测到JCV DNA。从这些患者中的28个患者成功地扩增了JCV VP1。因此，可研究14个患者的成对样本和总共40个患者的CSF源性序列。
JCV VP1 PCR
DNA提取和VP1扩增
使用QIAamp Blood试剂盒(Qiagen)从200μL CSF、血浆或尿提取DNA，并且稀释在50μL的终体积中。使用侧翼连接完整VP1基因(完全VP1PCR)的引物扩增或，当利用该方法的扩增不成功时，利用分别扩增更短的VP1区域(短片段VP1PCR)的半巢式PCR测定法扩增VP1。
完全VP1PCR由使用外引物VP1-LF和VP1-LR(扩增2027bp片段)和内引物VP1-SF和d VP1-SR(扩增1233bp长的片段)的巢式测定法组成。PCR反应混合物由5μL10XPCR缓冲液、各自4mM的dNTP、0.7μM引物VP1-LF和VP1-LR(在第一轮中)以及引物VP1-SF和VP1-SR(在第二轮中)、1.25个单位的Platinum Taq HF(Invitrogen)和1μL提取的DNA(第一轮)或2.5μl的扩增产物(第二轮)于50μL的总体积中组成。循环参数为(对于第一和第二轮)30个循环：在自动化热循环仪(AppliedBiosystems)中，于94℃下进行20秒，58℃下进行30秒和在68℃下进行90秒。
短片段PCR由在第一轮中使用引物VP1-1和VP1-4a(扩增797bp片段)的半巢式PCR，然后2个利用引物VP1-1和VP1-2a(扩增481bp长的片段)或利用引物VP1-1.5和VP1-4a(扩增490bp长的片段)的半巢式测定法组成(Zheng)(表20)。PCR反应混合物由2.5μL 10XPCR缓冲液、各自200μM的dNTP、1.5mM MgCl2、0.5μM引物和1.25个单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)组成。在第一轮中，将4μL提取的DNA加入25μL的总体积，并且循环参数为20个循环：在自动化热循环仪(Applied Biosystems)中，于94℃下进行20秒，55℃下进行30秒和在68℃下进行90秒。利用ExoSAP-IT PCR Clean-up试剂盒纯化该第一步PCR产物，所述方案由单个移液步骤(酶混合物添加)、于37℃下温育30分钟，然后在80℃下使酶失活(再进行15分钟)组成。在半巢式PCR的第二轮中，将4μL纯化的PCR产物加入25μL的总体积中，循环参数为40个循环：在自动化热循环仪(Applied Biosystems)中，于94℃下进行20秒，62℃下进行30秒和在68℃下进行90秒。
对于两个测定，在利用内引物扩增后，将10μL来自第二混合物的扩增产物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外光照明下给结果照相，并且当相应于预期的bp长的DNA片段的条带存在时，结果被认为是阳性的。
表20.用于JCV-VP1的全长巢式PCR和短片段半巢式PCR的引物的核苷酸序列
＊根据Mad-1株系(ref)
VP1 PCR克隆和测序
利用Qiagen纯化试剂盒纯化扩增产物。利用Taq聚合酶将A添加至提纯的PCR产物的末端(A-悬突反应)，然后利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。从包含克隆的VP1 PCR产物的集落制备(Qiagen)Mini-prep DNA。对于每一个样本，测定2至48个克隆(中值23)的序列。在翻译VP1序列后，通过与一大批来自PML和非PML案例的VP1序列相比较来标记氨基酸突变。只考虑存在于超过一个样本的克隆中的突变。
用于JCV-DNA的定量的实时PCR
如先前所描述的(Bossolasco S.等人2005)，利用实时PCR定量CSF、血浆和尿样本中的JCV DNA。
血凝集测定法
洗涤O+型供体的红细胞(RBC)2次，以约0.5％的终浓度悬浮于Alsever缓冲液(20mM柠檬酸钠，72mM NaCl，100mM葡萄糖，用醋酸调整的pH 6.5)中。在Alsever缓冲液中制备始于100g/ml的VLP的系列2倍稀释物，向96孔“U形”底微量滴定板的各孔中加入等体积的RBC，在4℃下温育3-6小时(进行24个2倍稀释物)。最小HA浓度为仍然凝集RBC的VPL蛋白的最低浓度。
神经节苷脂ELISA
将特定的神经节苷脂类(重悬浮于甲醇)包被在微量滴定板(10μg)上过夜。封闭平板(1％BSA(Fraction V)，0.1％Tween-20，含有Ca++、Mg++的PBS)。在阻断缓冲液中制备30μg/ml的VLP，加入VLP(100μL/孔)。所有温育在冰上进行。90分钟后，用封闭缓冲液洗涤平板。利用两步法检测VLP结合，所述两步法包括利用抗-VP1(PAB597，2μg/ml)和HRP-抗-mIgG(1∶100)的结合。洗涤平板，然后用TMB Turbo ELISA溶液显色。用酸终止反应，在分光光度计上于450nm处读取平板。
VLP与细胞结合的流式细胞术分析
解离和收集细胞(SVG-A、Jurkat、人星形细胞、人肾近端小管上皮细胞)。首先将样本(1-5×105个细胞)与FACS缓冲液(1％BSA[级分V]，2mM叠氮化钠，含有Ca++、Mg++的PBS)中的VLP(10-30μg/ml)一起于50μL的体积中在冰上温育60-90分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，将其与抗-VP1(PAB5972μg/ml)一起再温育60分钟，然后与AlexaFluor488-抗-mIgG(1∶100)一起再温育另外的30-45分钟。洗涤细胞，将其在Cytofix/Cytoperm中固定20分钟，然后进行最终的洗涤，重悬浮于FACS缓冲液中。在BD FACSCalibur上分析细胞。必要时，使用适当的对照，用其它抗体(同种型对照、GM1、缺乏唾液酸基的GM1、GD1a、GT1b)和外源凝集素(花生凝集素(PNA)、西泽接骨木凝集素(SNA)、怀槐凝集素II(Mal II))染色。在某些情况下，用α2-3神经氨酸酶、α2-3，6神经氨酸酶或PNGaseF预处理细胞以改变它们的细胞表面糖结构。
上述书面说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。本发明不限于由提供的实施例确定的范围，因为所述实施例旨在作为本发明的一个方面的单个举例说明，并且其它功能上等同的实施方案在本发明的范围内。除了本文中显示和描述的那些变更之外，本发明的各种变更对于本领域技术人员来说是显而易见的并且落入所述权利要求的范围内。本发明的有利方面和目的不一定由本发明的各实施方案包括。
整个本申请中引用的所有参考资料、专利和公布的专利申请的内容通过引用整体并入本文。
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Claims (22)

1.一种方法，包括：
检查来自受试者的生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记，所述衣壳蛋白包含氨基酸残基122的置换，和
其中如果所述样本包含至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
2.权利要求1的方法，还包括检查所述生物样本的变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记，所述衣壳蛋白包含氨基酸残基2和66的至少一个的置换。
3.权利要求2的方法，其中使用能够检测每一个变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记的测定法检查样本，所述衣壳蛋白具有氨基酸残基2、66和122的至少一个的置换，并且其中如果所述样本包含所述变体JCVVP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
4.任何前述权利要求的方法，还包括检查所述生物样本的变体JCVVP1衣壳蛋白的至少一个标记，所述变体JCV VP1衣壳蛋白包含氨基酸片段50-51、54-55和123-125的一个或多个的缺失。
5.权利要求4的方法，其中使用能够检测每一个变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记的测定法检查样本，所述衣壳蛋白具有氨基酸片段50-51、54-55和123-125的至少一个的缺失，并且其中如果所述样本包含所述变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
6.任何前述权利要求的方法，还包括检查所述生物样本的疑似具有低唾液酸结合的变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记。
7.任何前述权利要求的方法，还包括检查所述生物样本的变体JCVVP1衣壳蛋白的至少一个标记，所述变体JCV VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基55、60、265、267和269的至少一个的置换。
8.权利要求7的方法，其中使用能够检测每一个变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记的测定法检查样本，所述衣壳蛋白具有氨基酸残基55、60、265、267和269的至少一个的置换，并且其中如果所述样本包含所述变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个的至少一个标记，那么所述受试者被确定为具有增加的对PML的易感性。
9.任何前述权利要求的方法，其中所述生物样本是血液样本。
10.任何前述权利要求的方法，其中所述生物样本是CSF样本。
11.任何前述权利要求的方法，其中所述生物样本是尿样本。
12.任何前述权利要求的方法，其中已知所述受试者先前已被野生型JCV感染。
13.权利要求12的方法，其中每年检查来自受试者的新生物样本的至少一个变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记至少2次。
14.任何前述权利要求的方法，其中变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记的检测用于将所述受试者鉴定为不适合于免疫抑制治疗。
15.任何前述权利要求的方法，其中变体JCV VP1衣壳蛋白的至少一个标记的检测用于为所述受试者推荐免疫抑制治疗的改进。
16.任何前述权利要求的方法，其中变体JCV VP1衣壳蛋白的标记的不存在用于将受试者鉴定为适合于进行免疫抑制治疗。
17.任何前述权利要求的方法，其中变体JCV VP1衣壳蛋白的标记的不存在用于将受试者鉴定为适合于进行连续免疫抑制治疗。
18.任何前述权利要求的方法，其中检查所述生物样本的对变体JCVVP1衣壳蛋白特异的抗体的存在。
19.任何前述权利要求的方法，其中检查所述生物样本的变体JCVVP1衣壳蛋白的存在。
20.任何前述权利要求的方法，其中检查所述生物样本的变体JCVVP1衣壳蛋白的存在。
21.任何前述权利要求的方法，其中检查所述生物样本的编码变体JCV VP1衣壳蛋白的核酸序列的存在。
22.权利要求19或20的方法，其中使用基于ELISA的分析检查所述生物样本。
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